Name: Une méthode de Culture Proximal pour étudier la signalisation Paracrine entre cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Découvrez une méthode de culture proximale pour étudier la signalisation paracrine entre cellules cancéreuses ovariennes et le microenvironnement tumoral. Cette technique simple et reproductible isole les effets paracrines sans contact direct cellulaire.

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Nous sommes redevables aux patients pour leur participation à la collection de tissus pour ces expériences. Un DoD OCRP Ovarian Cancer Academy Award (W81XWH-15-0253) et un prix pilote de la Fondation de Colleen rêve d’un Anirban K. Mitra prise en charge de cette recherche.

Le protocole suit les directives du Conseil réglementaire institutionnel de l’Université Indiana.
1. préparation de la cellule
<ol><li>
Isolement et culture des cellules mésothéliales primaires humaines
	<ol>
<li>Toutes les isolat primaires mesothelial cellules humaines (HPMCs) d’épiploon humaine telle que décrite précédemment17,18 et de les cultiver en milieu [de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) contenant du sérum de veau fœtal 10 %, 1 % de la croissance pénicilline-streptomycine, 1 % des acides aminés non essentiels et les vitamines 1 %] à 37 ° C et 5 % de CO2. Remarque : Les HPMCs sont généralement cultivés au confluent de 100 % (Figure 1 a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Conditions de croissance des cellules de cancer de l’ovaire
	<ol>
<li>La croissance de cellules de cancer de l’ovaire HeyA8 dans un milieu complet de croissance à 37 ° C et 5 % de CO2. Remarque : Utilisation HeyA8 cellules cultivées à environ 80 % de confluence (Figure 1 b).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Culture cellulaire
<ol><li>
Set-up proximale de la culture
	<ol>
<li>Utilisation Transwell insère pour plaques 6 puits avec une membrane de 10 μm d’épaisseur tissu-culture-traitée en polycarbonate avec 0,4 μm pores (108 pores/cm2) et une zone de croissance de2 cm de 4,67. Le cas échéant, optimiser pour insertion de différentes tailles en réduisant le nombre de cellules ensemencées selon la surface de croissance. Milieu de culture complet chaud, la trypsine et solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer les inserts
	<ol>
<li>Pour amorcer les cellules HeyA8 sur la surface inférieure de la membrane de l’insert, retirez l’insert de son emballage à l’aide de la pince stérile et placez-le en position inversée dans une boîte de Petri stérile de 15 cm.</li>
		<li>Utilisez un plat de 15 cm, car il a la profondeur pour accueillir le foyer inversé, ou remplacer par n’importe quel récipient stérile. Selon l’expérience, placer le nombre requis d’insertions dans le plat de 15 cm.</li>
		<li>Étiqueter les trois contrôles et trois conditions expérimentales en conséquence avec un marqueur sur le bord des inserts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer les cellules cancéreuses
	<ol>
<li>Trypsinize les HeyA8 les cellules cultivées à confluence de 80 % dans un ballon jaugé de 25 cm2 (~ 2 x 106 cellules), ajouter 1 mL de la trypsine (0,25 %) pour 40 à 60 s et neutraliser la trypsine avec 6 mL de milieu de culture complet.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 500 g à la température ambiante (RT) pendant 3 min, jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu de culture complet. Compter les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensemencer les cellules cancéreuses
	<ol>
<li>Suspendre 100 000 cellules/mL de cellules vivantes de HeyA8 dans le milieu de culture complet. Soigneusement les semences 80 000 cellules HeyA8 suspendus en 800 μL de milieu de culture complet sur le fond de l’insert (qui est maintenant vers le haut, car il est inversé).</li>
		<li>Les semences des cellules pour former une forme de dôme-comme si les cellules restent sur l’insert (Figure 1). Démarrez à partir du centre de la membrane et se déplacer vers l’extérieur en cercles concentriques tandis que lentement pipetage. Éviter d’aller plus de 3 mm du bord afin d’éviter toute effusion du milieu. Remarque : Le nombre de cellules ensemencées dépendra du taux de croissance des cellules et la durée de l’expérience. Le nombre de cellules HeyA8 ensemencées pour cette culture proximale ont été optimisé et les cellules seront confluente de 80 à 90 % à la fin de la troisième journée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixation des cellules du cancer
	<ol>
<li>Couvrir le plat de 15 cm et déplacer délicatement le plat contenant les inserts à l’incubateur à CO2 . On critique ne pas de perturber la goutte de milieu et cellules sur l’insert à cette étape. Laissez les cellules à 37 ° C pendant 4 h permettre les cellules cancéreuses attacher à l’insert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer les cellules mésothéliales
	<ol>
<li>Après environ 4 h, trypsinize les HPMCs cultivés au confluent de 100 % dans une fiole de2 75 cm (~ 4 x 106 cellules) avec 2 mL de trypsine (0,25 %) pendant 1 à 2 min et neutraliser la trypsine avec 12 mL de milieu de culture complet.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 500 x g RT pendant 3 min, resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture complet et compter les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensemencement des cellules mésothéliales
	<ol>
<li>Suspendre les 300 000 cellules/mL d’HPMCs direct dans le milieu de culture complet. Ajouter 2,5 mL de milieu de culture complet frais dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Soigneusement mettre le plat de 15 cm contenant les inserts sur la hotte de la prévention des risques biotechnologiques. À l’aide d’une pince stérile, retourner l’insert et placez-le dans le puits de la plaque 6 puits afin qu’elle soit verticale, avec les cellules de HeyA8 attachés à la surface inférieure, immergée dans le milieu de culture complet (Figure 1).</li>
		<li>HPMCs graine 450 000 suspendus dans 1,5 mL de milieu de croissance à l’intérieur des inserts avec les cellules de HeyA8 attachés à la surface vers le fond du puits (Figure 1) ou à plaquettes sans les cellules HeyA8 pour les contrôles HPMC. Ajouter 1,5 mL de milieu de culture sans cellules aux contrôles HeyA8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De plus en plus la culture proximale
	<ol>
<li>Laissez la culture proximale pousser dans l’incubateur à CO2 à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 72 h. Si nécessaire, le support peut être réapprovisionné comme suit.<ol>
<li>Pour l’intérieur de l’insert, retirer 750 µL et ajouter 750 µL de milieu de culture complet frais.</li>
			<li>Pour l’extérieur de l’insert (la plaque 6 puits), prélever 1 mL et ajouter 1 mL de milieu de culture complet frais. Le mL 1 a été choisie pour la commodité de changer le support en une seule étape. Si vous le souhaitez, 1,25 mL peut être enlevé et remplacé à la place.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Le prélèvement de cellules
	<ol>
<li>Recueillir les cellules après 72 h de culture proximale. Faites attention à cette étape afin d’éviter la contamination croisée des cellules HeyA8 et HPMCs. Trypsinize les cellules, centrifuger eux et lyser le culot au lieu de lyser les cellules sur la membrane afin d’éviter une contamination croisée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trypsinisation des cellules
	<ol>
<li>Rincer les deux côtés de l’insert avec du PBS 1 x.</li>
		<li>Les inserts de transfert d’un nouveau puits et ajouter la trypsine. Ajouter 0,5 mL de trypsine à l’intérieur de l’insert et ajouter 2 mL de trypsine à la plaque de 6 puits à trypsinize les cellules cancéreuses, attachés à la face inférieure de l’insert. Incuber la plaque pendant 2 min à 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Neutralisation de la trypsine
	<ol>
<li>Ajouter 1 mL de milieu de culture complet à l’intérieur de l’insert pour neutraliser la trypsine, pipette de haut en bas, puis prenez les cellules et transférez-les sur un tube de prélèvement étiquetées. Ajouter 2 mL de milieu de culture complet pour une neutralisation complète supplémentaire. Il faut ne pas de percer la membrane lors de pipetage pour éviter une contamination croisée des cellules.</li>
		<li>Afin de recueillir les cellules sur le fond de l’insert, distribuer la trypsine de 2 mL qui a été ajoutée à l’étape 12,2 sur la surface inférieure 2 – 3 x afin que les cellules entrent dans la partie inférieure de la plaque 6 puits. Neutraliser la trypsine sur le fond de la plaque avec 6 mL de milieu de croissance et transférer le contenu de la plaque dans un tube de prélèvement étiquetées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collecte et lyser les cellules
	<ol>
<li>Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 3 min et aspirer les médias. Resuspendre et lyser les granules cellulaires avec 0,7 mL de réactif de lyse phénol guanidine thiocyanate-base et pour l’extraction de l’ARN. Isoler l’ARN à l’aide de n’importe quel kit adapté.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction
Remarque : Les étapes suivantes décrivent une quantitative PCR en temps réel (qPCR) pour étudier les changements d’expressions de gène à la suite de la culture proximale.
<ol><li>Préparer les ADNc provenant des échantillons d’ARN pour qPCR. Utiliser n’importe quel convenable de la transcriptase inverse avec un tampon correspondant et amorces aléatoires afin d’assurer la transcription inverse de tous les ARNm (voir Table des matières).</li>
	<li>Évaluer les changements dans les niveaux d’expression de mRNA de la fibronectine (FN1) et de la E-cadhérine (CDH1) et transformer le facteur de croissance bêta 1 (TGFβ1) par qPCR avec glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) comme un contrôle interne. Il est possible d’utiliser normalisé essais d’expression de gène disponibles dans le commerce (voir Table des matières) ou de concevoir des amorces.</li>
	<li>Comparer les HeyA8 de cellules cultivées en proximal avec HPMCs avec les commandes HeyA8 et les HPMCs cultivés en proximal avec les contrôles HPMC.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Cupedo, T., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+in+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions in lymph node development.</a> The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).</li>
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<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+reprogram+normal+fibroblasts+into+cancer-associated+fibroblasts+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).</li>
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<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+downregulation+of+miR-193b+drives+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis.</a> Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).</li>
<li>Tomar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS1+induction+by+the+microenvironment+promotes+ovarian+cancer+metastasis+through+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase.</a> Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).</li>
<li>Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from:
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<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).</li>
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<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comprendre le mécanisme de paracrine et juxtacrine de signalisation entre les cellules est essentielle pour développer une meilleure connaissance du tissu normal homéostasie et maladie conditions7,8. Plupart paracrine signalisation études sont menées en recueillant conditionné milieu à partir d’un type de cellule et l’utiliser pour traiter l’autre type de cellule. Cette méthode a un avantage dans sa simplicité inhérente. Cependant, ce ne pas exactement récapitule...

Le rôle des interactions réciproques productives entre cellules cancéreuses et le microenvironnement tumoral dans la progression tumorale a été clairement établi et est devenu un axe majeur de la recherche en biologie de cancer1. Des cas semblables de bidirectionnel de signalisation sont essentiels pendant la cicatrisation, les réponses immunitaires, angiogenèse, niches de cellules souches et développement2,3,4,5,6 , 7 , 8. un thème commun à tous ces processus biologiques, c’est que les cellules réagissent de différentes façons à des signaux extracellulaires de leur microenvironnement qui déterminent le sort de la cellule, physiologie des tissus et progression de la maladie. Par conséquent, l’accent a plus en plus tourné vers l’élaboration d’une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les communications de ces cellules. Une majorité de ces interactions impliquent paracrine ou juxtacrine de signalisation entre les cellules. Signalisation paracrine implique la sécrétion de facteurs de signalisation spécifiques par une cellule qui sont perçus par des récepteurs correspondants sur une autre cellule dans les environs, déclenchant une réaction dedans9,10, tandis que juxtacrine signalisation nécessite un contact direct entre les composants cellulaires des deux cellules impliqués11,12.
Cette signalisation est une composante essentielle dans l’homéostasie tissulaire, ainsi que dans le microenvironnement tumoral. Les cellules cancéreuses bénéficient de facteurs paracrines et juxtacrine des cellules dans le stroma tumoral, y compris les fibroblastes associés au cancer (CAFs), les cellules immunitaires et les adipocytes13,14,15,16. Le paracrine signalisation peut être médiée par des facteurs de croissance, cytokines, chimiokines, etc., tandis que la signalisation juxtacrine implique des ligands juxtaposés et récepteurs comme signalisation Notch, ou les interactions entre les intégrines et leurs respectifs protéines de la matrice extracellulaire. Nous avons démontré l’importance des interactions réciproques entre les cellules de cancer de l’ovaire et CAFs en tumeur la progression et la métastase14. De même, les interactions entre les cellules métastases de cancer de l’ovaire avec les cellules mésothéliales portant sur le site de la métastase réglementent les microARN clés et facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses qui favorisent la colonisation métastatique17, 18.
La plupart des études sur la signalisation paracrine impliquent l’utilisation d’un milieu conditionné prélevé sur un type de cellule pour traiter le deuxième type de cellule avec. Bien que cette approche a été largement utilisée, il ne réplique pas efficacement les niveaux de haute concentration localisées du facteur sécrété dans le microenvironnement de la cellule réceptrice. Aussi, il ne parvient pas à reproduire la cinétique de l’écoulement continu du facteur sécrété produit par une cellule et reçue par la cellule voisine. Paracrine signalisation est efficace sur de courtes distances, comme les facteurs sécrétés sont aux concentrations requises uniquement dans le voisinage de la cellule source et ont tendance à diffuser et diluer à mesure que la distance augmente. Cette forte concentration localisée du facteur sécrété est indispensable pour déclencher une réponse dans la cellule réceptrice. En outre, la réponse dans les cellules réceptrices dépend aussi l’équilibre des facteurs nouvellement sécrétées et leur épuisement continu par le biais de dégradation, une liaison et internalisation dans les cellules réceptrices et la diffusion de la cellule source. Un milieu conditionné peut être concentré pour tenir compte des plus fortes concentrations localisées présentes dans le micro-environnement, mais qui ne peut pas reproduire avec précision les concentrations exactes. En outre, il ne peut pas imiter la cinétique naturelle de la production et l’épuisement du facteur impliqué. Pour mieux reproduire la signalisation paracrine et séparer de juxtacrine mécanismes de signalisation, nous avons mis au point une méthode de culture de proximal roman, ce qui implique de plus en plus les deux types de cellules sur chaque surface d’une membrane poreuse. Les pores sont suffisamment petits pour empêcher les interactions juxtacrine et encore permettre l’échange de facteurs sécrétés à des concentrations élevées localisées. De cette manière, ce système conserve la cinétique de la production et l’épuisement des facteurs paracrines.

<table><tbody><tr><td>Support perméable Transwell de 24 mm avec 0,4 & micro ; m Insert de membrane polycarbonate poreux</td><td>Corning (Costar)</td><td>3412</td><td>&bull ; 10 &micro ; Membrane en polycarbonate translucide épaisse M & Bull ; Traité pour une fixation cellulaire optimale &bull ; Conditionné 6 inserts dans une plaque 6 puits, 4 plaques par caisse &bull ; La membrane doit être colorée pour la visibilité cellulaire &bull ; Stérilisé par rayonnement gamma</td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353046</td><td>à fond plat, traité TC, stérile, avec couvercle</td></tr><tr><td>Plat de culture 15 cm</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353025</td><td>Stérile, traité TC Plat de culture cellulaire</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Amino non essentiel acides</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamines</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-020-CI</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine, 2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pipets</td><td></td><td></td><td>N’importe quelle marque est bonne</td></tr><tr><td>Incubateur CO2 N’importe</td><td></td><td></td><td>quelle marque est bien</td></tr><tr><td>Cabine de biosécurité de niveau II N’importe</td><td></td><td></td><td>quelle marque est bonne</td></tr><tr><td>FN1 TaqMan Gene Expression Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01549976_m1</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00998133_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDH1 TaqMan Gene Expression Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01023895_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH TaqMan Gene Expression Dosage</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini kit d’isolement d’ARN</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse de l’ADNc haute capacité</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>43-688-13</td><td></td></tr><tr><td>HeyA8 cellules cancéreuses</td><td>de l’ovaire Obtenu du laboratoire Ernst Lengyel, Université de Chicago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta ; Anticorps neutralisants</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1835-100</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode de culture proximal pour étudier la signalisation paracrine entre cellules

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Les interactions intercellulaires jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la progression tumorale, réponse immunitaire, l’angiogenèse et le développement. Paracrine ou juxtacrine signalisation intervient dans ces interactions. L’utilisation d’un milieu conditionné et co-culture études sont les méthodes les plus courantes d’établir une distinction entre ces deux types d’interactions. Cependant, l’effet des concentrations élevées localisées des facteurs sécrétés dans le microenvironnement durant les interactions paracrines n’est pas précisément récapitulé par milieu conditionné et, par conséquent, peut conduire à des conclusions imprécises. Pour contourner ce problème, nous avons mis au point une méthode de culture proximal pour étudier la signalisation paracrine. Les deux types de cellules sont cultivées sur une surface d’une membrane de 10 µm d’épaisseur en polycarbonate avec 0,4 µm pores. Les pores permettent l’échange de facteurs sécrétés et, en même temps, inhibent juxtacrine signalisation. Les cellules peuvent être collectées et lysées au point de terminaison pour déterminer les effets de la signalisation paracrine. En plus de permettre des gradients de concentration localisées de facteurs sécrétés, cette méthode se prête aux expériences portant sur des périodes prolongées de la culture, ainsi que l’utilisation d’inhibiteurs. Bien que nous utilisions cette méthode pour étudier les interactions entre les cellules de cancer de l’ovaire et les cellules mésothéliales qu’ils rencontrent sur le site de la métastase, il peut être adapté à n’importe quel deux types de cellules adhérentes aux chercheurs d’étudier paracrine signalisation dans divers domaines, y compris développement, immunologie et microenvironnement tumoral.

Des cellules de cancer de l’ovaire métastases rencontrent des cellules mésothéliales sur le site de métastases dans la cavité péritonéale19. Interactions paracrines et juxtacrine productives avec l’aide de cellules mésothéliales en induisant des réponses adaptatives dans les cellules de cancer de l’ovaire, qui permettent des métastases réussi17,18,20,<sup class=...

Interactions cellulaires paracrine et juxtacrine jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la progression tumorale, réponse immunitaire, l’angiogenèse et le développement. Ici, une méthode de culture proximale est utilisée pour étudier la signalisation paracrine où les concentrations localisées des facteurs sécrétés sont entretenues tout en empêchant le contact cellulaire direct.

Une méthode de Culture Proximal pour étudier la signalisation Paracrine entre cellules

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des communications intercellulaires sur les interactions paracrines réciproques par rapport aux interactions juxtacrines entre deux types de cellules. Le principal avantage de cette méthode est qu’il s’agit d’une technique très simple et reproductible qui capture avec précision la signalisation paracrine dans des conditions de culture typiques tout en empêchant une signalisation juxtacrine efficace. Les implications de cette technique s’étendent à une meilleure compréhension du mécanisme de diaphonie entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement tumoral.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma tumoral, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que la cicatrisation des plaies et l’angiogenèse. Commencez par détacher les cellules cancéreuses de l’ovaire d’un mélange confluent à 80 % avec un millilitre de trypsine à 0,25 % pendant 40 à 60 secondes, puis neutralisez la réaction avec six millilitres de milieu de croissance complet. Collectez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans cinq millilitres de milieu de croissance complet frais.Après le comptage, diluez les cellules à 100 000 cellules cancéreuses de l’ovaire par millilitre de concentration complète de milieu de croissance et placez trois inserts de culture cellulaire à membrane de polycarbonate inversés de 0,4 micromètre traités par culture de tissus interstitiels par condition expérimentale dans une boîte de culture de tissus stériles de taille appropriée. Étiquetez les inserts en fonction des conditions expérimentales et pipetez soigneusement les cellules cancéreuses au bas de chaque insert en cercles concentriques, en commençant par le milieu de la membrane et en se déplaçant vers l’extérieur pour former un dôme de 800 microlitres. Soyez extrêmement prudent lorsque vous ensemencez les cellules sur la surface inférieure de l’insert afin que le dôme du milieu contenant les cellules ne s’écoule pas des bords de l’insert pendant l’incubation.Lorsque tous les inserts ont été ensemencés, couvrez le plat et placez soigneusement les inserts dans l’incubateur de culture cellulaire. Après environ quatre heures, détachez le HPMC avec deux millilitres de trypsine à 0,25 % pendant une à deux minutes, puis neutralisez la réaction avec 12 millilitres de milieu de croissance complet. Recueillir le HPMC par centrifugation et remettre en suspension la pastille dans 10 millilitres de milieu de croissance complet pour le comptage.Diluez les cellules à 300 000 HPMC par millilitre de milieu de culture complet et ajoutez 2,5 millilitres de milieu de croissance complet frais à chaque puits d’une plaque de culture à six puits. À l’aide d’une pince stérile, placez chaque insert à l’endroit dans chaque puits de la plaque à six puits de sorte que les surfaces attachées aux cellules cancéreuses de l’ovaire inférieures soient immergées dans le milieu. Ensuite, semez 1,5 millilitres de HPMC dans le puits de chaque insert.Placez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 72 heures. À la fin de l’incubation, retirez soigneusement les inserts de chaque puits et rincez les deux côtés des inserts avec du PBS. Placez chaque insert dans une nouvelle plaque à six puits et ajoutez 0,5 millilitre de trypsine dans les puits d’insertion et deux millilitres de trypsine dans les puits inférieurs.Après deux minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez un millilitre de milieu de croissance complet dans chaque insert et pipetez soigneusement la solution plusieurs fois sans déchirer la membrane ni renverser la suspension cellulaire dans le puits en dessous. Lors du pipetage, il faut veiller à éviter la contamination croisée des cellules d’une chambre avec l’autre. Transférez les cellules remises en suspension dans un tube de collecte étiqueté et neutralisez davantage la trypsine avec deux millilitres supplémentaires de milieu de croissance complet.Pour recueillir les cellules au fond des inserts, rincez le fond des membranes deux à trois fois avec les deux millilitres de trypsine du puits correspondant de la plaque à six puits afin que les cellules détachées soient prises dans les fonds de puits appropriés. Lorsque toutes les cellules ont été détachées, neutralisez la trypsine dans chaque puits avec six millilitres de milieu de croissance frais et transférez les suspensions cellulaires dans des tubes de collecte étiquetés. Ensuite, collectez toutes les cellules par centrifugation et mettez les pastilles en suspension dans 0,7 millilitre de réactif de lyse à base de phénol et de thiocyanate de guanidine par tube pour l’extraction et l’isolement de l’ARN selon les protocoles standard.La culture proximale de HPMC avec des cellules cancéreuses de l’ovaire entraîne une expression accrue de la fibronectine et du facteur de croissance transformant ou TGF bêta 1 par rapport au HPMC témoin ensemencé sur des inserts en l’absence de cellules cancéreuses. L’expression de la fibronectine et du TGF bêta augmente également de manière significative dans les cellules cancéreuses de l’ovaire lors de la culture proximale avec des HPMC par rapport aux cellules ovariennes témoins cultivées en l’absence de HPMC. À l’inverse, les cellules cancéreuses de l’ovaire traitées avec un milieu conditionné HPMC présentent une expression significativement réduite de la fibronectine sans changement dans l’expression du TGF bêta un.Cependant, le blocage du TGF bêta 1 avec un anticorps neutralisant entraîne une diminution significative de l’expression du TGF bêta 1 dans les cellules cancéreuses de l’ovaire en culture proximale avec des HPMC. Il est intéressant de noter qu’une légère augmentation de l’expression du TGF bêta 1 est observée dans les cellules cancéreuses de l’ovaire témoins cultivées non proximalement, probablement comme une réponse compensatoire. La culture proximale avec des cellules cancéreuses de l’ovaire augmente légèrement l’expression de la E-cadhérine dans les HPMC, tandis qu’une diminution marquée de la E-cadhérine est observée dans les cellules cancéreuses de l’ovaire cultivées à proximité des HPMC par rapport aux témoins, démontrant ainsi l’efficacité du système de culture proximale pour l’étude de la signalisation paracrine entre les cellules cancéreuses de l’ovaire et les cellules normales au site de métastase.Lors de cette procédure, il est important d’optimiser le nombre de cellules ensemencées et la durée de la culture proximale. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunoblot peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les changements dans l’expression des protéines et l’activation des voies de signalisation de traitement en aval lors de la co-culture de cellules mésothéliales tumorales. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du microenvironnement tumoral, de l’immunologie, de la biologie du développement pour explorer les interactions paracrines réciproques entre les cellules par le biais de facteurs sécrétés.

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Dans cette vidéo, nous développons un modèle de co-culture proximale de cellules cancéreuses de l’ovaire et de cellules mésothéliales humaines primaires. Ce modèle physiologiquement pertinent permet l’étude de la signalisation paracrine, où les concentrations localisées des facteurs sécrétés sont maintenues tout en empêchant le contact cellulaire direct.

Système de culture proximale : une technique de culture in vitro pour étudier la signalisation paracrine entre les cellules

Nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable pour imiter le microenvironnement tumoral (TME). Le modèle consiste en une culture cellulaire mixte, permet la génération simplifiée de populations cellulaires individuelles hautement enrichies sans utiliser le marquage fluorescent ou le tri cellulaire, et permet d’étudier la communication intercellulaire au sein du TME dans des conditions normales ou de stress.

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Un modèle de culture cellulaire des artères de résistance est décrite, permettant la dissection de la signalisation des voies dans l’endothélium, muscle lisse, ou entre l’endothélium et de muscle lisse (la jonction de myoendothéliales). L’application sélective des agonistes ou isolement de protéine, la microscopie électronique ou immunofluorescence peut être utilisée à l’aide de ce modèle de culture cellulaire.

Un modèle de Culture cellulaire des artères de résistance

Nous présentons un protocole afin d’étudier la diaphonie entre Caco-2 X-ray-irradiés et les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). Le protocole commence par irradiation de Caco-2 et de la mise en place de la co-culture avec PBMC ; par la suite, trans-épithéliales résistance électrique est régulièrement mesurée 48 tache h et occidentale exécutée en Caco-2 et PBMC.

Une méthode de culture mixte d’enquêter sur les interférences entre les rayons x irradiés PBMC et cellules Caco-2

Nous fournissons des protocoles d’évaluation des cellules souches mésenchymateuses isolées de la pulpe dentaire et interactions cellulaires de cancer de la prostate basées sur des méthodes directes et indirectes de co-culture. Moyenne de l’état et les membranes de trans-puits conviennent d’analyser l’activité paracrine indirecte. Ensemencement différemment colorées cellules ensemble est un modèle approprié pour l’interaction cellule-cellule direct.

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu de pulpe et co-culture avec les cellules cancéreuses afin d’étudier leurs Interactions

Ici, nous présentons une méthode utilisant des supports perméables de membrane pour faciliter l'étude de la signalisation de paracrine de non-contact employée par des cellules de tumeur pour supprimer la réponse immunitaire. Le système est disposé à étudier le rôle des facteurs tumeur-sécrétés en amortissant l'activation de macrophage.

Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur l'activation du macrophage à l'aide de la co-culture avec des supports membranaires perméables

Nous décrivons l’isolement, la dispersion et le placage des cellules primaires de pulpe dentaire (DP) avec les neurones trigéminaux (TG) cultivés au-dessus des filtres transwell. Les réponses cellulaires des cellules DP peuvent être analysées avec l’immunofluorescence ou l’analyse d’ARN/protéine. L’immunofluorescence des marqueurs neuronaux avec la microscopie confocale permet l’analyse des réponses de excroissance neurite.

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La présente étude décrit une méthode hautement reproductible et traitable pour étudier in vitro les événements paracrines non canoniques de signalisation Wnt.  Ce protocole a été appliqué pour évaluer l’impact de la signalisation paracrine Wnt5a dans les cellules de la crête neurale murine et les myoblastes.

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Dans cet article, un insert nouvellement conçu imprimé en 3D est présenté comme un modèle de co-culture et validé par l’étude de la communication intercellulaire paracrine entre les cellules endothéliales et les kératinocytes.

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Test de sensibilité visuelle chez les lézards en utilisant un paradigme de conditionnement opérant, qui emploie la lecture vidéo de points aléatoires kinematograms et générés par ordinateur invertébrés.

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Une méthode de Culture Proximal pour étudier la signalisation Paracrine entre cellules

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