Une méthode de Culture Proximal pour étudier la signalisation Paracrine entre cellules

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des communications intercellulaires sur les interactions paracrines réciproques par rapport aux interactions juxtacrines entre deux types de cellules. Le principal avantage de cette méthode est qu’il s’agit d’une technique très simple et reproductible qui capture avec précision la signalisation paracrine dans des conditions de culture typiques tout en empêchant une signalisation juxtacrine efficace. Les implications de cette technique s’étendent à une meilleure compréhension du mécanisme de diaphonie entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement tumoral.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma tumoral, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que la cicatrisation des plaies et l’angiogenèse. Commencez par détacher les cellules cancéreuses de l’ovaire d’un mélange confluent à 80 % avec un millilitre de trypsine à 0,25 % pendant 40 à 60 secondes, puis neutralisez la réaction avec six millilitres de milieu de croissance complet. Collectez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans cinq millilitres de milieu de croissance complet frais.

Après le comptage, diluez les cellules à 100 000 cellules cancéreuses de l’ovaire par millilitre de concentration complète de milieu de croissance et placez trois inserts de culture cellulaire à membrane de polycarbonate inversés de 0,4 micromètre traités par culture de tissus interstitiels par condition expérimentale dans une boîte de culture de tissus stériles de taille appropriée. Étiquetez les inserts en fonction des conditions expérimentales et pipetez soigneusement les cellules cancéreuses au bas de chaque insert en cercles concentriques, en commençant par le milieu de la membrane et en se déplaçant vers l’extérieur pour former un dôme de 800 microlitres. Soyez extrêmement prudent lorsque vous ensemencez les cellules sur la surface inférieure de l’insert afin que le dôme du milieu contenant les cellules ne s’écoule pas des bords de l’insert pendant l’incubation.

Lorsque tous les inserts ont été ensemencés, couvrez le plat et placez soigneusement les inserts dans l’incubateur de culture cellulaire. Après environ quatre heures, détachez le HPMC avec deux millilitres de trypsine à 0,25 % pendant une à deux minutes, puis neutralisez la réaction avec 12 millilitres de milieu de croissance complet. Recueillir le HPMC par centrifugation et remettre en suspension la pastille dans 10 millilitres de milieu de croissance complet pour le comptage.

Diluez les cellules à 300 000 HPMC par millilitre de milieu de culture complet et ajoutez 2,5 millilitres de milieu de croissance complet frais à chaque puits d’une plaque de culture à six puits. À l’aide d’une pince stérile, placez chaque insert à l’endroit dans chaque puits de la plaque à six puits de sorte que les surfaces attachées aux cellules cancéreuses de l’ovaire inférieures soient immergées dans le milieu. Ensuite, semez 1,5 millilitres de HPMC dans le puits de chaque insert.

Placez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 72 heures. À la fin de l’incubation, retirez soigneusement les inserts de chaque puits et rincez les deux côtés des inserts avec du PBS. Placez chaque insert dans une nouvelle plaque à six puits et ajoutez 0,5 millilitre de trypsine dans les puits d’insertion et deux millilitres de trypsine dans les puits inférieurs.

Après deux minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez un millilitre de milieu de croissance complet dans chaque insert et pipetez soigneusement la solution plusieurs fois sans déchirer la membrane ni renverser la suspension cellulaire dans le puits en dessous. Lors du pipetage, il faut veiller à éviter la contamination croisée des cellules d’une chambre avec l’autre. Transférez les cellules remises en suspension dans un tube de collecte étiqueté et neutralisez davantage la trypsine avec deux millilitres supplémentaires de milieu de croissance complet.

Pour recueillir les cellules au fond des inserts, rincez le fond des membranes deux à trois fois avec les deux millilitres de trypsine du puits correspondant de la plaque à six puits afin que les cellules détachées soient prises dans les fonds de puits appropriés. Lorsque toutes les cellules ont été détachées, neutralisez la trypsine dans chaque puits avec six millilitres de milieu de croissance frais et transférez les suspensions cellulaires dans des tubes de collecte étiquetés. Ensuite, collectez toutes les cellules par centrifugation et mettez les pastilles en suspension dans 0,7 millilitre de réactif de lyse à base de phénol et de thiocyanate de guanidine par tube pour l’extraction et l’isolement de l’ARN selon les protocoles standard.

culture proximale de HPMC avec des cellules cancéreuses de l’ovaire entraîne une expression accrue de la fibronectine et du facteur de croissance transformant ou TGF bêta 1 par rapport au HPMC témoin ensemencé sur des inserts en l’absence de cellules cancéreuses. L’expression de la fibronectine et du TGF bêta augmente également de manière significative dans les cellules cancéreuses de l’ovaire lors de la culture proximale avec des HPMC par rapport aux cellules ovariennes témoins cultivées en l’absence de HPMC. À l’inverse, les cellules cancéreuses de l’ovaire traitées avec un milieu conditionné HPMC présentent une expression significativement réduite de la fibronectine sans changement dans l’expression du TGF bêta un.

Cependant, le blocage du TGF bêta 1 avec un anticorps neutralisant entraîne une diminution significative de l’expression du TGF bêta 1 dans les cellules cancéreuses de l’ovaire en culture proximale avec des HPMC. Il est intéressant de noter qu’une légère augmentation de l’expression du TGF bêta 1 est observée dans les cellules cancéreuses de l’ovaire témoins cultivées non proximalement, probablement comme une réponse compensatoire. La culture proximale avec des cellules cancéreuses de l’ovaire augmente légèrement l’expression de la E-cadhérine dans les HPMC, tandis qu’une diminution marquée de la E-cadhérine est observée dans les cellules cancéreuses de l’ovaire cultivées à proximité des HPMC par rapport aux témoins, démontrant ainsi l’efficacité du système de culture proximale pour l’étude de la signalisation paracrine entre les cellules cancéreuses de l’ovaire et les cellules normales au site de métastase.

Lors de cette procédure, il est important d’optimiser le nombre de cellules ensemencées et la durée de la culture proximale. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunoblot peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les changements dans l’expression des protéines et l’activation des voies de signalisation de traitement en aval lors de la co-culture de cellules mésothéliales tumorales. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du microenvironnement tumoral, de l’immunologie, de la biologie du développement pour explorer les interactions paracrines réciproques entre les cellules par le biais de facteurs sécrétés.