Name: Une mesure de chromatographie liquide à haute performance de kynurénine et acide kynurénique : biochimie sur la Cognition et sommeil chez le rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Découvrez la chromatographie liquide haute performance pour mesurer le kynurénine et l'acide kynurénique chez le rat. Cette méthode combine analyses biochimiques et comportementales pour étudier les effets de la voie du kynurénine sur la cognition et le sommeil.

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La présente étude a été financée en partie par le National Institutes of Health (R01 NS102209) et un don du Clare E. Forbes Trust.

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<li>Shibata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorimetric+micro-determination+of+kynurenic+acid%2C+an+endogenous+blocker+of+neurotoxicity%2C+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography.</a> Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).</li>
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<li>Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+deprivation+selectively+impairs+memory+consolidation+for+contextual+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning.</a> Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour une évaluation fiable de KYNA dans le cerveau après une administration périphérique kynurénine, il est essentiel de combiner et d’interpréter les expériences biochimiques et fonctionnelles. Nous présentons ici un protocole détaillé qui permet aux nouveaux utilisateurs de mettre en place des méthodes efficaces pour mesurer la kynurénine de plasma et le cerveau cristano de rats. La mesure de kynurénine dans le plasma a confirmé l’injection précise et la mesure du métabolite cristano confirme la synthèse de novo</e...

Le KP est responsable de la dégradation de près de 95 % de l’acide aminé essentiel tryptophane1. Dans le cerveau des mammifères, kynurénine pris en astrocytes est métabolisé en la petite molécule de neuroactive cristano principalement par l’enzyme kynurénine aminotransférase (KAT) II2. CRISTANO agit comme un antagoniste des récepteurs NMDA et α7nACh dans le cerveau2,3,4, et également cible les récepteurs dont le récepteur d’hydrocarbures aryliques (AHR) et la G-protéine de signalisation récepteur couplé à la 35 (GPR35)5 ,6. Chez les animaux expérimentaux, élévations dans cerveau cristano ont démontré qu’amoindrir leurs performances cognitives dans un tableau de tests comportementaux2,7,8,9,10 . Une nouvelle hypothèse suggère que cristano joue un rôle important dans la modulation des fonctions cognitives en influant le comportement de sommeil-éveil11, soutenant ainsi davantage le rôle des molécules dérivées astrocyte dans la modulation de la neurobiologie du sommeil et cognition,12.
Sur le plan clinique, élévations cristano ont été trouvées dans le liquide céphalorachidien et tissus post-mortem du cerveau de patients atteints de schizophrénie13,14,15,16, un trouble psychiatrique débilitant caractérisée par des troubles cognitifs. Patients atteints de schizophrénie sont aussi souvent minées par les troubles du sommeil qui peuvent aggraver la maladie17. Comprendre le rôle du métabolisme de la KP et frederic en modulant une relation entre le sommeil et cognition, particulièrement entre l’apprentissage et la mémoire, peut conduire au développement de nouvelles thérapies pour traiter ces piètres résultats dans la schizophrénie et d’autres maladies psychiatriques.
Une méthode fiable et cohérente pour la mesure des métabolites KP est importante pour assurer que les recherches émanant de diverses institutions peuvent être intégrés dans la compréhension scientifique de la biologie de la KP. Actuellement, nous décrivons la méthodologie permettant de mesurer la kynurénine dans le plasma du rat et frederic dans le cerveau de rat par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Le présent protocole, qui fait utiliser une détection fluorimétrique en présence de Zn2 +, a été développée par Shibata18 et plus récemment adapté et optimisé pour derivatize avec l’acétate de zinc 500 mM comme réactif postcolonne, permettant la détection de quantités de nanomolaires endogène, de frederic dans le cerveau11.
Pour stimuler la production de novo KYNA endogène comme décrit dans le présent protocole, la kynurénine bioprecursor direct est injecté par voie intrapéritonéale (i.p.) chez les rats. En combinaison avec les quotes-parts biochimiques pour déterminer le degré de production cristano, les impacts d’un kynurénine contestent sur la mémoire de l’hippocampe-dépendantes (paradigme de l’évitement passif) et l’architecture du sommeil-éveil (signaux EEG et EMG) est aussi enquête11. Une combinaison de ces techniques permet l’étude de l’impact biochimique et fonctionnel d’un kynurénine défi in vivo chez le rat.

<table><tbody><tr><td>Rats Wistar</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>adulte mâle, 250-350 g</td></tr><tr><td>L-kynurénine</td><td>sulfate Sai Advantium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 colonne (4 mm x 150 mm)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Clips</td><td>Stoelting Co.</td><td>59022</td><td></td></tr><tr><td>Matériel de montage vis</td><td>PlastiquesOne</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>Sutures non résorbables</td><td>MedRep Express</td><td>699B</td><td>CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOÎTE de 12</td></tr><tr><td>Sutures résorbables</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1</td></tr><tr><td>Dental Cement</td><td>Stoelting Co.</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>Mèche</td><td>Stoelting Co.</td><td>514551</td><td>0,45 mm</td></tr><tr><td><fort>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</strong</td></tr><tr><td>>Alliance Système HPLC</td>E2695 module de séparation Waters 176269503 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2475 détecteur de fluorescence</td><td>Waters</td><td></td><td></td>186247500</tr><tr><td>gestionnaire de réactifs post-colonne</td><td>Waters</td><td>725000556</td><td></td></tr><tr><td>ordinateur Lenovo</td><td>Waters</td><td>668000249</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Empower</td><td>Waters</td><td>176706100</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>Boîte d’évitement passive > pour rats</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extra tall MDF insonorisée</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-018MD</td><td>Intérieur : 22 » (L) x 22 » (H) x 16 » (D)</td></tr><tr><td>Modulateur de canal central chambre de la boîte de navette</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MC</td><td></td></tr><tr><td>Sol en acier inoxydable pour rat</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-GF</td><td></td></tr><tr><td>Porte guillotine automatique</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010B-S</td><td></td></tr><tr><td>Harnais de sol à grille navette à déconnexion rapide pour rat</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-QD</td><td></td></tr><tr><td>Lampe de stimulus, lentille blanche 1", montée sur panneau modulaire</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-221M</td><td></td></tr><tr><td>Module Sonalert avec contrôle de volume pour chambre à rat</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-223AM</td><td></td></tr><tr><td>SmartCtrl 8 entrées/16 sorties</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-716P2</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle IR 8 canaux pour navettes</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-253C</td><td></td></tr><tr><td>Bandes de source infrarouge et de réseau de capteurs</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-256</td><td></td></tr><tr><td>Armoire d’interface de table, 120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080C</td><td></td></tr><tr><td>Module de stimulation aversive à courant constant à double plage</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-410B</td><td></td></tr><tr><td>Module d’embrouillage au sol à grille statique</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-412</td><td></td></tr><tr><td>Module de contrôle d’amortisseur double A/B</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-415</td><td></td></tr><tr><td>2' 3 broches rallonge mini-molex</td><td>MedAssociates</td><td>SG-216A-2</td><td></td></tr><tr><td>Câble de sortie d’amortisseur 10', DB-9 M/F</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219G-10</td><td></td></tr><tr><td>Câble de commande d’amortisseur de navette 15', 6</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219SA</td><td></td></tr><tr><td>Petite armoire de table et bloc d’alimentation, 120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080D</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble d’interface PCI</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-700P2-R2</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble utilitaire d’évitement de boîte de navette</td><td>MedAssociates</td><td>SOF-700RA-7</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sleep-Wake Monitoring Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponehmah software</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNP-P3P-610</td><td></td></tr><tr><td>MX2 8 Interface d’acquisition source</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNM-P3P-MX204</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur Dell, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bits</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0112-013</td><td></td></tr><tr><td>Moniteur d’ordinateur Dell 19"</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0113-001</td><td></td></tr><tr><td>Récepteurs pour cages en plastique, 8x</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>272-6001-001</td><td></td></tr><tr><td>Routeur VPN Cisco RV130</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>RV130</td><td></td></tr><tr><td>Matrix 2.0</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0119-001</td><td></td></tr><tr><td>Commutateur réseau</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>SG200-08P</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Neuroscore</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0171-CFG</td><td></td></tr><tr><td>Transmetteur à deux canaux biopotentiels, modèle TL11M2-F40-EET</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>270-0134-001</td><td></td></tr></tbody></table>

une mesure de chromatographie liquide à haute performance de kynurénine et acide kynurénique : biochimie sur la cognition et sommeil chez le rat

A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats

La voie de la kynurénine (KP) de la dégradation du tryptophane a été impliquée dans les troubles psychiatriques. Plus précisément, l’astrocyte dérivé métabolite acide kynurénique (frederic), un antagoniste à deux N-méthyl-d-aspartate (NMDA) et α7 des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (α7nACh), a été impliquée dans des processus cognitifs dans la santé et la maladie. Comme cristano taux sont élevés dans le cerveau des patients atteints de schizophrénie, un dysfonctionnement au récepteurs cholinergiques et glutamatergiques est censé être causalement liée à la dysfonction cognitive, un domaine du noyau de la psychopathologie de la maladie. FREDERIC jouerait un rôle pathophysiologically important chez les individus atteints de schizophrénie. Il est possible d’élever cristano endogène dans le cerveau des rongeur de traiter les animaux avec la kynurénine bioprecursor direct, et des études précliniques sur des rats ont montré que cristano élévation aiguë peut avoir une incidence leurs processus d’apprentissage et de mémoire. Le protocole actuel décrit cette approche expérimentale en détail et combine un) une analyse biochimique de kynurénine sanguin et cerveau formation KYNA (à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance), des tests b) comportementaux pour sonder la hippocampe-dépendantes mémoire contextuelle (paradigme de l’évitement passif) et c) une évaluation du comportement de veille-sommeil [enregistrements télémétriques combinant l’électroencéphalogramme (EEG) et les signaux de l’électromyogramme (EMG)] chez le rat. Pris ensemble, une relation entre élevées cristano, sommeil et cognition est étudiée, et ce protocole décrit en détail une approche expérimentale à la compréhension des résultats de la fonction de kynurénine élévation et cristano formation in vivo chez le rat. Résultats obtenus par les variations de ce protocole permettra de tester l’hypothèse que le KP et frederic servent un rôle essentiel dans la modulation de sommeil et la cognition dans les États de santé et la maladie.

Pour valider l’utilisation d’une injection intrapéritonéale de kynurénine comme méthode d’élever le cerveau cristano, une analyse par CLHP de tissu a été réalisée. Les courbes standard (Figure 1) ont été construits en utilisant le logiciel associé et a permis la quantification des échantillons de tissus. Des chromatogrammes représentatifs pour kynurénine et frederic sont présentés dans la Figure 2. Kynurénine a été observée à un ...

Altérations dans les métabolites de neuroactive kynurénine voie (KP) sont impliquées dans les troubles psychiatriques. Enquête sur les résultats fonctionnels d’une altération kynurénine voie métabolisme in vivo chez les rongeurs peut aider à expliquer des nouvelles approches thérapeutiques. Le protocole actuel combine les approches biochimiques et comportementales afin d’étudier l’impact d’un défi de kynurénine aiguë chez le rat.

Une mesure de chromatographie liquide à haute performance de kynurénine et acide kynurénique : biochimie sur la Cognition et sommeil chez le rat

The kynurenine pathway (KP) of tryptophan degradation has been implicated in psychiatric disorders. Specifically, the astrocyte-derived metabolite ...

Cette méthode combine des approches biochimiques et comportementales pour aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences sur l’impact d’une provocation aiguë à la kynurénine chez le rat. Le principal avantage de la technique est qu’elle fournit une méthode fiable et cohérente pour la mesure des métabolites de la voie de la kynurénine dans le cerveau et le plasma du rat. La démonstration de la procédure sera assurée par Carly Fabian, une étudiante assistante de recherche de mon laboratoire.Au point final expérimental approprié après l’administration intrapéritonéale de kynurénine, décongeler le plasma récolté congelé sur de la glace humide et diluer les échantillons décongelés avec de l’eau ultrapure. Transférez 100 microlitres d’échantillon dilué dans des récipients individuels de 25 microlitres d’acide perchlorique à 6 % et vortex en centrifugeant les échantillons. Ensuite, transférez 100 microlitres de surnageants de chaque tube dans des tubes à centrifuger individuels de 250 microlitres pour la détermination de la kynurénine et de l’acide kynurénique.Pour mesurer l’acide kynurénique à partir d’échantillons de cerveau, décongelez les échantillons de cerveau récoltés congelés sur de la glace sèche et pesez individuellement chaque échantillon sur une balance analytique précise. Lorsque tous les échantillons ont été pesés, déplacer les tubes sur de la glace humide et diluer chaque échantillon de tissu à un rapport poids/volume de 1 à 10 avec de l’eau ultrapure, suivi d’une homogénéisation à l’aide d’un sonicateur. Disposez de 100 microlitres de chaque boue d’échantillon dans un nouveau tube, puis ajoutez 25 microlitres d’acide perchlorique à 25 % pour le vortex et la centrifugation.Ensuite, transférez 100 microlitres de surnageant dans des tubes de microcentrifugation individuels de 250 microlitres pour la détermination de l’acide kynurénique. Pour préparer la machine de chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC, pour l’analyse de la kynurénine, placez d’abord les tubes d’admission HPLC individuels dans la phase mobile, l’eau ultrapure et les récipients 100 % acétonitrile. Ensuite, programmez l’instrument pour qu’il fonctionne à 5 % d’acétonitrile et à 95 % d’eau ultrapure à 0,5 millilitre par minute et laissez la machine HPLC fonctionner pendant 20 à 30 minutes.Lorsqu’une pression et une ligne de base stables ont été atteintes, changez la composition de la solution en une phase mobile d’acétonitrile à 5 % et d’acétate de sodium à 95 % et équilibrez l’instrument pendant 30 minutes supplémentaires. Pendant que l’instrument s’équilibre, allumez la lampe du détecteur de fluorescence. Avant la dérivitation, pompez la solution d’acétate de zinc séparément à travers une pompe péristaltique qui se combine avec la colonne de phase mobile et allumez la pompe de colonne à un débit de 0,1 millilitre par minute pendant environ 20 minutes, jusqu’à ce qu’elle atteigne une pression stable d’environ 500 psi.Lorsque l’instrument est prêt pour l’analyse, réglez le logiciel du système pour contrôler les paramètres de séquence d’échantillons et permettre l’auto-injection de plusieurs échantillons. Dans l’écran Exécuter l’échantillon, cliquez sur Fichier, puis faites glisser vers le bas jusqu’à Créer un nouvel ensemble d’échantillons, en sélectionnant Vide, dans la nouvelle fenêtre. Dressez individuellement la liste de tous les étalons et échantillons dans l’ordre dans lequel ils doivent être analysés, en analysant les étalons au début et à la fin de la séquence.Dans la colonne de fonction, désignez les étalons et les échantillons et réglez le programme pour injecter de l’eau tous les cinq échantillons. Réglez la durée d’exécution de chaque échantillon à 15 minutes et injectez 20 microlitres des échantillons des étalons, suivis de 20 microlitres d’échantillons de plasma et de 30 microlitres d’échantillons d’homogénat de cerveau, selon l’expérience appropriée. Ensuite, réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission en fonction du composé mesuré et exécutez la séquence.Pour quantifier les données, ouvrez l’écran Parcourir le projet et sous l’onglet Jeux d’échantillons, double-cliquez sur l’ensemble d’échantillons à quantifier. Dans la liste des injections, mettez en surbrillance toutes les normes et faites un clic droit pour sélectionner Process' dans la nouvelle fenêtre. Ensuite, utilisez le menu déroulant pour sélectionner Calibrer et quantifier’Mettez à nouveau en surbrillance tous les étalons, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Vérifier’Lorsque les chromatogrammes s’ouvrent, intégrez et étalonnez chaque étalon pour générer la courbe d’étalon.Ensuite, retournez dans l’onglet Ensembles d’échantillons et double-cliquez sur l’ensemble d’échantillons pour quantifier et examiner comme démontré, en intégrant et en quantifiant chaque échantillon pour obtenir la concentration de chaque échantillon en fonction de la courbe standard précédemment créée. L’analyse HPLC d’échantillons de tissus prélevés sur des animaux administrés à la kynurénine révèle un temps de rétention de la kynurénine d’environ six minutes et un temps de rétention de l’acide kynurénique d’environ 11 minutes. La quantification de la kynurénine plasmatique et de l’acide kynurénique de l’hippocampe révèle que l’injection aiguë de kynurénine augmente les taux d’acide kynurénique dans le cerveau, avec un pic atteint deux heures après l’injection qui revient à la ligne de base quatre heures après l’injection.Bien qu’aucune différence entre les groupes n’ait été observée lors des essais d’entraînement au paradigme d’évitement passif, les animaux témoins présentent une augmentation significative de la latence pour entrer dans le côté obscur pendant les essais de test, indiquant un apprentissage contextuel, tandis que les animaux injectés de kynurénine 24 heures auparavant ne présentent pas la même augmentation de latence, démontrant un déficit d’apprentissage. De plus, l’évaluation de l’impact d’une élévation aiguë de la kynurénine pendant la phase légère sur l’architecture veille-sommeil indique une réduction de la durée totale du sommeil à mouvements oculaires rapides pendant les deux premières heures après l’injection de kynurénine. Ces données se reflètent dans une augmentation de la durée de l’éveil au cours de ces périodes et une légère réduction du sommeil par mouvements oculaires non rapides, démontrant qu’une élévation aiguë de la kynurénine provoque également des perturbations de la dynamique veille-sommeil.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse comportementale peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur le rôle de la formation élevée d’acide kynurénique dans la modulation de la cognition et du sommeil.

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Une procédure est décrite pour la manipulation de l'activité du cortex cérébral neurones pyramidaux optogenetically tandis que l'électroencéphalogramme, électromyogramme, et la concentration de lactate cérébral sont surveillés. Enregistrements expérimentaux sont effectués sur les câbles attachés-souris tandis qu'ils subissent spontanément veille / sommeil cycles. Optogenetic matériel est assemblé dans notre laboratoire, le matériel d'enregistrement est disponible dans le commerce.

Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Cette vidéo présente un protocole d’implantation d’un ensemble d’électrodes d’électroencéphalogramme (EEG) et d’électromyogramme (EMG) dans une souris anesthésiée. Le processus consiste à fixer la souris sur un cadre stéréotaxique, à faire une incision médiane dans le crâne, à percer des trous pour les électrodes et à fixer l’unité d’électrode pour l’enregistrement du signal. Après la récupération, le comportement veille-sommeil de la souris est analysé à l'aide des signaux enregistrés.

Analyse du comportement en sommeil chez la souris à l’aide d’enregistrements d’électroencéphalogramme et d’électromyogramme

L’enregistrement de l’électroencéphalogramme (EEG) et de l’électromyogramme (EMG) chez les souris se comportant librement est une étape essentielle pour corréler le comportement et la physiologie avec le sommeil et l’éveil. Le protocole expérimental décrit dans le présent document fournit un système câblé pour l’acquisition d’enregistrements EEG et EMG chez la souris.

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Capture de la dopamine et de chromatographie liquide à haute performance représentent expérimentale des outils d’analyse pour étudier l’homéostasie de la dopamine chez les souris en évaluant la fonction de transporteur de la dopamine et les niveaux de dopamine dans le tissu du striatum, respectivement. Nous présentons des protocoles afin de mesurer la teneur en tissu dopamine et d’évaluer les fonctionnalités du transporteur de la dopamine.

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Décrit ici est un protocole pour la détermination de quatre métabolites différents de tryptophane produits dans la voie de kynurenine (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, acide xanthurenic, acide 3-hydroxyanthranilic) dans le milieu recueilli des cultures de cellules cancéreuses analysées par chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse quadrupole simple.

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Une mesure de chromatographie liquide à haute performance de kynurénine et acide kynurénique : biochimie sur la Cognition et sommeil chez le rat (Vidéo) | JoVE Journal

Une mesure de chromatographie liquide à haute performance de kynurénine et acide kynurénique : biochimie sur la Cognition et sommeil chez le rat

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