Name: Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Découvrez le marquage de protéines endogènes dans les cellules souches pluripotentes induites humaines par CRISPR/Cas9. Cette méthode permet d'étudier la dynamique protéique sous contrôle régulateur endogène en temps réel.

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Nous remercions Dambournet Daphné pour de nombreuses discussions perspicaces et conseils sur le gène édition, Thao à titre d’illustration, Angelique Nelson pour une lecture critique du manuscrit et Andrew Tucker pour la génération de la lignée de cellules B1 Lamin-le tag mEGFP. Nous tenons à souligner les cellules souches et les gène Editing et les équipes de développement de l’analyse à l’Institut Allen pour la Science des cellules pour leur contribution au processus de contrôle de la qualité et de gène d’édition. La ligne WTC qui nous permet de créer notre lignée génétique-édité a été fournie par le Bruce R. Conklin Laboratory aux instituts de Gladstone et UCSF. Nous remercions l’Institut Allen pour le fondateur de la Science des cellules, Paul G. Allen, pour sa vision, encouragement et appuyer.

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<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode présentée ici pour générer de façon endogène sont réglementés par des fusions de protéine fluorescente dans hiPSCs est une approche souple et puissante pour générer des lignées cellulaires de gène édité avec des applications allant de l’imagerie de cellules vivantes à diverses études fonctionnelles et » modèles de maladies dans un plat » à l’aide de dérivés de patient hiPSC lignes13,14,15. Bien que cette méthode a servi à introduire de grandes étiquettes FP à la N - ou C-terminale de protéines endogènes, il susceptibles de servir à présenter autres balises ou des petits changements génétiques de modèle ou pathogènes correcte des mutations22,23 . Pour les insertions plus petites, la taille du bras homologie peut être réduite, mais l’approche générale présentée dans cette méthode d’édition peut-être toujours s’appliquer24,25. Tandis que l’utilisation de hiPSCs est fortement encouragée pour leur grande utilité, avec optimisation de l’attention, ce protocole peut être adapté afin de modifier le génome d’autres lignées cellulaires de mammifères.
Lorsqu’on veut identifier un gène d’intérêt pour le marquage de FP, estimations de l’abondance de la transcription (à partir de « microarray » ou données de RNA-Seq) est un bon point de départ pour déterminer si un gène ou une isoforme d’intérêt est exprimé, bien que les niveaux de transcription ne concordent pas toujours avec taux de protéines. La stratégie de FACS-enrichissement décrite ici qui fonctionnera le mieux pour les gènes qui sont exprimés au moins modérément bien dans le type de cellules d’intérêt. Cette stratégie a également été réussie en choisissant des fusions qui montrent des phénomènes de localisation ponctuée et/ou discrètes comme centrine, desmoplakine et paxillin où le rapport fond signal est très faible12,19. Les gènes qui ne sont pas fortement exprimées ou sont exprimés uniquement dans les types dérivés de cellules peuvent exiger des stratégies de sélection supplémentaires.
Le point de départ pour crRNA et donateurs plasmide modèles utilisés dans des lignées cellulaires humaines devrait être le génome humain de référence (GRCh38). Parce que les génomes de différentes lignées cellulaires peuvent varier au sein de la même espèce, et que CRISPR/Cas9 est séquence-spécifique, il est très utile identifier les variantes de ligne spécifique de cellule (polymorphismes mononucléotidiques ou insertions/délétions (indels)) qui diffèrent du génome de référence et incorporer dans la conception. Cela garantit que crRNAs sera compatible avec le génome de l’hôte et que les bras d’homologie donateur modèle plasmide seront conservé pour les éventuelles variantes spécifiques de la lignée cellulaire. Une stratégie suggérée est d’intégrer les variantes homozygotes dans bras d’homologie du plasmide de modèle de crRNAs et donateur au cours du processus de conception. Incorporant des variantes hétérozygotes est facultative. Les réactifs spécifiques utilisés pour grandes expériences knock-in et autres considérations clés de ce protocole sont examinées ci-dessous.
Protéine de Cas9
Le principal avantage de l’utilisation de protéines Cas9 est celle présentant le Cas9 et gRNA comme un complexe RNP s’est avéré résulter en une durée limitée de l’activité nucléasique par rapport aux approches axées sur le plasmide où expression des Cas9 et gRNA peut continuer pendant des jours et conduire sur - et hors-cible à une plus grande activité26,27. Un autre avantage de l’utilisation de protéines Cas9, c’est qu’il est facilement disponible en conjonction avec une fois à l’intérieur des cellules. Cela contraste avec les méthodes plus conventionnelles d’utiliser Cas9 ARNm ou Cas9/gRNA plasmide nécessitant une transcription, traduction et protéine traitement26,28. Protéine S. pyogenes Cas9 type sauvage est maintenant disponible auprès de nombreuses sources commerciales.
Guide de l’ARN
Il existe de nombreux outils accessibles au public pour trouver les cibles de crRNA près du site d’insertion FP désiré qui ont zéro ou peu estimées hors-cibles dans l’hôte du génome29,30,31,32. Gains d’efficience en HDR et la précision des résultats HDR varient considérablement de crRNA cibles utilisées à un locus donné12. Pour cette raison, les tests crRNAs plusieurs (2-4 et de préférence moins de 50 bp du site d’insertion souhaité) par locus est recommandé car cela peut augmenter la probabilité d’une expérience d’édition réussie. Possibilités de livraison gRNA incluent synthétiques 2-partie crRNA et tracrRNA, synthétique unique gRNAs (sgRNAs), in vitro transcrit sgRNAs, ou livrer un plasmide de cellules exprimant le sgRNA partir d’un promoteur U6. Ce protocole ne était pas optimisé pour l’activité élevée de clivage. CrRNA de 2 parties non modifiée et tracrRNA (voir la Table des matières) ont été utilisés dans le but de générer des lignées de cellules mono-alléliques de FP-tag tout en causant la moins possible perturbation aux cellules.
Donateur modèle plasmide
Parce que certains de l’homologie arm séquence autant chez le donneur plasmide modèle est incorporée dans le génome hôte pendant l’événement HDR, mutations ponctuelles pour les sites de reconnaissance de crRNA devrait être introduites pour prévenir d’autres clivage par Cas9 suite HDR. Souvent, le changement de perturbateur plus simple consiste à muter la séquence de PAM. Parce que certaines séquences non canonique de PAM se distingues encore par sauvage S. pyogenes Cas9, il est préférable d’éviter d’utiliser NGG, NAG ou NGA33. Lorsque la mutation le bras d’homologie, éviter les mutations non-synonymes et l’introduction des codons rares. Si un changement synonyme à la séquence de PAM n’est pas possible, pensez à faire trois mutations synonymes de point dans la région de semences (10 bp proximal à PAM) du site de fixation crRNA. Doit être très prudent lorsque vous effectuez ces modifications dans la région non traduite de 5ʹ (UTR) car ces régions peuvent contenir des séquences régulatrices importants. Consulter une base de données de conservation génétique tels que les titres de génomique Comparative du navigateur UCSC Genome peuvent guider dans ces cas, comme changements aux bases non conservée peuvent être mieux tolérées que devient hautement conservée bases17. Parfois la simple insertion de la séquence de la FP est suffisant pour perturber le site de liaison de crRNA (comme dans la Figure 1) ; Cependant, la séquence nouvellement ajoutée doit être vérifiée pour la persistance des séquences de PAM et de la liaison crRNA.
Acide aminé linkers entre FP et la protéine native sont recommandés pour conserver la fonction de la protéine de fusion34. Souvent un linker acide aminé peut être choisi pour sa charge particulière ou de taille. Si une fusion d’ADNc avec un design similaire à le ciblées endogène protéine de fusion a été bien étudiée, que même linker séquence peut être utilisée pour le CRISPR/Cas9 knock-in expérience12,19. Si cette information n’est pas disponible, un éditeur de liens court tels que GTSGGS a également été utilisée avec succès12. Autres études ont démontré le succès avec une séquence de générique petit éditeur de liens acide amino-3 pour une variété d’objectifs35.
La transfection et l’enrichissement des FACS
De nombreux réactifs de transfection disponibles dans le commerce sont formulés pour la livraison de certains types de molécules, de cellules, alors qu’un système d’électroporation permet de livrer des réactifs avec un large éventail de taille, charge et composition. En plus d’être une méthode commune de transfection de cellules de dur-à-transfecter comme hiPSCs, électroporation réalise également l’avantage de fournir tous les trois composants pour FP CRISPR/Cas9-mediated knock-in tel que décrit dans cette méthode. Électroporation a été trouvée pour produire les meilleurs résultats par rapport aux autres réactifs disponibles dans le commerce dans l’élaboration de cette méthode (données non présentées) et a également été utilisé par d’autres pour le RNP livraison26,28,36 .
Lorsque vous utilisez ce protocole pour l’édition hiPSCs, spécial il faut pour assurer une manipulation douce des cellules avant et après le gène processus de survie optimale cellulaire et différenciation spontanée minimale de montage. En particulier, les méthodes d’enrichissement FACS doivent être adaptés pour le tri des cellules souches à l’aide de la buse plus grande possible (130 µm), un faible débit (≤24 µL/min), liquide de gaine sans agent de conservation (comme le sérum physiologique, voir la Table des matières) et l’échantillon faible pression (10 lb/po2). Au lieu de cellule unique tri, qui se traduit par viabilité sous-optimale dans les cellules souches, les hiPSCs enrichie en FACS sont triés en vrac et élargis comme une population pour optimiser l’intégrité de cellules souches et de la viabilité cellulaire. Cependant, il peut être approprié pour moins de types de cellules sensibles d’unicellulaire tri. Afin de favoriser la survie des cellules, cellules sont retournés à la culture n’est plus d’une heure après la récolte pour l’enrichissement de FACS et conservés à température ambiante pendant tout le processus de tri. Pour certains types de cellules, la survie des cellules peut également être améliorée par incubation des cellules sur la glace (4° C) pendant tout le processus de tri.
L’expansion en vrac des cellules positives FP fournit une occasion d’évaluer la population par l’analyse d’imagerie pour la localisation de protéine de fusion avant de générer des lignées clonales. Alors que la population enrichie résultante de cellules peut être suffisante pour certaines études, ces populations affichent fréquemment FP signal d’intensité variable. Les lignées clonales isolées ont signal uniforme (Figure 3), ce qui les rend plus approprié pour les expériences fonctionnelles12.
Génération de ligne de cellules clonales
Tout au long du processus de génération de ligne montage et clonale, il est important de surveiller la morphologie cellulaire. hiPSC colonies cultivées dans des conditions sans chargeur devraient montrer des bords lisses et un centre même, bien emballé12,18,19. Les cellules différenciées doivent être observées dans moins de 5 % de la culture. Lors de la cueillette des colonies individuelles, choisissez ceux que la morphologie bonne exposition. Au cours de la plaque à 96 puits passage des événements, vérifiez les clones pour la morphologie et arrêter ceux qui ont envahi car cela pourrait conduire à la différenciation ou être l’indice d’instabilité génétique.
Génération de lignées clonales permettant la confirmation génétique de montage précis, qui est important parce qu’induite par le Cas9 double brins dans le génome sont souvent réparé imprécisément malgré l’incorporation de la balise du locus désirée. Tests PCR décrites précédemment ont montré que cumulativement à travers dix locus génomiques uniques nombreux (45 %) des clones exprimant le FP a souffert de l’intégration de colonne vertébrale plasmide donneur au locus ciblé ou (rarement) au hasard dans le génome de12. En outre, 23 % des séropositifs au GFP clones (n = 177) dans dix lieux uniques trouvées pour héberger les mutations au ou près du site de coupe crRNA prévus dans l’allèle non balisé, probablement en raison de NHEJ12. Cette analyse génétique de nombreuses lignées clonales (~ 100 clones/edit) a souligné l’importance de validation génétique qui n’est pas possible dans une population de cellules puisque FP-expression et localisation des protéines fusion attendue seul ne garantit pas un montage précis12 . En outre, ces analyses basées sur la PCR ne peuvent être effectuées sur une population enrichie de cellules avec certitude, justifiant la nécessité pour la génération de la lignée clonale avant une analyse significative peut être complétée. Confirmation génétique de la balise insérée de FP et de vérification de l’intégrité génétique de l’allèle non éditée (dans un clone édité mono-alléliques) sont toutes deux nécessaires pour assurer un montage précis du locus ciblées au-delà l’expression de l’étiquette.
Un faible taux de modifications bi-alléliques et absence de mutations hors-cible (comme analysée par Sanger et séquençage de l’exome) ont été observés à ce jour à l’aide de cette méthode (données non publiées)12. Cela concorde avec les études précédentes décrivant l’utilisation du RNP de courte durée pour CRISPR/Cas9 expériences26,27. L’absence de lignées clonales avec bi-alléliques modifications peut aussi être locus spécifique ou en raison de l’incapacité de la cellule à tolérer deux tag copies d’une protéine essentielle, comme le suggèrent des expériences publiées antérieurement où étaient les cellules édités bi-alléliques putatifs observées pour un locus (LMNB1), mais pas un autre (TUBA1B)12. Bi-alléliques entièrement validée lignées clonales ont été générées à l’aide de cette méthode pour tag ST6 bêta-galactoside alpha-2, 6-sialyltransférase 1 (ST6GAL1) et membre de le RAB5A famille d’oncogène RAS (RAB5A) avec mEGFP19.
Au-delà de confirmer la précision du montage dans le génome, il existe une variété de tests de contrôle de la qualité qui peuvent être utilisés pour caractériser la lignée clonale et identifier les clones qui répondent à toutes les cellules souches, génomique, et critères biologiques de cellule pour utilisent à l’avenir des études . Analyses biologiques et fonctionnels des cellules peuvent être utilisés pour confirmer l’expression appropriée, localisation et fonction de la protéine de fusion12. La comparaison avec les contrôles parentaux aidera à évaluer l’influence du processus d’édition sur la localisation, la dynamique et la fonction. Autres tests tels que l’analyse de la croissance et des tests de stabilité génomique contribue également à déterminent si la protéine étiquetée est perturbante à la cellule. Lorsque vous utilisez hiPSC dans le présent protocole, évaluation des marqueurs pluripotence et potentiel de différenciation peut être critique dans la détermination d’un clone qui est précieux pour en aval d’études12. Parce que l’étendue de la culture de hiPSC a démontré que conduire à une instabilité génétique, suivi du taux de croissance et caryotype des lignées clonales est aussi important de12,37. Toutefois, la finale destinée utilisation des cellules édités déterminera en fin de compte le niveau et la profondeur de l’analyse de contrôle qualité et variera selon l’application.

L’utilisation de stratégies de modification du génome, surtout CRISPR/Cas9, à étudier les processus cellulaires devient de plus en plus accessible et plus précieux1,2,3,4,5, 6 , 7. une des nombreuses applications de CRISPR/Cas9 est l’introduction (via la réparation (HDR) de l’homologie réalisée) des grandes séquences exogènes comme GFP dans des loci génomiques spécifiques qui servent ensuite de reporters pour l’activité d’un gène ou une protéine produit8 . Cette technique peut être utilisée pour joindre une séquence de la protéine fluorescente à un cadre de lecture ouvert endogène où la protéine de fusion endogène réglementé qui en résulte peut être utilisée pour visualiser la localisation subcellulaire et la dynamique de la protéine d’intérêt5 ,6,9,10,11. Alors que les protéines étiquetées de façon endogène offrent de nombreux avantages par rapport aux systèmes de surexpression, insérant des grandes séquences du génome humain est un processus inefficace exigent généralement une sélection ou une stratégie d’enrichissement pour obtenir une population de cellules qui peuvent être facilement étudié5,12.
Ce protocole décrit l’insertion d’une séquence d’ADN codant pour une protéine fluorescente (FP) dans un locus génomique désiré. Le protocole prévoit la conception et la livraison du plasmide modèle donateur et le complexe ribonucléoprotéique (RNP) (protéine de type sauvage S. pyogenes Cas9 combiné avec l’ARN synthétique de CRISPR (crRNA) et activation de trans crRNA (tracrRNA)). Également décrit est l’enrichissement des cellules putativement édités par cellule à fluorescence activé triant (FACS) et le processus de génération de ligne de cellules clonales. A ce jour, cette méthode a été utilisée pour générer des lignes de hiPSC avec monoallelic ou balises (rarement) bi-alléliques protéine fluorescente verte (GFP), étiquetage des vingt-cinq protéines représentant les principales structures cellulaires. Les cellules édités résultants de ces efforts ont été confirmés ont l’insertion génétique attendue, exprimer une protéine de fusion localiser correctement, et maintenir la pluripotence et un caryotype stable12 (et des données non publiées). Cette méthode a également été utilisée pour générer plusieurs autre single et double (deux différentes protéines marquées dans la même cellule) sous la direction des populations de hiPSCs (données non publiées).
CISP humains provenant d’un donneur sain ont été choisis pour ces efforts de modification du génome car, contrairement à nombreuses lignées classiques, ils sont diploïdes, caryotype stable, non transformées et prolifératives. Ces propriétés fournissent un modèle attrayant pour l’étude de la biologie cellulaire fondamentale et modélisation de la maladie. En outre, le potentiel de différenciation des hiPSCs offre la possibilité d’étudier plusieurs stades de développement en parallèle à travers diverses lignées et des types de cellules en utilisant des cellules isogéniques, y compris les organoids, les tissus et les modèles « maladie dans un plat »13 ,14,15. Alors que ce protocole a été développé pour hiPSCs (ligne WTC), il peut être instructif pour l’élaboration de protocoles à l’aide d’autres lignées cellulaires de mammifères.

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters, ou un logiciel bioinformatique similaire</td><td></td><td>pour in silico conception de plasmide donneur</td></tr><tr><td>TE Buffer pH 8.0</td><td>IDT, ou similaire</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2 incubateur, ou similaire</td><td>ThermoFisher Scientific, ou similaire</td><td>51030408</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (1000 & micro ; L, 200 et micro ; L, 20 et micro ; L, 10 et micro ; L, 2 et micro ; L)</td> <td>Rainin, ou similaires</td> Pointes de <td></td><td></td></tr><tr><td>pipette (1000 &micro ; L, 200 et micro ; L, 20 et micro ; L)</td> <td>Rainin, ou pipette multicanaux similaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(200 & micro ; L)</td><td>Rainin, ou pipettes</td> sérologiques similaires <td></td><td></td></tr><tr><td>(25 mL, 10 mL, 5 mL)</td><td>Costar, ou collecteur à</td> 8 canaux similaire <td></td><td></td></tr><tr><td>BRAND pour Quiksip, autoclavable</td><td>Millipore Sigma, ou utilisation similaire</td><td>BR704526-1EA</td><td>avec des pointes de pipette non filtrées, telles que les pointes de pipette à faible rétention Molecular BioProducts, Pure 10, ci-dessous</td></tr> les <tr><td>pointes de pipette à faible rétention Molecular BioProducts, Pure 10</td><td>Thermo Fisher, ou similaire</td><td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2 Pipette</td><td>Controller Drummond, ou similaire</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur jetables</td><td>VWR, ou similaire</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>Classe II, Type A2 Enceinte de sécurité biologique</td><td>CELLGARD, ou similaire</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, facteur de croissance réduit</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>lot testé avant utilisation avec hiPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-rouge de phénol)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>à froid, pour dilution Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 Milieu complet</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>milieu de croissance recommandé pour la lignée hiPSC du WTC</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Ligne hiPSC</td><td>Coriell</td><td>GM25256</td><td>la lignée hiPSC utilisée dans ce protocole est disponible auprès de Coriell</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire à 6 puits</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) sans calcium, sans magnésium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15 mL polystyrène conique</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ( Inhibiteur de ROCK)</td><td>StemCell Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 ARNcr synthétique, non modifié (séquence personnalisée)</td><td>Dharmacon</td><td>Custom0247</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 TracrRNA synthétique</td><td>Dharmacon</td><td>U-002005-05</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant de type sauvage Streptococcus pyogenes Cas9-NLS protéine purifiée, 40 &micro ; M</td><td>Université de Californie-Berkeley QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmide de donneur personnalisé (PriorityGENE)</td>La conception de l’insert de donneur <td>Genewiz</td><td></td><td>a été synthétisée et clonée dans le squelette pUC57 par Genewiz</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech</td><td></td><td>740424.50</td><td></td></tr><tr><td>Système de transfection néon</td><td>ThermoFisher Système de</td><td></td> transfection au néon Scientific MPK5000<td></td></tr><tr><td>, 100 & micro ; Kit L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tube à fond rond en polystyrène avec capuchon de crépine</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube conique en polyproylène haute clarté</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Version FlowJo 10.2</td> Banque de sang <td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NERL Saline ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>8504</td><td>utilisée comme tampon FACS sans conservateur</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope Olympus SZX7, ou similaire</td><td>Olympus, ou plaque de</td> culture tissulaire similaire<td></td><td></td></tr><tr><td>, Falcon 96 puits</td><td></td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 96 puits, fond en V</td><td>CELLSTAR</td><td>351180</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td><td>utilisé comme tampon de cryoconservation pour les cellules au format plaque 96 puits</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 24 puits</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de crispr/cas9

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Un protocole est présenté pour générer des cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) que les protéines endogènes express fusionnés pour étiquettes fluorescentes N - ou C-terminale dans le cadre. Le système CRISPR/Cas9 procaryote (cluster court régulièrement dois‑je palindromique 9 répétitions/CRISPR-associés) peut-être servir d’y introduire les grandes séquences exogènes locus génomiques par réparation homologie réalisée (HDR). Pour atteindre le désiré knock-in, ce protocole utilise les ribonucléoprotéines (RNP)-approche où les protéines de type sauvage Cas9 Streptococcus pyogenes , synthétique 2 parties guide RNA (gRNA) et un plasmide de modèle de donateurs sont livrées aux cellules par l’intermédiaire de base électroporation. Putativement édités cellules exprimant les protéines fluorescent étiquetées sont enrichis par cellule à fluorescence activé triant (FACS). Lignées clonales sont alors générées et peuvent être analysées pour résultats de montage précis. En introduisant la balise fluorescente au locus génomique du gène d’intérêt, la localisation subcellulaire qui en résulte et la dynamique de la protéine de fusion peut être étudiée sous contrôle réglementaire endogène, une amélioration clé sur la surexpression classique systèmes. L’utilisation de hiPSCs comme un système modèle pour le gène marquage fournit l’occasion d’étudier les protéines étiquetées dans les cellules diploïdes, non transformées. Étant donné que les hiPSCs peuvent être différenciés dans plusieurs types de cellules, cette approche offre la possibilité de créer et d’étudier les protéines étiquetées dans une variété de contextes cellulaires isogéniques.

L’objectif de cette expérience était de fusible mEGFP (monomère GFP renforcée) à la protéine nucléaire de B1 lagoutte en introduisant la séquence de mEGFP à la fin de la 5ʹ du gène LMNB1 (extrémité N-terminale de la protéine). Un linker (séquence d’acides aminés SGLRSRAQAS) a été choisi en fonction des constructions précédentes de cDNA de la Collection Michael Davidson Fluorescent Protein21. Parce que la région de liaison de crRNA dans le plasmide de modèle du donneur pour chaque crRNA de candidat a été interrompue après l’insertion in silico de mEGFP et la séquence de l’éditeur de liens, il fallait pas mutations ponctuelles de perturber les potentiels crRNA reconnaissance et clivage de Cas9 de la séquence de donateurs (Figure 1). La séquence de donateurs contenait des armes d’homologie 1KO flanquant les deux extrémités de la séquence mEGFP-linker. La résultante 2 734 bp d’ADN a été cloné dans un squelette pUC57, séquence vérifié, et le plasmide de modèle donneur qui en résulte a été purifié à l’aide d’une préparation exempte d’endotoxine Maxie. Le plasmide modèle donneur et RNP complexe ont été transfectées, cellules putativement édités ont été enrichies et la localisation de la protéine de fusion B1 lagreve mEGFP nucléaire a été confirmée par microscopie de fluorescence (Figure 2). Seuls les résultats de la transfection de crRNA1 sont décrits ici, bien que les deux séquences de crRNA produit des populations putativement édité12.
Comparativement au témoin négatif, qui ne contenait aucune gRNA, protéine Cas9 ou plasmide modèle donateur dans la réaction d’électroporation (tampon seulement), le crRNA1 LMNB1 transfectées les cellules contiennent des cellules positives à le mEGFP de 0,95 % représentant la putativement édité population de B1 lagreve mEGFP-nucléaire (Figure 3 a). Ce résultat a été portée de knock-in efficacité observée à travers plusieurs locus génomiques à l’aide de cette méthode, comme indiqué précédemment12.
Les cellules mEGFP séropositifs ont été isolés par FACS et imagés par microscopie direct pour confirmer la localisation prévue de la mEGFP nucléaire lagoutte B1 protéine de fusion à l’enveloppe nucléaire. Après enrichissement de FACS, environ 90 % des cellules triées de la population de crRNA1 de LMNB1 ont été mEGFP-positive (tel que déterminé par microscopie), ce qui suggère que certaines cellules mEGFP-négatif co purifiés avec les cellules de GFP-positifs au cours de la procédure de tri. Il s’agissait d’un niveau acceptable d’enrichissement qui a permis à la récolte de 96 clones qui pourrait ensuite être génétiquement projetés pour l’édition réussie. Généralement, un seuil pour l’enrichissement de réussite est de 50 % positifs GFP.
La majorité de la population cellulaire trié affichée de fluorescence à l’enveloppe nucléaire (nuclear périphérie) dans les cellules ne se divisant pas et à une lamina nucléaire étendu dans le cytoplasme au cours de la mitose donnant confiance dans le bon génomique éditer à la LMNB1 locus. La population enrichie contenue des cellules avec signal lumineux ou dim. Cette différence d’intensité du signal peut refléter une combinaison de correctes et incorrectes d’éditer les résultats et les faits saillants de l’utilitaire de génération d’une lignée clonale génétiquement validée pour davantage d’études (voir Discussion) (Figure 3 b)12. Après la génération de la lignée clonale, génétiquement validé les cellules montrés l’intensité uniforme de GFP dans des expériences de microscopie (Figure 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> Figure 1 . Concevoir la stratégie pour le marquage de GFP de l’extrémité N-terminale du gène LMNB1. La balise de la GFP a été conçue pour N-terminale d’insertion 5ʹ du premier exon de LMNB1 situé sur le chromosome 5. Homologie des 5ʹ et 3ʹ d’armes sont 1 Ko chacun et se rencontrent entre le codon de début (ATG) et le second codon (armes d’homologie que partiellement représentées dans la figure). Deux candidats crRNAs ont été conçus pour guider Cas9 s’attacher aussi près du site d’insertion prévu que possible, tout en étant unique dans le génome. Séquence pour mEGFP et un éditeur de liens des acides aminés ont été insérées juste 3ʹ du codon start (séquence mEGFP et linker ne pas à l’échelle). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> Figure 2 . Workflow de production endogène tag hiPSC lignées clonales. Composants de transfection, y compris le complexe RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (montré aussi rouge Cas9 protéine avec crRNA or et pourpre tracrRNA), le plasmide de modèle donneur contenant les armoiries d’homologie (HAs, montrés en or) et FP + séquence linker (indiqué en vert), ont été électroporation. Après 4 jours, les cellules positives FP putativement édité ont été enrichies par FACS élargis comme une population de toutes les cellules triées ensemencement dans un seul puits d’une plaque de 96 puits (~ 1 000 cellules) et ensuite élargis en culture jusqu’au travail plusieurs millions d’habitants cellules pourraient être dosés comme la « population enrichie » (voir protocole étape 3,8). Le rendement des cellules positives FP se distingue par l’expérience grâce à des taux variables de HDR12; un enrichissement réussi peut inclure généralement ~ 300-5 000 cellules après la transfection d’environ 1,6 x 106 hanches. Les études d’imagerie préliminaires a confirmé le signal et la localisation de la protéine de fusion dans la population enrichie. Colonies ont été cueillies manuellement dans une plaque à 96 puits pour l’expansion et la cryoconservation. Outre le dépistage génomique contrôle de la qualité à l’aide de gouttelettes digital PCR (ddPCR) et autres analyses PCR a ensuite été utilisé pour identifier des clones édités correctement, comme décrit précédemment12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> Figure 3 . Enrichissement des populations cellulaires putativement edited. (A) écoulement cytometry parcelles de le LMNB1 édité après transfection de cellules quatre jours. L’axe y affiche intensité GFP et l’axe des abscisses avant dispersion. Gates tris ont été définies selon la commande tampon seulement. Puisque les hiPSCs sont sensibles aux perturbations, live/dé tache a été omis et une porte très conservatrice de FSC/SSC a été utilisée à la place. (B) après l’enrichissement, la population de LMNB1 Cr1 édition cellules ont montré environ 90 % des cellules avec GFP localisation à l’enveloppe nucléaire (localisation de LMNB1 attendue). La population contenait des cellules d’intensité variable de GFP ainsi que certaines cellules de GFP-négatif. Barreaux de l’échelle est de 10 microns. (C) après la génération de la lignée clonale, cellules montrent une intensité uniforme de GFP, avec quelques différences dépendant du cycle cellulaire. Barre d’échelle est de 20 microns.

Décrite ici, c’est un protocole pour le marquage de façon endogène des protéines avec des étiquettes fluorescentes dans les cellules souches humaines pluripotentes induites à l’aide de CRISPR/Cas9 exprimées. Cellules putativement édités sont enrichis en triant les cellules fluorescence activé et lignées clonales sont générées.

Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

L’objectif de ce protocole est de générer des cellules souches pluripotentes humaines induites qui expriment des protéines de fusion endogènes fusionnées à des marqueurs fluorescents terminaux N ou C. Pour obtenir le knock-in souhaité, nous utilisons le système CRISPR-Cas9 et une approche basée sur la ribonucléoprotéine utilisant la protéine Cas9 de S. pyogenes de type sauvage et un ARN CRSPR synthétique en deux parties et un ARNr tracr. Ce RNP est co-livré avec la séquence de marquage fluorescent souhaitée en tant que plasmide donneur par électroporation.Les cellules supposément modifiées exprimant la protéine marquée fluorescente sont enrichies par FACS. Des lignes clonales sont ensuite générées pour l’analyse de résultats d’édition précis. Ce protocole d’édition génomique présente de nombreux avantages par rapport aux constructions traditionnelles de surexpression.Parce qu’une étiquette fluorescente est introduite dans le génome, la localisation subcellulaire et la dynamique de la protéine de fusion résultante peuvent être étudiées sous contrôle régulateur endogène. Ici, nous utilisons des cellules souches pluripotentes induites comme système modèle, car cela nous permet d’étudier les protéines marquées dans des cellules diploïdes non transformées. De plus, étant donné que les cellules peuvent être différenciées en plusieurs types de cellules, comme les cellules cardiomyocytaires montrées ici, cette approche offre la possibilité de créer et d’étudier des protéines marquées dans une variété de contextes cellulaires isogéniques.Cependant, avec une optimisation minutieuse, ce protocole pourrait être adapté à l’édition des génomes d’autres types de cellules de mammifères. Bonjour, je m’appelle Amanda Haupt, je fais partie de l’équipe d’édition de cellules souches et de gènes de l’Institut Allen pour les sciences cellulaires. Aujourd’hui, nous avons utilisé cette approche pour générer plus de 35 lignées cellulaires différentes exprimant des protéines de fusion endogènes.Nous les utilisons pour étudier une grande variété de structures et de processus cellulaires uniques. Cette approche a été couronnée de succès pour jusqu’à 95 % des loci tentés à ce jour avec notre groupe. Cette méthode sera particulièrement utile aux biologistes cellulaires qui s’intéressent à mieux comprendre la dynamique d’une protéine dans les cellules vivantes.Cependant, une fois que les lignées clonales modifiées sont générées, les possibilités d’étude sont infinies. Grâce à cette méthode, nous sommes en mesure d’identifier de manière cohérente les clones qui ont des marqueurs de protéines fluorescentes monoalléliques sans aucune autre perturbation de la séquence génomique. Nous sommes également parfois en mesure d’obtenir des clones édités bialléliquement.Dans cette vidéo, nous montrerons quelques-unes des étapes clés de la transfection, de l’enrichissement du FACS et de l’isolement des lignées cellulaires clonales qui expriment des protéines de fusion fluorescentes régulées de manière endogène. Deux à trois heures avant la transfection, traiter les hiPSC avec dix inhibiteurs micromolaires de ROCK ajoutés dans un milieu de croissance. Cela favorisera la survie après l’électroporation.Les cellules auront un aspect hérissé après ce traitement. Les cellules doivent être retirées de la plaque de fermeture du tissu à l’aide d’une seule région de dissociation cellulaire et la suspension cellulaire doit être recueillie dans un tube conique avant la transfection. Préparez une aliquote de 1,84 fois 10 à la puissance six cellules pour chaque condition expérimentale à transfecter.Préparez des tubes complexes de ribonucléoprotéines pour chaque transfection en ajoutant 2,88 microlitres de 10 micromolaires d’ARN guide et 2,88 microlitres de 10 micromolaires Cas9 dans un tube de 1,5 mil. Incuber à température ambiante pendant un minimum de 10 minutes, un maximum d’une heure. Granulez l’aliquote cellulaire préparée à l’étape précédente à 211 fois G pendant trois minutes à température ambiante.Ensuite, aspirez le surnageant et faites tourner la pastille de cellule dans 220 microlitres de tampon d’électroporation. Ajoutez 220 microlitres de cellules en suspension dans le tube complexe RNP de 1,5 mil préalablement préparé. Ajouter 4,6 microlitres d’un microgramme par microlitre de plasmide donneur.À l’aide de l’embout de nucléofection et de la pipette, mélangez les deux contenus deux à trois fois, puis transférez une centaine de microlitres de suspension dans le dispositif d’électroporation préparé. Évitez d’introduire des bulles dans la pointe. Appliquez treize cents volts pour une impulsion de trente millisecondes.Transférez doucement la suspension dans une assiette à six puits avec un mouvement tourbillonnant. Dispersez les cellules en déplaçant doucement la plaque d’un côté à l’autre et d’avant en arrière. Après avoir répété l’opération dans toutes les conditions expérimentales et pour tous les contrôles, incuber des cellules transfectées à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 24 heures, en remplaçant le milieu par un milieu de croissance régulier sans inhibiteur de ROCK à 24 heures.Continuez ensuite à nourrir les hiPSC toutes les 24 heures pendant 72 à 96 heures en surveillant leur confluence. Lorsque les hiPSC atteignent 68 à 80 % de confluence, procéder à l’enrichissement FACS. Deux à trois heures avant la transfection, traiter les hiPSC avec 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK ajoutés dans le milieu de croissance pour favoriser la survie après l’enrichissement en FACS.Pour trier les cellules, retirez-les de la plaque à l’aide du réactif de dissociation de cellule unique, puis filtrez la suspension hiPSC à travers un filtre à mailles de 35 microns dans des tubes à fond rond en polystyrène. Triez les cellules à l’aide de la diffusion vers l’avant et de la diffusion latérale, y compris : hauteur par rapport à largeur, triplets, débris et doublets. Utilisez des cellules de contrôle de tampon en direct uniquement pour définir la porte positive FP, de sorte que moins de 1,1 % des cellules de tampon uniquement se trouvent à l’intérieur de la porte.Lors du tri des cellules souches, adaptez les paramètres de l’instrument pour favoriser la survie cellulaire, comme suggéré dans la section de discussion. Les rendements typiques de cognement, déterminés par le pourcentage de cellules FP positives par FACS, peuvent varier de 0,1 % à 5 %Triez les cellules dans un tube en polypropylène de 1,5 à 15 mil contenant 0,5 à 2 mils de milieu de croissance à température ambiante complété par un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires. Centrifugez les cellules collectées à 211 fois G pendant trois minutes à température ambiante.Aspirez soigneusement le surnageant et mettez à nouveau la pastille cellulaire en suspension dans 200 microlitres de milieu de croissance complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK. Transférez jusqu’à trois mille cellules assorties dans un seul puits d’une plaque fraîche à 96 puits recouverte de matrigel. Incuber des cellules triées à 37 degrés Celsius dans 5 % de CO2 pendant 24 heures, en changeant le milieu en milieu de croissance complété par un inhibiteur de ROCK à 5 micromolaires à 24 heures.Puis à 48 heures, continuer à nourrir les cellules avec des milieux de croissance réguliers, sans inhibiteur de ROCK toutes les 24 heures pendant 72 à 96 heures en surveillant la confluence. Une fois que les cellules sont suffisamment matures pour être évacuées de la plaque à 96 puits, nous vous recommandons de les passer progressivement dans des plaques plus grandes. Ainsi, par exemple, à partir d’un puits d’une plaque de 96 puits, déplacez-les vers un à deux puits d’une plaque de 24 puits.Et puis à partir de là, dans une plaque à 6 puits, et cetera, jusqu’à ce que vous ayez suffisamment de cellules pour les besoins en aval. Généralement trois à quatre millions de cellules minimum. Pour générer des lignées clonales à partir de la population enrichie par FACS de cellules modifiées de manière punitive, le passage en suspension cellulaire unique et la plaque de dix mille cellules sur une plaque de 10 centimètres et permet aux colonies de se développer pendant cinq à sept jours.Lorsque les colonies sont visibles macroscopiquement, elles sont suffisamment grandes pour être isolées. Sur un microscope à dissection, utilisez une pipette P200 pour gratter et aspirer doucement les colonies individuelles de la surface de la plaque. Transférez le volume contenant la colonie dans un seul puits de la plaque de 96 puits.Une fois que toutes les colonies ont été transférées, incubez la plaque dans un incubateur de culture de tissus à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 24 heures. Changer le milieu pour un milieu de croissance régulier sans inhibiteur de ROCK après 24 heures. Continuez ensuite à nourrir les cellules toutes les 24 heures pendant 72 à 96 heures jusqu’à ce que les colonies aient environ triplé de taille.Les cellules devront être cultivées et passées dans des plaques de 96 puits afin d’avoir suffisamment de cellules pour cryoconserver l’antalise pour l’extraction de l’ADN génomique. Voir le protocole écrit pour plus de détails. Pour le passage dans les plaques à 96 puits, utilisez un aspirateur à huit canaux pour retirer et jeter le média de la première colonne.À l’aide d’une pipette multicanaux P200, ajoutez environ 200 microlitres de DPBS dans la première colonne de la plaque pour laver les cellules. À l’aide d’un aspirateur à huit canaux, retirez et jetez le lavage DPBS de la première colonne. Ajoutez ensuite 40 microlitres de réactif de dissociation dans la première colonne.Répétez ces étapes en travaillant une colonne à la fois pour un total de six colonnes de la plaque de 96 puits. Changez les pointes pour vous assurer de ne pas contaminer les puits. Placez la plaque dans l’incubateur pendant trois à cinq minutes à partir du moment où le réactif de dissociation a été ajouté à la première colonne.Lorsque les cellules de la première colonne de la plaque ont commencé à se soulever du fond, utilisez une pipette multicanaux P200 pour ajouter 160 microlitres de DPBS à la première colonne et triturez doucement les cellules dans les positions 12 heures, 3 heures, 6 heures et 9 heures de chaque puits. Transférez tout le volume avec la suspension cellulaire dans une plaque à 96 puits à fond en V. Répétez ces étapes pour les colonnes restantes qui contiennent un réactif de dissociation, en changeant les pointes afin de ne pas contaminer les puits.Faites tourner la plaque inférieure en V de la centrifugeuse à 385 fois G pendant trois minutes à température ambiante. Les sub montrés jusqu’à présent pour le passage de 96 puits sont effectués de la même manière chaque fois que les cellules sont passées dans ce format de plaque. Ensuite, nous vous montrerons comment procéder si vous êtes prêt à cryoconserver les cellules au format 96 puits.Voir le protocole écrit pour plus d’informations. Après l’étape de centrifugation indiquée dans la section précédente, aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette multicanaux P200, puis le remettre en suspension dans 60 microlitres de milieu de croissance complété par 10 micromolaires inhibiteurs de ROCK. Répétez l’opération pour tous les puits, en changeant les pointes afin de ne pas contaminer les données.Transférez 30 microlitres de suspension cellulaire dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits non recouverte de matrigel. Transférez les 30 microlitres de suspension restants dans une plaque sœur, puis ajoutez rapidement 170 microlitres de tampon de congélation dans chaque puits sans mélanger. Notez que ce processus est effectué dans des plaques sœurs dupliquées afin qu’une population de cellules de secours existe après la décongélation de l’une des plaques individuelles.Le fait de placer des cellules cryopréservées dans seulement une colonne sur deux de la plaque de 96 puits permet une décongélation plus rapide. Enveloppez la plaque avec du parafilm et placez-la dans une boîte en polystyrène à température ambiante avec un couvercle. Placez toute la boîte dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius.Après 24 heures, les plaques peuvent être retirées de la boîte en polystyrène et triées à moins 86 degrés Celsius pendant quatre semaines. La cryoconservation de cellules souches pluripotentes humaines induites au format 96 puits permet une pause temporelle dans la culture cellulaire. Le chercheur peut effectuer des tests de validation génomique sur les mines clonales afin d’identifier les clones génétiquement souhaitables à décongeler pour des études futures.Quatre jours après la transfection de la lignée hiPSC WTC avec une protéine d’ARN guide Cas9 spécifique de la cible et un plasmide matrice de donneur soigneusement conçu, on a observé que 0,95 % des cellules exprimaient la GFP. FACS a été utilisé pour trier toutes les cellules positives à la GFP en tant que population enrichie. Des études microscopiques préliminaires ont révélé la localisation attendue de la protéine de fusion de la lamine nucléaire B1 mEGFP dans l’enveloppe nucléaire.La protéine marquée par fluorescence a été observée dans environ 95 % des cellules avec des intensités variables. Après la génération de la lignée clonale, des clones avec une intensité mEGFP uniforme ont été obtenus et analysés plus en détail pour une édition précise. Pour conclure, nous avons montré une méthode de transfection pour l’édition de gènes de cellules souches pluripotentes humaines induites pour l’expression de protéines de fusion fluorescentes régulées de manière endogène.Parce que les inefficacités typiques de cliquetis sont faibles, une stratégie d’enrichissement comme la méthode FACS montrée ici aboutit à une population de cellules supposément modifiées exprimant la protéine de fusion. La population enrichie peut être utilisée pour des études biologiques ou des lignées clonales peuvent être générées comme décrit dans cette méthode, ce qui permet d’identifier des lignées cellulaires qui sont précisément modifiées par des gènes. Il est important de se rappeler que les cassures double brin induites par Cas9 dans le génome sont souvent réparées de manière imprécise malgré l’incorporation de l’étiquette au locus prévu.De plus, dans les clones modifiés monoalléliquement, l’allèle non marqué contient fréquemment des indels probablement causés par une réparation d’assemblage d’extrémité non homologues. Ces résultats soulignent l’importance de la validation génétique après un knock-in de CRISPR Cas9, qui n’a été révélé que par l’analyse du génome de lignées cellulaires clonales. L’expression de la protéine de fusion attendue ne garantit pas à elle seule une édition précise.Lors de l’utilisation de ce protocole pour l’édition de cellules souches pluripotentes induites humaines, veillez à suivre les recommandations détaillées dans le protocole écrit afin d’assurer une manipulation en douceur des cellules pour une survie cellulaire optimale et une différenciation spontanée minimale. Nous espérons que cette vidéo et la liste de protocoles et de matériaux associés vous aideront à réaliser des expériences similaires dans votre propre laboratoire sur votre protéine préférée. Merci d’avoir regardé.

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Les outils d’édition du génome tels que le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associé à CRISPR) ont considérablement amélioré l’efficacité du ciblage génique dans les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Ce manuscrit décrit un protocole permettant de générer un rapporteur hiPSC spécifique à la lignée à l’aide de la recombinaison homologue assistée par le système CRISPR/Cas.

Génération efficace de hiPSC neurones Lineage Reporters Knockin spécifique en utilisant l&#39;CRISPR / Cas9 et Cas9 Système Double Nickase

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