Name: Utilisation de la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer l’origine du Syndrome myélodysplasique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Découvrez la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer le potentiel malin des cellules génétiquement modifiées chez la souris. Cette méthode permet d'analyser fonctionnellement les cellules souches cancéreuses et d'identifier les cellules initiatrices de maladie dans les syndromes myélodysplasiques.

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Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Cancer Institute, National Institutes of Health (numéros ZIA SC 010378 et BC 010983 de subventions).

Les procédures animaux décrits dans cet article ont été approuvés par le National Cancer Institute à Bethesda animalier et le Comité de l’emploi et sont conformes aux politiques contenues dans la politique de Service de santé publique sur la santé humaine et de Use of Laboratory Animals, le Loi sur le bien-être des animaux et le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. préparation de la cellule
<ol><li>Récolte cellules nucléées de moelle osseuse (BMNC)<ol>
<li>Utilisez uniquement des matériaux stériles. Stérilisation des instruments réutilisables à l’aide d’un autoclave à vapeur. Acheter des aiguilles, des seringues et vaisselle en plastique dans des contenants stériles à usage unique. Effectuer toutes les manipulations animales et cellulaires en classe II, Type A2 enceinte de sécurité biologique.</li>
		<li>Préparer les BMNCs dans un rond tube inférieur contenant 3 mL de HF2 de 14 mL (Hank équilibré de solution saline additionnée de sérum de veau fœtal 2 %).</li>
		<li>Euthanasier C57Bl6 souris donneur (positifs pour CD45 allèle CD45.2), l’âge généralement de 2 à 6 mois, à l’aide d’une chambre de CO2 .</li>
		<li>Stérilisez la carcasse de la souris en pulvérisant de l’éthanol à 70 % sur tout le corps avec un vaporisateur. Peler la peau des pieds, du bassin jusqu'à la cheville.</li>
		<li>Retirez les fémurs et les tibias de la carcasse à l’aide de ciseaux stériles (droite, pointue/pointue, 11.5 cm) et forceps (Graefe, dentelé, largeur de pointe 0,8 mm). Couper les muscles attenants clairement.</li>
		<li>Couper les extrémités proximales et distales du tibia avec les ciseaux. Tenant le tibia avec une pince, insérez une seringue de 3 mL de calibre 27 contenant 2,5 mL de HF2 dans la cavité de moelle osseuse tibiale à l’extrémité distale du tibia (cheville). Rincer les cellules de la moelle osseuse du tibia à l’aide d’une légère pression dans le rond bas tube de 14 mL.<ol>
<li>Répéter pour l’autre tibia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Couper les extrémités proximales et distales du fémur avec des ciseaux. Rincer la cavité de moelle osseuse du fémur en insérant une aiguille de calibre 20 attaché à une seringue de 3 mL contenant 2,5 mL de HF2 dans l’extrémité distale de la cavité de moelle osseuse du fémur et exerçant une pression modérée sur la seringue.<ol>
<li>Répétez pour l’autre fémur, percevoir toute la moelle osseuse des deux tibias et fémurs dans le même 14 mL rond tube inférieur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Disperser la masse de la moelle osseuse en aspirant de haut en bas plusieurs fois avec la même aiguille de calibre 20, attachée à la seringue de 3 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Souillure de BMNC anticorps<ol>
<li>Comte BMNC. Ajouter 20 µL d’une solution d’acide acétique 3 % à 20 µL de la suspension BMNC générée à l’étape 1.1.8. Ensuite, compter à l’aide d’un hémocytomètre et un microscope inversé.</li>
		<li>Granule le BMNC par centrifugation douce à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot avec HF2 chaque 107 cellules avec 90 µL et 10 µL de biotinylé anti-lignée cocktail s’ajoute la suspension cellulaire.</li>
		<li>Après incubation pendant 20 min à 4 ° C, laver les cellules colorées avec 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
		<li>Resuspendre le BMNC avec 100 µL de HF2 par 107 cellules. Ajouter 2 µL d’allophycocyanin (APC) conjugués d’anticorps anti-biotine de la suspension cellulaire, suivie d’une incubation à 4 ° C pendant 20 min.</li>
		<li>Rincez le BMNC teinté avec 3 mL de PBS et remettre en suspension le BMNC avec HF2 additionné de 0,2 µg/mL d’iodure de propidium (PI) pour écoulement cytometry cellule Tri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flow cytometry cellule Tri des BMNC<ol>
<li>Calibrer le trieur de cellules de cytométrie en flux. Optimiser tous les tubes photomultiplicateurs (PMT), nuages de points XY et paramètres de fluorescence à l’aide de cellules colorées ou non et la valeur dans la gamme linéaire de chaque détecteur.</li>
		<li>Préparer sans coloration, coloration PI et APC libellé lignée cocktails cellules en parallèle à l’étape 1.2. Analyse spectrale indemnisation.</li>
		<li>Cellules de doublet de discrimination par déclenchement séquentiel de FSC-H vs ASC-H, 640-SSC-A vs 640-SSC-H et SSC-640-S vs 640-SSC-W.</li>
		<li>Exclure les cellules non viables à l’aide de PI excité à 561 nm et d’émission recueillies avec un filtre passe bande 614/20. Exciter la lignée APC étiqueté à 640 emission nm et de recueillir les cellules avec un filtre passe bande 671/30.</li>
		<li>Enregistrer les valeurs de fluorescence comme hauteur de tension et recueillir au moins 100 000 événements dans les fichiers de données de mode de liste pour visualiser les populations à trier.</li>
		<li>Calculer les compensations spectrale après l’acquisition de trois échantillons de 10 000 cellules ce qui suit : non cellules PI étiquetés cellules et cocktail d’anticorps anti-lignée conjugué avec APC étiqueté des cellules.</li>
		<li>Set de trois régions pour trier lignée négative (LN), lignée positive (LP) avec l’intensité de la fluorescence dim (LP1) et de la population de LP avec fluorescence brillante (LP2) dans des tubes de 5 mL contenant 0,5 mL de médias FBS de 10 %.</li>
		<li>Cellules de tri à l’aide d’une goutte d’eau un enveloppent et purifient abort mode.</li>
		<li>Effectuer une analyse de type post avec 1 000 cellules totales sur chaque échantillon trié pour confirmer la pureté et la viabilité des cellules triées.</li>
		<li>Prélever des cellules triées par centrifugation à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot cellulaire avec 0,5 mL de HF2.</li>
		<li>Confirmer trié cellule numéro hémocytomètre et le bleu Trypan. Ajuster le nombre de cellules avec HF2 destinés à la transplantation. Remarque : Un large éventail de populations BMNC peut être isolé à la transplantation à l’aide de combinaisons supplémentaires d’anticorps fluorochrome-conjuguées dans temps 1.2.2 ci-dessus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. destinataire souris préparation et Transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)
<ol><li>Préparation des receveurs<ol>
<li>Maintenir les vétérinaires et élevage soin souris bénéficiaires congéniques (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) dans une usine animale (SPF) sans agent pathogène spécifique.</li>
		<li>Pour décontaminer les prophylactique de la voie gastro-intestinale, fournir de l’eau stérile contenant 100 mg/L de la ciprofloxacine aux bénéficiaires pendant 7 jours avant l’irradiation de la dose létale (9 Gy) et maintenir pendant 14 jours après l’irradiation.</li>
		<li>Fournir une irradiation de la dose létale (9 Gy) provenant d’une source de Cs comme suit. Utiliser un opérateur formé et certifié de Cs. Valeur de l’instrument de source Cs pour livrer 70 irradiation gamma corporelle totale de cGy/min. Placer 10 souris dans un support conçu et insérez le support dans la chambre de l’irradiateur. Livrer 9 irradiation corporelle totale de Gy en 13 min et retourner les souris de leur cage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellules souches hématopoïétiques<ol>
<li>Mélanger le type sauvage (WT) BMNC d’une souris congéniques destinataire (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) à la dose de cellules de cellules de 2 x 105 / souris avec 2 à 5 x 104 cellules du test purifié que BMNC préparé avec écoulement cytometry tri comme décrit dans 1.3 ci-dessus. Mélanger les cellules dans la même seringue. Remarque : Le BMNC WT fournissent un épargnant-effet de rayonnement à la souris destinataire et permettre la survie de souris bénéficiaire si les hématies-tests ne supportent pas l’hématopoïèse. Le WT BMNC utilisés dans ce type d’expérience express l’allèle CD45.1 et ainsi peuvent être distinguée des cellules test utilisant des anticorps qui discrimine entre CD45.1 et CD45.2. Les cellules WT BM sont appelés « cellules d’assistance », « cellules de rayonnement d’épargne » ou « cellules concurrent ».</li>
		<li>Ajuster le volume de mélange de cellule à 200 µL par destinataire utilisant HF2 stérile pour faciliter l’injection.</li>
		<li>Transplanter des mélanges de cellules à la mortellement irradiés souris destinataire via intraveineuse queue injection dans la veine à l’aide d’une seringue de 1 mL et une aiguille de calibre 28, moins de 24 h de l’irradiation. Placer la queue de la souris sous une lampe chauffante, comme chaleur mène à la queue des veines dilatées. NOTE : Euthanasier toutes les souris bénéficiaires à la fin de l’étude et d’évaluer la progression de la maladie par l’autopsie, histologie et cytométrie en flux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. greffe dosage utilisant l’écoulement Cytometry
<ol><li>Pour évaluer la greffe de cellules de donneur, recueillir du sang périphérique (PB) des souris bénéficiaires au 6e, 12e semaine et 16 semaines après la transplantation.</li>
	<li>Réchauffer les destinataires dans la cage avec lampe chauffante pendant environ 1 min et placez la souris sur une drisse.</li>
	<li>Couper la veine caudale avec un scalpel (lame 10, manche de bistouri #3) et prélever 100 µL de PB par destinataire à l’aide d’un tube microcapillaire contenant de l’EDTA comme anticoagulant.</li>
	<li>Diviser le PB recueillie en deux portions égales en plaçant 50 µL dans un tube stérile microcentrifugeuse. Utiliser une aliquote pour une numération formule sanguine complète automatisée (CBC) (effectuée à la base de l’histopathologie de NCI) et utiliser la deuxième portion d’anticorps et cytométrie en flux.</li>
	<li>Pour détecter la prise de greffe de donneur par cytométrie en flux, lyser les globules rouges (RBC) en ajoutant 1 mL de tampon de lyse hypotonique RBC (8,29 g/L de NH4Cl, 1 g/L de KHCO3, 0,037 g/L de Na2EDTA, pH 7,2) à 50 µL de la PB collectée. Vortex de l’échantillon à mélanger et incuber 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger le PB lysé à 4 600 x g pour 1,5 min. doucement aspirer le surnageant et jetez-le.</li>
	<li>Partiellement perturber le culot cellulaire en douceur touchant ou « pichenette » le fond du tube. Ajouter 1,3 mL de PBS dans le culot est situé dans le tube et centrifuger à 4 600 x g pendant 1,5 min, soigneusement aspirer et jeter le surnageant.</li>
	<li>Perturber le culot cellulaire en touchant ou en effleurant et ajouter 200 µL de HF2 additionnée de 5 % de sérum de rat au culot cellulaire.</li>
	<li>Ajouter des anticorps anti-CD45.2 (1 µL) avec allophycocyanin (APC) à la suspension cellulaire. Incuber à 4 ° C pendant au moins 30 min et brièvement vortex le mélange.</li>
	<li>Après la coloration, laver les cellules deux fois comme décrit ci-dessus et remettre en suspension avec 400 µL du HF2 additionné de 1 µg/mL de PI.</li>
	<li>Détecter la prise de greffe à l’aide d’un cytomètre en flux de 4 couleurs. Obtenir des informations supplémentaires sur les types de cellules dans le sang périphérique en ajoutant d’autres anticorps pour détecter les types de cellules spécifiques, telles que les lymphocytes B ou T.</li>
	<li>Enregistrer des données de série prise de greffe à l’aide d’un tableur pour permettre une analyse plus approfondie des données.</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
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<li>Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+features+of+myelodysplastic+syndromes%3A+results+from+regional+cancer+surveys+and+hospital-based+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics.</a> International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).</li>
<li>Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+genetic+pathways+and+cooperating+genetic+abnormalities+in+the+pathogenesis+of+therapy-related+myelodysplasia+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).</li>
<li>Uy, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+clonal+structure+of+MDS+and+AML+in+response+to+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy.</a> Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).</li>
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<li>Thanopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+NOD%2FSCID-beta2+microglobulin+null+mice+with+multilineage+neoplastic+cells+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).</li>
<li>Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+distinct+clonal+MDS-derived+hematopoietic+precursors+in+NOD%2FSCID-beta2-microglobulin-deficient+mice+after+intramedullary+transplantation+of+hematopoietic+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells.</a> Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).</li>
<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

Bien que MDS sont une maladie clonale de cellules souches hématopoïétiques, le MDS « stem », ou initiatrice des cellules, n’ont pas encore été caractérisées. Nous avons démontré précédemment que SDM peut être transplantables à souris WT à l’aide de la moelle osseuse de souris NHD13 par tcsh, caractérisée par une anémie macrocytaire, leucopénie, neutropénie et des preuves morphologiques de dysplasie15. En outre, des essais de repeuplement concurrentiel identifié un avantage de croissance des cellul...

Syndromes myélodysplasiques (SMD) représentent un ensemble diversifié de clonale hémopathie caractérisée par l’hématopoïèse inefficace, les preuves morphologiques de la dysplasie et une propension à la transformation de la leucémie myéloïde aiguë (AML)1,2 ,3,4. Hématopoïèse inefficace est reconnu comme un arrêt de la maturation dans la moelle osseuse et les résultats dans le sang périphérique des cytopénies malgré une hypercellulaire moelle1,3. L’incidence du MDS a été diversement estimée comme 2-12 cas pour 100 000 personnes chaque année aux Etats-Unis, et l’incidence de la MDS augmente avec l’âge, ce qui en fait une condition importante à comprendre étant donné le vieillissement de la population des États-Unis3, 5. Bien que la plupart des cas de MDS n’ont aucune étiologie clair, certains cas de MDS sont censés être en raison de l’exposition à des agents génotoxiques connues, y compris les solvants comme le benzène et le cancer chimiothérapie6.
Les patients MDS en général ont acquis des mutations dans les cellules de SDM7. Bien que relativement rare, un certain nombre de patients de SDM ont acquis équilibrée des translocations chromosomiques impliquant des gènes tels que NUP98, EVI1, RUNX1 et MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Notre laboratoire s’intéresse depuis longtemps à des translocations chromosomiques, qui impliquent la de gène NUP988. Souris transgéniques qu’exprimer un transgène NUP98-HOXD13 (NHD13) réglementés par le promoteur Vav1 et éléments activateurs affichent toutes les fonctionnalités clées de SDM, y compris les cytopénies périphériques de sang, des preuves morphologiques de dysplasie et transformation d’AML9 .
Bien que MDS ont été reconnus pour les plus de 60 ans10et sont considérés comme une maladie clonale de cellules souches, efforts pour greffer des cellules humaines de MDS dans des souris immunodéficientes ont été en grande partie échoués, parce que les cellules MDS greffer mal11, 12,13,14 et les souris ne développent pas la maladie clinique. Dans le but d’identifier les cellules hématopoïétiques peuvent transmettre MDS, nous s’est tourné vers le modèle de NHD13 et a montré que nous pourrions greffer SDM comme une entité pathologique qui a montré toutes les fonctionnalités de cardinales de MDS humaine, y compris le sang périphérique cytopénies, dysplasie, et transformation d’AML15. Dans ce rapport, nous présentons les détails techniques de ces expériences, mais aussi des approches de fractionner davantage les souches hématopoïétiques et cellules précurseurs (CSPH), dans un effort pour identifier les cellules qui lance MDS.

<table><tbody><tr><td>Tube à fond rond de 14 mL</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s solution saline équilibrée</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD45.2</td><td>Southern Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOT# A077-T044O</td></tr><tr><td>Seringue de 3 mL</td><td>Monoject</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de 27 G</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de 20 G</td><td>BD</td><td></td><td></td>305176</tr><tr><td>Lineage Cocktail</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOT# 5170418221</td></tr><tr><td>Anticorps anti-biotine</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOT# 5171109046</td></tr><tr><td>1 mL Seringue</td><td>Excelint</td><td>26027</td><td>Seringue à insuline</td></tr><tr><td>Lampe chauffante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>CAFS machine</td><td>Cytec</td><td>FACScan</td><td>2 lasers, 5 détecteurs de couleur</td></tr><tr><td>Instrument de tri FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5 lasers, 23 paramètres, 6 tri simultané de la population Iodure</td></tr><tr><td>de propidium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Irradiateur gamma</td><td>Best Theratronics</td><td>Gammacell 40</td><td></td></tr><tr><td>Tube de prélèvement sanguin</td><td>RAM scientific</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>Destinataire souris</td><td>Charles River</td><td>B6-LY5.1/Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 souris</td><td>n/a</td><td>C57Bl/6, CD45.2</td><td>Colonie maintenue au NIH</td></tr><tr><td>5 mL tube à fond rond</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer l’origine du syndrome myélodysplasique

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Syndromes myélodysplasiques (SMD) forment un groupe diversifié de troubles de cellules souches hématopoïétiques qui sont définies par l’hématopoïèse inefficace, sang périphérique cytopénies, dysplasie et une propension à la transformation en leucémie aiguë. NUP98-HOXD13 (NHD13) de souris transgéniques récapitulent MDS humaine en termes de sang périphérique cytopénies, dysplasie et transformation en leucémie aiguë. Nous avons démontré précédemment que MDS pouvaient être transférés d’une souris génétiquement modifiée avec MDS aux destinataires sauvage par la transplantation de cellules de la moelle osseuse nucléée MDS (BMNC). Pour mieux comprendre la cellule MDS d’origine, nous avons développé des approches spécifiques de transplantation, immunophenotypically défini sous-ensembles hématopoïétiques. Dans cet article, nous décrivons le processus d’isolement et le repiquage des populations spécifiques de souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices. Après transplantation, nous décrivons les approches pour évaluer l’efficacité de la transplantation et la persistance des cellules donneur MDS.

Nous montrons des chiffres représentatifs des résultats de plusieurs expériences. La figure 1 montre une cytométrie de flux représentant tri experiment. Au cours de la différenciation hématopoïétique normale, comme cellules de sont engager à une lignée hématopoïétique spécifique, ils acquièrent des marqueurs définissant le lignage de surface cellulaire et perdent le potentiel de l’auto-renouvellement. Par conséquent, chez les souris de type sauvage, autorenou...

Les auteurs décrivent l’utilisation de greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour évaluer le potentiel maligne de cellules hématopoïétiques génétiquement. TCSH est utile pour évaluer les diverses cellules hématopoïétiques malignes in vivo comme générant une grande cohorte de souris atteintes de leucémie ou de syndromes myélodysplasiques (SMD) afin d’évaluer de nouveaux traitements.

Utilisation de la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer l’origine du Syndrome myélodysplasique

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Cette méthode peut aider à répondre à quelques questions dans la méthode de champ de malignité sur la caractérisation d’une cellule qui initie une malignité. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une base pour l’analyse fonctionnelle de ces cellules souches cancéreuses. Les implications de cette technique s’étendent à l’endroit où la thérapie des syndromes myélodysplastic ou MDS, car elle peut aider à l’identification des cellules initiatrices de la maladie.Pour préparer les receveurs au transfert adoptif, une semaine avant la greffe fournir de l’eau stérile complétée par 100 milligrammes par litre de ciprofloxacine aux animaux receveurs congéniques pendant sept jours dans une installation animale spécifique et exempte d’agents pathogènes. Le septième jour, avoir un opérateur de césium 17 formé et certifié a placé l’instrument source de césium pour livrer 70 centigrayS de l’irradiation gamma totale du corps par minute. Placez 10 souris dans un support sur mesure.Insérez le support dans la chambre irradiateur, livrer 9 gris irradiation totale du corps en 13 minutes. Ensuite, retournez les animaux dans leurs cages. Le lendemain matin, vaporiser 70 pour cent d’éthanol sur un ensemble de deux à six papillons de nuit vieux C57 noir six souris et utiliser des ciseaux pour enlever la peau du bassin aux chevilles.Utilisez des forceps avec les ciseaux pour enlever le femora et le tibia. Coupez proprement les muscles des os. Couper les extrémités proximales et distales pour le tibia et ramasser un tibia avec des forceps.Insérez une seringue de trois millilitres munie d’une aiguille de 27 gages dans la cavité de la moelle osseuse et rincez la moelle osseuse dans un tube de fond rond de 14 millilitres contenant 2,5 millilitres de solution saline tamponnée Hanks complétée par un sérum bovin fœtal de 2 % ou HF2. Lorsque toute la moelle a été recueillie, aspirer le tissu plusieurs fois à travers la pointe de l’aiguille de 20 gages pour disperser la masse de moelle en une seule suspension pour le comptage. Pour étiqueter les cellules nucléées de moelle osseuse, ou BMNC, pour le tri d’écoulement, recueillir les cellules par centrifugalisation et suspendre à nouveau la pastille à une fois dix à la septième BMNC par 90 microlitres de concentration de HF2.Ensuite, ajoutez dix microlitres d’un cocktail biotinylé anticorps anti-lignée à la suspension cellulaire pendant 20 minutes d’incubation à 4 degrés Celsius. Suivi d’un lavage centrifugeuse en trois millilitres de PBS. Suspendre à nouveau la pastille dans 100 microlitres de HF2 par une fois dix à la septième cellule.Étiquetez ensuite les cellules avec deux microlitres d’anticorps anti biotine conjugué APC. Après 20 minuets à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière, laver les cellules en trois millilitres de PBS frais. Suspendre à nouveau la pastille en HF2 complétée par 0,2 microgramme par millilitre d’iodure de propidium sur la glace.Calibrez maintenant le trieur de cellules de cytométrie d’écoulement à l’aide de cellules non tachées afin d’optimiser tous les paramètres de tubes, de dispersion et de fluorescence photomultipliers dans la plage linéaire de chaque détecteur. Acquérir trois échantillons de 10 000 cellules pour les cellules étiquetées APC non étiquetées, étiquetées PI et antilité. À la fin du tri, analyser 1000 cellules de chaque échantillon pour confirmer la pureté et la viabilité des cellules triées.Faites tourner les échantillons dans la centrifugeuse. Puis suspendre à nouveau les granulés dans 0,5 millilitres de HF2 pour le comptage. Pour le transfert adoptif des cellules triées, mélanger 100 microlitres de deux fois le BMNC de type sauvage à partir d’un animal receveur congénique dans le HF2 stérile.Avec 100 microlitres de deux à cinq fois dix à la quatrième, le donneur trié BMNC d’intérêt dans HF2 stérile dans un tube de micro centrifugeuse par animal receveur. Chargez une seringue d’un millilitre, équipée d’un gage de 28 gages par destinataire avec 200 microlitres de cellules. Ensuite, placez les souris bénéficiaires sous une lampe thermique pour induire la dilatation de la veine de la queue.Livrer les mélanges cellulaires à chaque animal receveur irradié mortellement par la veine de la queue. Comme l’auto-renouvellement des cellules souches se limite à la lignée négative de type sauvage BMNC, la lignée négative, faible lignée positive, et la lignée élevée cellules positives sont triés et transplantés dans des receveurs de type sauvage pour déterminer la capacité d’auto-renouvellement de chaque population cellulaire. Le BMNC transgénéticien de donneur transplanté d’adoption des animaux modèles de MDS peut être distingué ex vivo par leur expression de marqueur de surface cellulaire CD45.2.Par 16 semaines après transplantation de la lignée négative BNMC, ou BMNC non triés des animaux transgéniques de donateur de MDS, les cellules transgéniques dehors concurrencent les cellules sauvages-type comme démontré par un pourcentage croissant des cellules positives de donneur de CD45.2, observées dans le sang périphérique des animaux destinataires mortellement irradiés. Ici, les cellules d’une transformation leucémique d’une souris transplantée avec des cellules TRANSGÉNIQUES MDS sont montrées. Notez la présence de nombreuses explosions et formes immatures.Tout en essayant la procédure, il est important de se rappeler de limiter le temps de manipulation ex vivo, car il peut placer un stress indu sur les cellules, entraînant la mort cellulaire ou la perte fonctionnelle. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs du programme sur le terrain, pour mettre en malignité d’explorer la source de la maladie chez les souris génétiquement modifiées.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ce protocole décrit la dérivation de cellules souches hématopoïétiques transplantables à partir des cellules souches embryonnaires de souris (CES) et leur injection ultérieure dans des souris irradiées de façon létale bénéficiaires. Brièvement, l'ESC sont différenciées comme des corps embryoïdes, qui sont ensuite infectées par HOXB4 rétroviraux et co-cultivées avec des cellules stromales et OP9 cytokines hématopoïétiques.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

Ce protocole fournit des directives étape par étape pour la mise en place d’expériences compétitives de greffe de moelle osseuse de souris afin d’étudier la fonction des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques sans purification préalable des cellules souches par tri cellulaire.

Transplants concurrentiels pour l&#39;évaluation des cellules souches hématopoïétiques de remise en forme

Quantification des cellules dérivées de donateurs est nécessaire pour contrôler la prise de greffe après greffe de cellules souches chez les patients atteints d’hémoglobinopathies. Une combinaison de tri de cellule axée sur la cytométrie en flux, analyse de la formation de colonie et analyse subséquente du tandem courte répétitions peuvent être employées pour évaluer la prolifération et la différenciation des cellules souches dans le compartiment érythroïde.

Détection de cellules progénitrices de donateurs résiduelle érythroïdes après Transplantation de cellules souches hématopoïétiques pour les Patients ayant des hémoglobinopathies

Détection de la maladie résiduelle minime ou mesurable (MRD) est un biomarqueur pronostique important pour affiner l’évaluation des risques et de prédire les rechutes dans la leucémie myéloïde aiguë (AML). Ces lignes directrices exhaustives et recommandations avec les meilleures pratiques d’identification cohérente et précise et de détection du MRD, peut aider à prendre des décisions de traitement efficaces AML.

Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

Nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée des marqueurs de cellules souches de la leucémie sur les cellules de la leucémie myéloïde aiguë primaire par cytométrie en flux. Nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes.

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

Le diagnostic MDS est difficile en l’absence de critères morphologiques ou cytogénétique non informatif. MFC pourrait aider à affiner le processus de diagnostic de MDS. Pour devenir utile pour la pratique clinique, l’analyse MFC doit reposer sur des paramètres avec une spécificité et une sensibilité suffisante, et les données doivent être reproductibles entre les différents opérateurs.

Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires

Ici, nous décrivons un protocole simple pour l’isolement et la coloration des cellules de moelle osseuse murine en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques phénotypiques ainsi que les cellules souches endothéliales et mésenchymateuses de niche. Une méthode d’enrichissement des cellules situées dans les zones endostéales et centrales de la moelle osseuse est également incluse.

Analyse par cytométrie en flux de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de moelle osseuse murine et de cellules de niche stromale

Un protocole détaillé pour isoler et caractériser les populations microenvironnementales de moelle osseuse à partir de modèles murins de syndromes myélodysplasiques et de leucémie myéloïde aiguë est présenté. Cette technique permet d’identifier les changements dans la niche de la moelle osseuse non hématopoïétique, y compris les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, avec la progression de la maladie.

Identification des populations microenvironnementales de moelle osseuse dans le syndrome myélodysplasique et la leucémie myéloïde aiguë

Les injections intrafémorales permettent la greffe d’un petit nombre de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC), en plaçant les cellules directement dans la cavité de la moelle osseuse. Nous décrivons ici un protocole expérimental d’injection intrafémorale de HSPC humaines chez des souris immunodéficientes.

Injection intrafémorale de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines chez des souris immunodéprimées 

Découvrez la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer le potentiel malin des cellules génétiquement modifiées chez la souris. Cette méthode permet d'analyser fonctionnellement les cellules souches cancéreuses et d'identifier les cellules initiatrices de maladie dans les syndromes myélodysplasiques.

Utilisation de la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer l’origine du Syndrome myélodysplasique

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