Name: Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Découvrez l'activation des cellules T CD4 naïves et leur différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse chez la souris. Cette méthode permet d'étudier les réponses immunitaires in vivo.

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Nous remercions le Dr Simon Bartlett pour l’édition anglaise. Cette étude a été financée par des subventions de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (IP14/00526 ; PI17/01395 ; CP11/00145 ; CPII16/00022), le programme de Miguel Servet et la Fundación Ramon Areces ; avec un cofinancement de l’Europeo de Fondo de Desarrollo Regional (FEDER). Le CNIC est pris en charge par le ministère de l’économie, industrie et compétitivité (MEIC) et la Fondation CNIC Pro et est un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF est fondée par la Fundación Ramon Areces et CNIC, VZG par ISCIII, BHF par Instituto de Investigación Sanitaria hôpital 12 de Octubre (imas12) et JMG-G ISCIII Miguel Servet programme et imas12.

Des procédures expérimentales ont été approuvées par la Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) et la communauté autonome de Madrid, conformément aux directives européennes et espagnoles. Les souris ont été élevés dans des conditions (SPF) libres de pathogènes spécifiques et ont été euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone (CO2).
1. isolement des cellules de moelle osseuse de souris de Tibias et fémurs
Remarque : La souche de souris C57BL/6 congéniques porte le marqueur de leucocyte différentiel Ptprcune, généralement reconnu comme CD45.1 ou Ly5.1, alors que les souches de C57BL sauvage porteuses de l’allèle Ptprcb , connu comme CD45.2 ou Ly5.2. On peuvent distinguer les variantes CD45.1 et CD45.2 par cytométrie en flux, en utilisant des anticorps. Souris CD45.1, CD45.2 et CD45.1/CD45.2 peuvent être utilisés comme sources de cellules ou comme bénéficiaires pour transfert adoptif, permettant le suivi des populations cellulaires distincts par cytométrie en flux. Servir de préférence l’âge- et même sexe mâles ou femelles souris au-dessous de 12 semaines d’âge.
<ol><li>
Préparation des fémurs et Tibias
	<ol>
<li>Euthanasier la souris en utilisant le protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins aux animaux.</li>
		<li>Désinfecter les membres postérieurs en vaporisant sur la surface des animale avec l’éthanol à 70 %.</li>
		<li>Utiliser des scalpels, pinces et ciseaux stériles. Avec un scalpel, faire une incision dans la peau et retirer la peau de la partie distale de la souris, y compris la peau recouvrant l’extrémité postérieure. Peler la peau autour du muscle du mollet inférieure et enlever la peau des pieds entièrement (Figure 2 a, 2 b).</li>
		<li>Séparer le muscle quadriceps fémoral à l’aide d’un scalpel. Équipe l’articulation de la hanche sans casser la tête du fémur. Retirez les muscles du tibia à l’aide d’un scalpel (Figure 2, 2D). Séparer le fémur du tibia sans casser les extrémités des os.</li>
		<li>Garder les os dans une boîte de Pétri contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 glacée 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolement de cellules Remarque : Toutes les étapes subséquentes doivent être exécutés sous un capot de la culture et avec du matériel stérile pour éviter toute contamination.<ol>
<li>Dans une boîte de Petri stérile, découpez soigneusement les extrémités proximales et distales de chaque os avec un scalpel.</li>
		<li>Rincer les os à plusieurs reprises avec un volume total de 10 mL de chaleureux milieu RPMI complet (RPMI + 10 % FBS, 2 mM EDTA, 1 % pénicilline/streptomycine, 20 mM HEPES, 55 µM 2-mercaptoéthanol, pyruvate de sodium 1 mM et 2 mM de L-glutamine). Rincer les os des deux extrémités à l’aide d’une aiguille 25 G attachée à une seringue de 1 mL.</li>
		<li>Transférer l’effluate dans un tube conique de 50 mL, équipé d’un filtre web en nylon 70 µm. Soigneusement déloger les conglomérats de débris et de la cellule par doux en remuant et pipetage.</li>
		<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 10 min à température ambiante (RT).</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon de lyse de rouge-sang-cellule froide (0,15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0,1 mM EDTA, pH ajusté à 7,2 avec 1 N HCl, 0,4 µm stérile filtrée et stockés à 4 ° C). Maintenir sur la glace pendant 5 min avec le manuel secouant.</li>
		<li>Ajouter 10 mL de tampon de froid (1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 2 mM EDTA + 2 % d’albumine sérique bovine (BSA)) pour inactiver et lavent le tampon de lyse des globules rouges.</li>
		<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
		<li>Laver les cellules avec 25 mL de milieu RPMI complet et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu RPMI complet. Mélanger 50 µL de la suspension cellulaire de 1:1 avec le bleu trypan. Déterminer le nombre de cellules dans une chambre de comptage au microscope. Calculer le nombre de cellules à l’aide de la formule : cellules/mL = [(cellule non teinté comte/4) x 2 x 10 000]12. Remarque : Cette méthode rendements 40 x 106 à 60 x 106 OS de cellules de la moelle par 8 non infectés à 12 souris de C57BL/6 semaines.</li>
		<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DC différenciation, de Maturation et de chargement de l’antigène
<ol><li>
Cellule de BM récolte
	<ol>
<li>Amorcer la culture complète sur 6 puits ultra-low-attachment marbres à 106 cellules / mL de milieu, généralement en 5 mL par puits. Macrophages différenciés seront fixe sur la plaque de culture. Après 12 h, transférer le surnageant, qui contient principalement des monocytes, pour nettoyer les plaques 6 puits, jeter les vieilles plaques 6 puits avec les macrophages collés.</li>
		<li>Afin de promouvoir la différenciation cellulaire, de la culture les cellules non adhérentes à 5 x 105 cellules / mL en général de 5 mL par puits du milieu RPMI complet contenant 20 ng/mL obtenues dans le commerce recombinante murine GM-CSF à 37 ° C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2) et observer tous les jours.</li>
		<li>Tous les 3 jours, faire tourner les cellules suspendues et recueillir les cellules adhérentes avec 5 mM EDTA dans du PBS et tournez en bas. Mélanger et remettre en suspension à 5 x 105 cellules/mL dans un milieu frais contenant 20 ng/mL rm-GM-CSF.</li>
		<li>Le jour 8, prélever des cellules adhérentes et détachés comme ci-dessus et remettre en suspension à 5 x 105 cellules/mL en moyenne contenant 20 ng/mL GM-CSF et 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) pendant 24 h dans une culture de tissus non traitées boîte de Petri stérile pour induire la haute MHC-II , Expression CD80 et CD86.</li>
		<li>Différenciation de cocher DC par cytométrie en flux comme indiqué dans l’étape 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Différenciation de cytométrie de flux et de l’analyse de la Maturation.
	<ol>
<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter cette étape deux fois.</li>
		<li>Récepteurs Fc de bloc en incubant le culot resuspendues dans souris Fc bloqueur des récepteurs (purifiée anti IgG CD16/CD322 b anticorps de souris) pendant 15 min à 4 ° C selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
		<li>Pour chaque sonde, remettre en suspension les cellules 250 000 à 300 µL de tampon de cytométrie de flux (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) à 4 ° C.</li>
		<li>Transférer 30 µL de solution de cellules / puits d’une plaque à 96 puits.</li>
		<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
		<li>Jeter le surnageant et ajouter 30 µL de contenant des anticorps tampon pour chaque bien suivant les indications du fabricant. Incuber les cellules avec des anticorps pendant 20 min à 4 ° C. Remarque : Généralement employées des marqueurs pour les contrôleurs de domaine, les monocytes et les macrophages sont CD11b CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 et CD86 (Figure 3).</li>
		<li>Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 200 µL / puits de tampon de cytométrie en flux froid contenant un marqueur pour exclure les cellules mortes (p. ex., l’iodure de propidium, 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou un colorant réactif amine ) de concentration recommandée par le fabricant13.</li>
		<li>Contrôler la différenciation cellulaire en transférant les échantillons aux tubes de cytométrie en flux et en effectuant l’analyse de cytométrie de flux à l’exclusion des cellules mortes aux jours 0, 3, 6 et 9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chargement de l’antigène de DC.
	<ol>
<li>Jour 8, centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les pellets dans 200 µL de milieu (RPMI + 10 % FBS sans antibiotiques). Répéter cette étape deux fois.</li>
		<li>Incuber les contrôleurs de domaine avec 10 µg/mL OVAp (323-339 ; ISQAVHAAHAEINEAGR) par 1 x 107 DCs dans 1 mL de milieu (IPMB + 1 % FBS) dans un tube en plastique pendant au moins 30 min à 37 ° C. Utiliser DCs OVAp-chargé non comme une condition de contrôle négatif.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les pellets dans 200 µL de milieu RPMI complet. Répéter cette étape deux fois.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les pellets dans 200 µL de milieu (RPMI + 10 % FBS) à 2 x 106 cellules/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. isolement des cellules T CD4 naïves de OTII souris
Remarque : Cette méthode donne environ 100 x 106 spleenocytes par 8 non infectés à 12 souris de C57BL/6 semaines. Les mâles et les femelles peuvent être utilisées. Lymphocytes t CD4 peut être isolés dans la rate ou les ganglions lymphatiques ; Lymphocytes t CD4 compte pour environ 25 % et 50 % des cellules de ces organes, respectivement. Effectuez les opérations suivantes dans des conditions stériles.
<ol><li>Isoler inguinales, axillaires, brachiales, du col utérin et mésentériques ganglions lymphatiques et la rate des souris transgéniques OTII (Figure 4) et les transférer sur un plat de Pétri contenant 10 mL de milieu RPMI complet de plastique.</li>
	<li>Rincer la crépine de la cellule avec 2 mL de milieu RPMI complet et retirez-la du tube de 50 mL. Transfert de ganglions lymphatiques et la rate à une crépine de cellule de 70 µm placée dans un tube de 50 mL. Homogénéiser à l’aide d’un piston de la seringue (Figure 5) et ajouter moyen à 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot dans 15 mL de milieu RPMI complet. Répéter cette étape deux fois.</li>
	<li>Pour suspension de cellules de rate, resuspendre le culot cellulaire et lyser les globules rouges, comme il est indiqué dans l’étape 1.2.5.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Laver les cellules avec 25 mL de milieu RPMI complet et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu. Mélanger 50 µL de la suspension cellulaire de 1:1 avec le bleu Trypan. Déterminer le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage au microscope. Calculer le nombre de cellules à l’aide de la formule : cellules/mL = [(cellule non teinté comte/4) x 2 x 10 000]12.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.2.2.</li>
	<li>Suivant les instructions du fabricant, incuber les cellules avec des dilutions de 1:800 d’anticorps biotinylé CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 et DX5 pendant 30 minutes sur la glace pour plus tard une sélection négative des cellules T CD4.</li>
	<li>Suivant les instructions du fabricant et selon le nombre de cellules et la capacité des perles, calculer la quantité nécessaire de microbilles magnétiques-streptavidine et isoler les cellules CD4 T à l’aide d’un séparateur de cellule magnétique et le cas échéant colonnes de séparation.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu RPMI complet et les garder sur la glace lors du décompte des cellules vivantes, comme indiqué au point 3.7.</li>
	<li>Extrait 2 x 105 cellules et vérifier la pureté des cellules recueillies à l’aide d’anticorps fluorescents dans un cytomètre en flux à l’aide de fabricant-recommandant des dilutions d’anticorps anti-CD3, CD4 et CD8 de B220.</li>
	<li>Pour souiller les cellules T CD4/OTII naïf isolé, resuspendre 106 cellules de 500 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA). Préparer 500 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) contenant double la concentration finale de fabricant-recommandé de colorant traceur cellule vitale. Mélanger les deux solutions en ajoutant lentement la solution de traceur cellulaire à la suspension cellulaire. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C.</li>
	<li>Laver les cellules avec 5 mL de milieu RPMI complet et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter cette étape deux fois. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu RPMI complet à 1 x 107cellules/mL.</li>
</ol>4. in Vivo de l’Activation, la prolifération et dosage de différenciation Th1
Remarque : La cellule vitale traceur colorant carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) et autres colorants succinimidyl ester-basée, qui sont excités et émettent de fluorescence à différentes longueurs d’onde, sont largement utilisés pour évaluer la prolifération des lymphocytes par flux cytométrie en flux, en raison de leur intensité de fluorescence élevée, longue durée de vie, faible variabilité et une toxicité faible14.
<ol><li>Moutschen cellules de transfert par voie intraveineuse (i.v.) 1 x 106 cellules vitales vivantes traceur naïf de colorant coloré T CD4/OTII dans 100 µL de PBS par souris. Les cellules T marquées peuvent être transférées Moutschen par veine caudale ou rétro-orbitaire injection15; dans les deux cas, les cellules seront abrite les organes lymphoïdes (Figure 6 a).</li>
	<li>Contester les souris destinataires un jour plus tard en transférant Moutschen 100 000 DCs de chargement OVAp LPS-mûri par voie sous-cutanée (s.c.) dans les pattes (Figure 6 b).</li>
	<li>Récolter poplitée les ganglions lymphatiques des souris bénéficiaires et les mélanger jusqu'à l’obtention de suspensions de cellules du même suivant les mêmes étapes comme décrits aux points 3.1 et 3.2. Cela après l’immunisation de mesurer l’activation des lymphocytes T CD4/OTII jour 2 et le jour 5 pour mesurer la prolifération et la différenciation Th1.</li>
	<li>Pour analyser l’activation des cellules T au jour 2, détachant les cellules avec des anticorps fluorescents contre CD4 et CD25 CD69 (éventuellement CD45.1 et CD45.2) et détermine le pourcentage de C69+CD25+ T cells dans la population CD4. Analyse par cytométrie en flux (Figure 7).</li>
	<li>Pour contrôler la prolifération des cellules T au jour 5, tacher les cellules en utilisant des anticorps fluorescents appropriés contre CD4 et éventuellement les CD45.1 et les CD45.2. Analyser la décroissance du signal colorant traceur cellule vitale dans la population CD4 par cytométrie en flux (Figure 8). Plusieurs paramètres peuvent être déterminées dans ces études, telles que le nombre de divisions cellulaires subi par les cellules marquées avec le colorant traceur de cellule vitale, le pourcentage de cellules en Division à chaque pic de fluorescence et le pourcentage de cellules en division dans la cellule opération population.</li>
	<li>Pour déterminer la différenciation Th1 au jour 5, 400 000 cellules de plaque / puits d’une plaque 96 puits dans 200 µL de milieu RPMI complet contenant 1 µM ionomycine et 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 acétate (PMA) pendant 6 h à 37 ° C dans l’incubateur. Pour les dernier 4 h, ajouter 3 à 10 µg/mL bréfeldine A pour bloquer la sécrétion de cytokines au milieu.</li>
	<li>Centrifuger les plaques pendant 5 min à 250 x g à 4 ° C. Jeter le surnageant par retournement de la plaque à 96 puits.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.2.2.</li>
	<li>Tacher les membranes cellulaires en incubant pendant 15 min à 4 ° C pour 30 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) contenant des anticorps de CD4 et éventuellement de CD45.1 et CD45.2 à des dilutions de fabricant-recommandé. Laver les cellules en ajoutant 150 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) et centrifuger les plaques pendant 5 min à 250 x g à 4 ° C et jeter le surnageant.</li>
	<li>Fixer les cellules en ajoutant 100 µL de saccharose paraformaldehyde/1% 2 % pendant 20 min à RT. centrifuger les plaques pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant.</li>
	<li>Permeabilize des cellules en ajoutant 50 µL de tampon de perméabilisation intracellulaire (1 x PBS + 0,1 % de BSA, 0,01 M HEPES, 0,3 % de saponines) et incuber 30 min à 4 ° C.</li>
	<li>Ajouter 150 µL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 1 000 x g à RT. jeter le surnageant.</li>
	<li>Détachant des cytokines intracellulaires en ajoutant 30 µL du fluorophore conjugué anti anticorps IFNγ dans un tampon (PBS + 0,1 % de saponines) et incuber 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Laver les cellules en ajoutant 150 µL de tampon (PBS + 0,1 % de saponines). Centrifuger les plaques pendant 5 min à 1 000 x g à RT et éliminer le surnageant. Répéter cette étape deux fois.</li>
	<li>Analyser les populations de cellules par cytométrie en flux (Figure 8).</li>
</ol>

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<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Warth, S. C., Heissmeyer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+transduction+of+naive+CD4+T+cells+to+study+Treg+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+the+mouse+popliteal+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Ce protocole permet la caractérisation de la capacité des dérivés BM DCs pour moduler l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules T CD4 naïves. Par ailleurs, également utilisable pour évaluer la sensibilité des cellules T CD4 à modulation par DCs dérivé de BM. Avec ce protocole, les changements dans ces événements peuvent être mesurées en vivo.
Selon l’hypothèse examinée, plusieurs combinaisons de lymphocytes T et les contrôleurs de domaine peuvent être utilisés....

Lymphocytes t CD4 et antigène présentant des cellules (CPA) tels que les contrôleurs de domaine sont requis de médiateurs de l’immunité contre les agents pathogènes microbiens1,2. Dans les organes lymphoïdes périphériques, les lymphocytes t CD4 est activés dès la reconnaissance des antigènes spécifiques présentés par TTB3,4,5. Les cellules T CD4 activées se multiplient et se différencient en lymphocytes Th effecteurs spécifiques distinctes qui sont nécessaires au développement d’une bonne réponse immunitaire adaptative6,7. Contrôle de ces processus est essentiel pour produire une défense adaptative suffisante qui tue l’agent pathogène sans produire de dommage tissulaire nocifs8. Lymphocytes Th sont définis en fonction de l’expression ou la production de molécules de surface, des facteurs de transcription et cytokines effectrices et d’exercer les fonctions essentielles et précises en réponse aux agents pathogènes1. Cellules du sous-ensemble de cellules Th1 expriment le facteur de transcription T-bet et la cytokine interféron γ (IFNγ) et participent à la défense de l’hôte contre les pathogènes intracellulaires1. Quantification de l’activation des cellules T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 est un moyen utile d’évaluer le jeu de cellules de rôle T dans une réponse immunitaire.
Ce protocole permet in vivo analyse de la capacité de in vitro -généré dérivé de BM DCs pour moduler l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules T CD4 naïves Th1. Le protocole sert également à évaluer la capacité des cellules T CD4 naïves d’être activé, induit à proliférer et Th1 différenciées (Figure 1). Ce protocole polyvalent contourne l’incapacité de manipuler ou de sélectionner la population étudiée cellule purement en vivo protocoles spécifiquement. Les effets de diverses molécules et traitements sur les contrôleurs de domaine peuvent être étudiés en utilisant BM de souris génétiquement modifiées5 ou en traitement ou en manipulant génétiquement isolées de cellules BM9. De même, les lymphocytes T peuvent être explorées en obtenant des lymphocytes T pour transfert adoptif provenant de différentes sources ou après plusieurs manipulations3,8,10.
Les principaux avantages du présent protocole sont de deux ordres. Activation des cellules t, la prolifération et la différenciation Th1 sont analysés avec une approche de cytométrie de flux ; et ceci est combiné avec les études in vivo , ainsi éviter des altérations qui peuvent se produire in vitro et y compris les types de cellules et d’autres facteurs ne trouves que dans les organes intacts11.
L’utilisation de colorants vitaux est une technique largement utilisée pour suivre la prolifération cellulaire tout en évitant l’utilisation de la radioactivité. La mesure de la prolifération avec ces réactifs est issue d’une dilution de la teinture après division cellulaire. En outre, ces colorants peuvent être détectés à plusieurs longueurs d’onde et sont facilement analysés par cytométrie en combinaison avec des anticorps fluorescents ou les marqueurs multiples. Nous mettons en évidence l’utilité de ce protocole en montrant comment l’activation des cellules T, la prolifération et la différenciation Th1 peuvent être analysés par cytométrie en flux.

<table><tbody><tr><td>Éthanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20,824,365</td><td>5 L</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Outils de science fine (F.S.T.)</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>pour outils de sciences fines (F.S.T.)</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Outils scientifiques fins (F.S.T.)</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Outils de sciences fines (F.S.T.)</td><td>10020-00</td><td>Boîte de 100 lames</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>SIGMA</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>GIBCO</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri stériles</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de calibre 25</td><td>BD Microlance 3</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>Novico</td><td>N15663</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; m filtre en nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse du sang rouge</td><td>SIGMA</td><td>R7757</td><td>100 Ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>ED2SS-250</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>SIGMA</td><td>302643-25G</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthananesulfonique (HEPES)</td><td>Cambrex</td><td>BE17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol</td><td>Merck</td><td>8-05740-0250</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>LONZA</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>LONZA</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Granulocyte murin recombinant Facteur de stimulation des colonies de macrophages (GM-CSF)</td><td>Prepotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>lipopolysaccharide (LPS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L2018</td><td></td></tr><tr><td>96-well-plate</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>v450 anti-souris CD11b anticorps</td><td>BD Biosciences</td><td>560455</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-souris Anticorps CD64</td><td>BioLegend</td><td>139303</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-souris Anticorps CD115</td><td>BioLegend</td><td>135505</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-souris Anticorps CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117305</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anticorps anti-souris MHCII</td><td>BioLegend</td><td>125507</td><td></td></tr><tr><td>APC Anticorps CD86 BioLegend</td><td></td><td>105011</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-souris Anticorps CD80</td><td>BioLegend</td><td>104713</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de cytométrie en flux</td><td>Zelian</td><td>300800-1</td><td>PS 12X75 5mL</td></tr><tr><td>OTII Peptide</td> <td>d’ovoalbumineInvivoGen</td><td>323-339</td><td></td></tr><tr><td>anticorps CD8&alpha biotinylé anti-souris</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U500</td><td></td></tr><tr><td>anticorps IgM biotinylé anti-souris</td><td>BioLegend</td><td>406503</td><td></td></tr><tr><td>anticorps B220 biotinylé anti-souris</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0452-U500</td><td></td></tr><tr><td>anticorps CD19 biotinylé anti-souris</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0193-U500</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-souris biotinylé MHCII (I-Ab)</td><td>BioLegend</td><td>115302</td><td></td></tr><tr><td>anticorps CD11b biotinylé anti-souris</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0112-U500</td><td></td></tr><tr><td>anticorps CD11c biotinylé anti-souris</td><td>BioLegend</td><td>117303</td><td></td></tr><tr><td>anticorps CD44 biotinylé anti-souris</td><td>BioLegend</td><td>103003</td><td></td></tr><tr><td>biotinylé Anticorps CD25</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps DX5 biotinylé anti-souris</td><td>BioLegend</td><td>108903</td><td></td></tr><tr><td>microbilles magnétiques enrobées de streptavidine</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur de cellules magnétique</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>Séparateur QuadroMACS</td></tr><tr><td>Colonnes de séparation</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps CD4 anti-souris</td><td>PE</td><td>BioLegend 100408</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps CD3 anti-souris</td><td>BioLegend</td><td>100235</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anticorps CD8 anti-souris</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Cell Violet Tracer</td><td>Thermofisher</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris CD25 APC Tonbo</td><td>Biosciences</td><td>20-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 anti-souris CD69 Anticorps</td><td>BioLegend</td><td>104518</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCY5.5 anti-souris CD45.1</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>65-0453</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-souris CD45.1</td><td>anticorps Tonbo Biosciences</td><td>20-0453</td><td></td></tr><tr><td>PECY7 anti-souris CD45.1</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>60-0453</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-souris CD45.2 anticorps</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0454</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12 Myristate 13 Acétate (PMA)</td><td>SIGMA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BD GolgiPlug)</td><td>BD</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Millipore</td><td>8-18715-02100</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de perméabilisation intracellulaire</td><td>eBioscience</td><td>00-8333</td><td></td></tr><tr><td>APC anticorps anti-souris IFNg</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-7311-U100</td><td></td></tr><tr><td>Fc-block (anti-souris CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-U100</td><td></td></tr><tr><td>B6. souris SJL CD45.1</td><td>Le laboratoire Jackson</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&trade ; Analyseur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Solution</td><td>Thermofisher</td><td>62248</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de souris in vivo à l’activation des cellules t cd4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification de l’activation des cellules T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation de T helper 1 (Th1) cellules est un moyen utile pour évaluer le rôle joué par les cellules T dans une réponse immunitaire. Ce protocole décrit la différenciation in vitro des progéniteurs de la moelle osseuse (BM) afin d’obtenir de granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) dérivés-cellules dendritiques (CD). Le protocole décrit également le transfert adoptif de peptide d’ovalbumine (OVAp)-chargé de DCs dérivés du GM-CSF et cellules T CD4 naïves des souris transgéniques OTII afin d’analyser l’in vivo de l’activation, la prolifération et la différenciation Th1 de la cellules T CD4 transférés. Ce protocole contourne la limitation de purement en vivo méthodes imposées par l’incapacité de manipuler ou de sélectionner la population cellulaire étudié spécifiquement. De plus, ce protocole permet des études dans un environnement en vivo , évitant ainsi les altérations des facteurs fonctionnels qui peuvent se produire in vitro et y compris l’influence des types de cellules et d’autres facteurs que ne se trouves dans les organes intacts. Le protocole est un outil utile pour générer des changements dans les PED et de cellules T qui modifier adaptative des réponses immunitaires, potentiellement fournir des résultats importants pour comprendre l’origine ou le développement de nombreuses maladies associées immunitaires.

La figure 1 illustre les étapes décrites dans le présent protocole. La figure 2 illustre l’isolement et la culture de cellules de souris BM. L’ajout de GM-CSF et de LPS à ces cultures permet la génération in vitro et de maturation des DCs. Figure 3 illustre l’analyse de cytométrie en flux de la différenciation et la maturation de la MDD obtenus dérivé de GM-CSF BM de DCs. OVAp-chargé et isol...

Nous présentons ici un protocole pour le dosage in vivo de l’activation des lymphocytes (cellules T) T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 induite par la moelle osseuse de GM-CSF (BM)-dérivé des cellules dendritiques (CD). En outre, ce protocole décrit BM et T-cellule d’isolement, la génération de DC et DC et les cellules T transfert adoptif.

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie sur l’activation, la prolifération et la différenciation des lymphocytes T, ainsi que sur la stimulation cellulaire de l’immunité adaptative par l’antigène. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude d’un environnement in vivo tout en permettant simultanément la manipulation cellulaire in vitro. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’isolement et de transfert adoptif des organes et des os sont difficiles à maîtriser à l’aide d’instructions textuelles seules.Pour l’isolement des cellules de la moelle osseuse, désinfectez les membres postérieurs d’une souris adulte avec de l’éthanol à 70 % et utilisez des ciseaux pour faire une incision cutanée latérale à travers les membres postérieurs. Insérez des ciseaux sur la face médiale des jambes et coupez la peau avec les ciseaux jusqu’au début des membres postérieurs. Ensuite, utilisez des pinces pour séparer la peau des jambes.À l’aide de ciseaux, séparez le muscle du fémur et du tibia et utilisez des ciseaux pour désarticuler l’articulation de la hanche, brisant la tête du fémur. Ensuite, séparez le fémur du tibia sans casser les extrémités des os et placez les os dans une boîte de Pétri de milieu complet sur de la glace. Lorsque tous les os ont été prélevés, coupez soigneusement les extrémités proximale et distale de chaque os à l’aide d’un scalpel et utilisez une seringue de 1 millilitre équipée d’une aiguille de calibre 25 pour rincer les os à plusieurs reprises avec un volume total de 10 millilitres de milieu RPMI complet chaud.Lorsque tous les os ont été rincés, transférez tout le contenu de la boîte dans un tube conique de 50 millilitres équipé d’un filtre en nylon à pores de 70 micromètres, et délogez soigneusement tous les débris et conglomérats cellulaires en remuant doucement et en pipetant. Prélever les cellules de la moelle osseuse par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges à quatre degrés Celsius avec pipetage, et incubez le mélange sur de la glace pendant cinq minutes.A la fin de l’incubation, arrêter la lyse avec 10 millilitres de PVS, et remettre en suspension la pastille dans 25 millilitres de milieu complet pour une seconde centrifugation. Ensuite, remettez les cellules en suspension dans 5 millilitres de milieu complet frais pour le comptage, puis centrifugez à nouveau les cellules. Pour l’isolement des cellules du tissu lymphoïde secondaire, prélevez les ganglions lymphatiques inguinaux, axillaires, brachiaux, cervicaux et mésentariques, ainsi que la rate de souris transgéniques OT-II, et transférez les tissus lymphoïdes secondaires dans une boîte de Pétri en plastique contenant 10 millilitres de milieu RPMI complet.Lorsque tous les tissus ont été prélevés, transférez les ganglions lymphatiques et la rate dans une crépine cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres, et utilisez un piston de seringue pour homogénéiser les tissus. Rincez la passoire avec jusqu’à 15 millilitres de fluide et faites tourner les cellules par centrifugation. Ensuite, isolez les lymphocytes T CD4-positifs par tri par billes magnétiques, selon les protocoles standards.Pour l’activation in vivo des lymphocytes T CD4 positifs naïfs OT-II, marquez les lymphocytes T isolés par des billes magnétiques avec un colorant traceur cellulaire vital, conformément aux protocoles standard, et remettez en suspension les cellules marquées à une concentration de 10 à six cellules par 100 microlitres de PBS. Ensuite, transférez adoptivement 100 microlitres de cellules par animal via la veine de la queue. Préchauffez les souris avant l’injection afin de vous assurer que les veines de la queue sont suffisamment dilatées pour permettre l’administration de tout le volume cellulaire.Après 24 heures, administrer 10 cellules dendritiques chargées de peptides OVA matures au LPS par injection sous-cutanée dans le coussinet plantaire de chaque animal injecté de cellules T. Deux et cinq jours après le défi adoptif, prélever les ganglions lymphatiques poplitiaux des animaux receveurs pour le traitement des tissus et l’isolement des lymphocytes T, comme démontré. Pour analyser l’activation des lymphocytes T, colorez les cellules isolées du deuxième jour avec des anticorps fluorescents contre CD4, CD69 et CD25 afin de déterminer le pourcentage de lymphocytes T CD64 positifs et CD25 positifs au sein de la population CD4 positive du receveur par cytométrie en flux.Pour évaluer la prolifération des lymphocytes T, colorez les cellules isolées du cinquième jour avec les anticorps fluorescents appropriés contre CD4 et analysez la décomposition du signal du colorant traceur cellulaire vital dans la population de lymphocytes T CD4 positifs du donneur par cytométrie en flux. Pour évaluer la différenciation Th1, mettre en boîte quatre fois 10 à cinq cellules T isolées par puits dans 200 microlitres de milieu complet, complétées par de l’ionomycine et du PMA par puits, dans une plaque de 96 puits. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant six heures, en ajoutant de la Brefeldine A à chaque puits pour bloquer la sécrétion de cytokines pendant les quatre dernières heures de la stimulation.À la fin de l’incubation, centrifuger la plaque et jeter le surnageant par inversion rapide. Colorer les cellules avec l’anticorps anti-CD4, suivi d’une fixation dans 100 microlitres de 2 % de paraformaldéhyde et de 1 % de saccharose pendant 20 minutes à température ambiante. Perméabiliser les cellules avec 50 microlitres de tampon de perméabilisation pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius, suivi d’un lavage par centrifugation avec 150 microlitres de PBS par puits.Ensuite, colorer les cytokines intracellulaires d’intérêt, selon les protocoles standard pendant 30 minutes à température ambiante, suivi de deux lavages de centrifugation avec 150 microlitres de PBS complétés par 1 % de saponine par puits. Ensuite, analysez les cellules par cytométrie en flux. L’analyse cytométrique en flux de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse GM-CSF après stimulation par LPS révèle une régulation à la hausse des marqueurs de maturation, tels que MHCII, CD80 et CD86.Les lymphocytes T NOIVE CD4 positifs pour l’OT-II sont activés après le transfert adoptif à des animaux receveurs par leur régulation positive des marqueurs d’activation des lymphocytes T, leur expression de surface et leurs multiples cycles de division cellulaire. Lors de l’activation, les lymphocytes T OT-II CD-II positifs proliférants présentent un phénotype Th1, comme le démontre leur expression intracellulaire de l’interféron gamma. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en huit heures si elle est exécutée correctement.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de préparer tous les réactifs et matériaux la veille de l’expérience. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en immunologie pour étudier les cellules dendritiques et les cellules T chez la souris. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler la moelle osseuse des fémurs et du tibia des souris, et comment transférer des cellules T et des cellules dendritiques aux animaux receveurs.N’oubliez pas que travailler avec des instruments tranchants tels que des aiguilles, des scalpels ou des ciseaux peut être extrêmement dangereux, de sorte que des précautions telles que l’utilisation d’une protection appropriée des doigts doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.

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Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (Vidéo) | JoVE Journal

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

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