Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

L’objectif de ce protocole est de générer des cellules souches pluripotentes humaines induites qui expriment des protéines de fusion endogènes fusionnées à des marqueurs fluorescents terminaux N ou C. Pour obtenir le knock-in souhaité, nous utilisons le système CRISPR-Cas9 et une approche basée sur la ribonucléoprotéine utilisant la protéine Cas9 de S. pyogenes de type sauvage et un ARN CRSPR synthétique en deux parties et un ARNr tracr. Ce RNP est co-livré avec la séquence de marquage fluorescent souhaitée en tant que plasmide donneur par électroporation.

Les cellules supposément modifiées exprimant la protéine marquée fluorescente sont enrichies par FACS. Des lignes clonales sont ensuite générées pour l’analyse de résultats d’édition précis. Ce protocole d’édition génomique présente de nombreux avantages par rapport aux constructions traditionnelles de surexpression.

Parce qu’une étiquette fluorescente est introduite dans le génome, la localisation subcellulaire et la dynamique de la protéine de fusion résultante peuvent être étudiées sous contrôle régulateur endogène. Ici, nous utilisons des cellules souches pluripotentes induites comme système modèle, car cela nous permet d’étudier les protéines marquées dans des cellules diploïdes non transformées. De plus, étant donné que les cellules peuvent être différenciées en plusieurs types de cellules, comme les cellules cardiomyocytaires montrées ici, cette approche offre la possibilité de créer et d’étudier des protéines marquées dans une variété de contextes cellulaires isogéniques.

Cependant, avec une optimisation minutieuse, ce protocole pourrait être adapté à l’édition des génomes d’autres types de cellules de mammifères. Bonjour, je m’appelle Amanda Haupt, je fais partie de l’équipe d’édition de cellules souches et de gènes de l’Institut Allen pour les sciences cellulaires. Aujourd’hui, nous avons utilisé cette approche pour générer plus de 35 lignées cellulaires différentes exprimant des protéines de fusion endogènes.

Nous les utilisons pour étudier une grande variété de structures et de processus cellulaires uniques. Cette approche a été couronnée de succès pour jusqu’à 95 % des loci tentés à ce jour avec notre groupe. Cette méthode sera particulièrement utile aux biologistes cellulaires qui s’intéressent à mieux comprendre la dynamique d’une protéine dans les cellules vivantes.

Cependant, une fois que les lignées clonales modifiées sont générées, les possibilités d’étude sont infinies. Grâce à cette méthode, nous sommes en mesure d’identifier de manière cohérente les clones qui ont des marqueurs de protéines fluorescentes monoalléliques sans aucune autre perturbation de la séquence génomique. Nous sommes également parfois en mesure d’obtenir des clones édités bialléliquement.

Dans cette vidéo, nous montrerons quelques-unes des étapes clés de la transfection, de l’enrichissement du FACS et de l’isolement des lignées cellulaires clonales qui expriment des protéines de fusion fluorescentes régulées de manière endogène. Deux à trois heures avant la transfection, traiter les hiPSC avec dix inhibiteurs micromolaires de ROCK ajoutés dans un milieu de croissance. Cela favorisera la survie après l’électroporation.

Les cellules auront un aspect hérissé après ce traitement. Les cellules doivent être retirées de la plaque de fermeture du tissu à l’aide d’une seule région de dissociation cellulaire et la suspension cellulaire doit être recueillie dans un tube conique avant la transfection. Préparez une aliquote de 1,84 fois 10 à la puissance six cellules pour chaque condition expérimentale à transfecter.

Préparez des tubes complexes de ribonucléoprotéines pour chaque transfection en ajoutant 2,88 microlitres de 10 micromolaires d’ARN guide et 2,88 microlitres de 10 micromolaires Cas9 dans un tube de 1,5 mil. Incuber à température ambiante pendant un minimum de 10 minutes, un maximum d’une heure. Granulez l’aliquote cellulaire préparée à l’étape précédente à 211 fois G pendant trois minutes à température ambiante.

Ensuite, aspirez le surnageant et faites tourner la pastille de cellule dans 220 microlitres de tampon d’électroporation. Ajoutez 220 microlitres de cellules en suspension dans le tube complexe RNP de 1,5 mil préalablement préparé. Ajouter 4,6 microlitres d’un microgramme par microlitre de plasmide donneur.

À l’aide de l’embout de nucléofection et de la pipette, mélangez les deux contenus deux à trois fois, puis transférez une centaine de microlitres de suspension dans le dispositif d’électroporation préparé. Évitez d’introduire des bulles dans la pointe. Appliquez treize cents volts pour une impulsion de trente millisecondes.

Transférez doucement la suspension dans une assiette à six puits avec un mouvement tourbillonnant. Dispersez les cellules en déplaçant doucement la plaque d’un côté à l’autre et d’avant en arrière. Après avoir répété l’opération dans toutes les conditions expérimentales et pour tous les contrôles, incuber des cellules transfectées à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 24 heures, en remplaçant le milieu par un milieu de croissance régulier sans inhibiteur de ROCK à 24 heures.

Continuez ensuite à nourrir les hiPSC toutes les 24 heures pendant 72 à 96 heures en surveillant leur confluence. Lorsque les hiPSC atteignent 68 à 80 % de confluence, procéder à l’enrichissement FACS. Deux à trois heures avant la transfection, traiter les hiPSC avec 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK ajoutés dans le milieu de croissance pour favoriser la survie après l’enrichissement en FACS.

Pour trier les cellules, retirez-les de la plaque à l’aide du réactif de dissociation de cellule unique, puis filtrez la suspension hiPSC à travers un filtre à mailles de 35 microns dans des tubes à fond rond en polystyrène. Triez les cellules à l’aide de la diffusion vers l’avant et de la diffusion latérale, y compris : hauteur par rapport à largeur, triplets, débris et doublets. Utilisez des cellules de contrôle de tampon en direct uniquement pour définir la porte positive FP, de sorte que moins de 1,1 % des cellules de tampon uniquement se trouvent à l’intérieur de la porte.

Lors du tri des cellules souches, adaptez les paramètres de l’instrument pour favoriser la survie cellulaire, comme suggéré dans la section de discussion. Les rendements typiques de cognement, déterminés par le pourcentage de cellules FP positives par FACS, peuvent varier de 0,1 % à 5 %Triez les cellules dans un tube en polypropylène de 1,5 à 15 mil contenant 0,5 à 2 mils de milieu de croissance à température ambiante complété par un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires. Centrifugez les cellules collectées à 211 fois G pendant trois minutes à température ambiante.

Aspirez soigneusement le surnageant et mettez à nouveau la pastille cellulaire en suspension dans 200 microlitres de milieu de croissance complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK. Transférez jusqu’à trois mille cellules assorties dans un seul puits d’une plaque fraîche à 96 puits recouverte de matrigel. Incuber des cellules triées à 37 degrés Celsius dans 5 % de CO2 pendant 24 heures, en changeant le milieu en milieu de croissance complété par un inhibiteur de ROCK à 5 micromolaires à 24 heures.

Puis à 48 heures, continuer à nourrir les cellules avec des milieux de croissance réguliers, sans inhibiteur de ROCK toutes les 24 heures pendant 72 à 96 heures en surveillant la confluence. Une fois que les cellules sont suffisamment matures pour être évacuées de la plaque à 96 puits, nous vous recommandons de les passer progressivement dans des plaques plus grandes. Ainsi, par exemple, à partir d’un puits d’une plaque de 96 puits, déplacez-les vers un à deux puits d’une plaque de 24 puits.

Et puis à partir de là, dans une plaque à 6 puits, et cetera, jusqu’à ce que vous ayez suffisamment de cellules pour les besoins en aval. Généralement trois à quatre millions de cellules minimum. Pour générer des lignées clonales à partir de la population enrichie par FACS de cellules modifiées de manière punitive, le passage en suspension cellulaire unique et la plaque de dix mille cellules sur une plaque de 10 centimètres et permet aux colonies de se développer pendant cinq à sept jours.

Lorsque les colonies sont visibles macroscopiquement, elles sont suffisamment grandes pour être isolées. Sur un microscope à dissection, utilisez une pipette P200 pour gratter et aspirer doucement les colonies individuelles de la surface de la plaque. Transférez le volume contenant la colonie dans un seul puits de la plaque de 96 puits.

Une fois que toutes les colonies ont été transférées, incubez la plaque dans un incubateur de culture de tissus à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 24 heures. Changer le milieu pour un milieu de croissance régulier sans inhibiteur de ROCK après 24 heures. Continuez ensuite à nourrir les cellules toutes les 24 heures pendant 72 à 96 heures jusqu’à ce que les colonies aient environ triplé de taille.

Les cellules devront être cultivées et passées dans des plaques de 96 puits afin d’avoir suffisamment de cellules pour cryoconserver l’antalise pour l’extraction de l’ADN génomique. Voir le protocole écrit pour plus de détails. Pour le passage dans les plaques à 96 puits, utilisez un aspirateur à huit canaux pour retirer et jeter le média de la première colonne.

À l’aide d’une pipette multicanaux P200, ajoutez environ 200 microlitres de DPBS dans la première colonne de la plaque pour laver les cellules. À l’aide d’un aspirateur à huit canaux, retirez et jetez le lavage DPBS de la première colonne. Ajoutez ensuite 40 microlitres de réactif de dissociation dans la première colonne.

Répétez ces étapes en travaillant une colonne à la fois pour un total de six colonnes de la plaque de 96 puits. Changez les pointes pour vous assurer de ne pas contaminer les puits. Placez la plaque dans l’incubateur pendant trois à cinq minutes à partir du moment où le réactif de dissociation a été ajouté à la première colonne.

Lorsque les cellules de la première colonne de la plaque ont commencé à se soulever du fond, utilisez une pipette multicanaux P200 pour ajouter 160 microlitres de DPBS à la première colonne et triturez doucement les cellules dans les positions 12 heures, 3 heures, 6 heures et 9 heures de chaque puits. Transférez tout le volume avec la suspension cellulaire dans une plaque à 96 puits à fond en V. Répétez ces étapes pour les colonnes restantes qui contiennent un réactif de dissociation, en changeant les pointes afin de ne pas contaminer les puits.

Faites tourner la plaque inférieure en V de la centrifugeuse à 385 fois G pendant trois minutes à température ambiante. Les sub montrés jusqu’à présent pour le passage de 96 puits sont effectués de la même manière chaque fois que les cellules sont passées dans ce format de plaque. Ensuite, nous vous montrerons comment procéder si vous êtes prêt à cryoconserver les cellules au format 96 puits.

Voir le protocole écrit pour plus d’informations. Après l’étape de centrifugation indiquée dans la section précédente, aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette multicanaux P200, puis le remettre en suspension dans 60 microlitres de milieu de croissance complété par 10 micromolaires inhibiteurs de ROCK. Répétez l’opération pour tous les puits, en changeant les pointes afin de ne pas contaminer les données.

Transférez 30 microlitres de suspension cellulaire dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits non recouverte de matrigel. Transférez les 30 microlitres de suspension restants dans une plaque sœur, puis ajoutez rapidement 170 microlitres de tampon de congélation dans chaque puits sans mélanger. Notez que ce processus est effectué dans des plaques sœurs dupliquées afin qu’une population de cellules de secours existe après la décongélation de l’une des plaques individuelles.

Le fait de placer des cellules cryopréservées dans seulement une colonne sur deux de la plaque de 96 puits permet une décongélation plus rapide. Enveloppez la plaque avec du parafilm et placez-la dans une boîte en polystyrène à température ambiante avec un couvercle. Placez toute la boîte dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Après 24 heures, les plaques peuvent être retirées de la boîte en polystyrène et triées à moins 86 degrés Celsius pendant quatre semaines. La cryoconservation de cellules souches pluripotentes humaines induites au format 96 puits permet une pause temporelle dans la culture cellulaire. Le chercheur peut effectuer des tests de validation génomique sur les mines clonales afin d’identifier les clones génétiquement souhaitables à décongeler pour des études futures.

Quatre jours après la transfection de la lignée hiPSC WTC avec une protéine d’ARN guide Cas9 spécifique de la cible et un plasmide matrice de donneur soigneusement conçu, on a observé que 0,95 % des cellules exprimaient la GFP. FACS a été utilisé pour trier toutes les cellules positives à la GFP en tant que population enrichie. Des études microscopiques préliminaires ont révélé la localisation attendue de la protéine de fusion de la lamine nucléaire B1 mEGFP dans l’enveloppe nucléaire.

La protéine marquée par fluorescence a été observée dans environ 95 % des cellules avec des intensités variables. Après la génération de la lignée clonale, des clones avec une intensité mEGFP uniforme ont été obtenus et analysés plus en détail pour une édition précise. Pour conclure, nous avons montré une méthode de transfection pour l’édition de gènes de cellules souches pluripotentes humaines induites pour l’expression de protéines de fusion fluorescentes régulées de manière endogène.

Parce que les inefficacités typiques de cliquetis sont faibles, une stratégie d’enrichissement comme la méthode FACS montrée ici aboutit à une population de cellules supposément modifiées exprimant la protéine de fusion. La population enrichie peut être utilisée pour des études biologiques ou des lignées clonales peuvent être générées comme décrit dans cette méthode, ce qui permet d’identifier des lignées cellulaires qui sont précisément modifiées par des gènes. Il est important de se rappeler que les cassures double brin induites par Cas9 dans le génome sont souvent réparées de manière imprécise malgré l’incorporation de l’étiquette au locus prévu.

De plus, dans les clones modifiés monoalléliquement, l’allèle non marqué contient fréquemment des indels probablement causés par une réparation d’assemblage d’extrémité non homologues. Ces résultats soulignent l’importance de la validation génétique après un knock-in de CRISPR Cas9, qui n’a été révélé que par l’analyse du génome de lignées cellulaires clonales. L’expression de la protéine de fusion attendue ne garantit pas à elle seule une édition précise.

Lors de l’utilisation de ce protocole pour l’édition de cellules souches pluripotentes induites humaines, veillez à suivre les recommandations détaillées dans le protocole écrit afin d’assurer une manipulation en douceur des cellules pour une survie cellulaire optimale et une différenciation spontanée minimale. Nous espérons que cette vidéo et la liste de protocoles et de matériaux associés vous aideront à réaliser des expériences similaires dans votre propre laboratoire sur votre protéine préférée. Merci d’avoir regardé.