Cellulaire et acellulaire poumon modèle pour étudier les métastases tumorales

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à la progression tumorale. Le modèle pulmonaire acellulaire et cellulaire ex vivo permet la formation d’une tumeur primaire qui se développe au fil du temps et forme des cellules tumorales circulantes et des lésions métastatiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier la progression du cancer dans un temps abrégé et la croissance de différents types de cellules cancéreuses.

Les implications de cette technique s’étendent à notre thérapie personnalisée, car les cellules tumorales des patients peuvent être utilisées dans le modèle pour évaluer l’efficacité de médicaments thérapeutiques, y compris les cellules immunitaires. Commencez avec un rat profondément anesthésié. Rasez la poitrine et l’abdomen et essuyez la peau avec un tampon de chlorhexidine.

Après avoir ouvert la cavité thoracique, effectuez une thoracotomie bilatérale en coupant le côté antérieur de la cage thoracique à gauche du côté droit du diaphragme. Tenez la cage thoracique vers le haut et injectez deux millilitres de 1000 unités par millilitre d’héparine dans le ventricule droit du cœur battant à l’aide d’une aiguille de calibre 27 pour empêcher la formation de caillots sanguins dans les poumons. Après avoir retiré la cage thoracique, placez une aiguille de calibre 18 dans le ventricule gauche comme un évent pour permettre au sang de s’échapper, puis utilisez une aiguille de calibre 25 pour injecter 15 millilitres de 12,5 unités par millilitre de PBS hépariné dans le ventricule droit.

Ensuite, coupez la trachée à la base de la thyroïde et retirez soigneusement l’aorte descendante au niveau de la veine hémiazygos et les branches de l’aorte au niveau de l’arcade. Après avoir retiré le bloc cœur-poumon de la cavité thoracique, coupez la moitié des ventricules droit et gauche, puis placez une canule à aiguille en acier inoxydable de calibre 18 faite sur mesure à travers le ventricule droit dans l’artère pulmonaire principale. Fixez la canule avec l’attache en soie 2-0 et exposez soigneusement le ventricule et l’oreillette droits.

Commencez par faire fonctionner le PBS hépariné à une pression de perfusion physiologique de 30 millimètres de mercure jusqu’à ce qu’il s’écoule librement dans la bouteille de l’unité de décellularisation, puis fixez le bloc cœur-poumon à l’unité de décellularisation à l’extrémité de l’artère pulmonaire à travers la canule de l’artère pulmonaire. Après 15 minutes de lavage avec du PBS hépariné, remplacez la bouteille de PBS héparinée par une contenant 0,15 % de dodécylsulfate de sodium et de l’eau déminéralisée, et perfuser le poumon pendant deux heures pour la décellularisation. Après la décellularisation, perfuser de l’eau autoclavée désionisée à travers l’échafaudage pulmonaire pendant 15 minutes, suivie d’un détergent non ionique à 1 % dans de l’eau désionisée pendant 10 minutes.

Enfin, remplacez le flacon par 500 millilitres de PBS autoclavé complété par des antibiotiques. Faites fonctionner la pompe à six millilitres par minute et perfuser les poumons pendant 72 heures, après quoi le poumon acellulaire est prêt à être utilisé immédiatement. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur la cartouche de la pompe et configurez l’oxygénateur en connectant l’extrémité de sortie de l’oxygénateur au tube de la pompe et l’autre extrémité à un tube de 1,5 pied dans le bioréacteur.

Installez la bouteille du bioréacteur dans une enceinte de biosécurité dans des conditions aseptiques. Fixez un robinet d’arrêt à trois voies à la tête d’un Luer lock femelle pour contrôler le débit dans l’artère pulmonaire, puis connectez un robinet d’arrêt à un autre verrou Luer femelle pour l’ensemencement des cellules à travers la trachée. Connectez un tube de deux pouces à l’extérieur et un tube de six pouces à l’intérieur de la bouteille pour faire circuler le fluide.

Préparez le tube pour connecter la bouteille du bioréacteur à l’oxygénateur. Installez un verrou Luer mâle sur un tube de deux pieds et fixez un crampon Luer femelle de style T pour assurer l’accessibilité, et fixez un verrou Luer mâle et un verrou Luer femelle à deux tubes de pied. Ajoutez du milieu de culture cellulaire et transférez le bioréacteur dans l’incubateur.

Connectez le tube de l’oxygénateur aux deux extrémités ouvertes pour en faire un bioréacteur en boucle fermée. Pré-faites fonctionner la pompe à six millilitres par minute pour remplir l’oxygénateur et les tubes avec du milieu de culture afin qu’il n’y ait pas de bulles d’air dans le tube. Une fois les tubes remplis de fluide, fermez le robinet d’arrêt et débranchez les oxygénateurs des deux extrémités de la bouteille du bioréacteur.

Placez la bouteille du bioréacteur dans l’enceinte de biosécurité, passez le milieu de culture à travers le robinet d’arrêt et fixez la canule pulmonaire de l’échafaudage pulmonaire. Si vous travaillez avec le modèle de poumon cellulaire, sautez la décellularisation. Le poumon prélevé peut être placé de manière dyadique dans le bioréacteur.

Passez à nouveau le milieu de culture à travers le robinet d’arrêt unidirectionnel pour éliminer l’air et attachez la canule trachéale à la trachée par un fil de soie, puis fermez le bouchon de la bouteille du bioréacteur. Transférez le bioréacteur dans l’incubateur et démarrez la pompe. Passez le milieu de culture pendant 10 à 15 minutes pour vous assurer que tous les lobes sont gonflés et que le poumon semble en bon état.

Modifier l’échafaudage pulmonaire acellulaire ou cellulaire comme suit pour le modèle métastatique. Ouvrez le capuchon du bioréacteur avec l’échafaudage pulmonaire suspendu et utilisez une seringue Luer lock pour faire passer cinq millilitres de milieu de culture à travers la trachée. Utilisez une pince angulaire pour passer la soie 2-0 à travers la trachée au point de bifurcation.

Attachez la trachée en allant vers le poumon droit au point de bifurcation et vérifiez la libre circulation du milieu à travers la trachée vers le poumon gauche en passant le milieu de culture. Préparez un volume de 50 millilitres de cellules cancéreuses du poumon telles que A549 ou H1299 dans un milieu de culture complet RPMI 1640 à une concentration de deux à trois millions de cellules par millilitre. Placez une seringue Luer lock de 20 millilitres sur le dessus de la canule trachéale et ajoutez 15 millilitres de cellules dans la seringue.

Laissez la suspension cellulaire passer à travers les lobes pulmonaires par gravité. Ajoutez le reste des cellules avant que les bulles d’air ne passent. Une fois ensemencée, retirez la seringue et attendez 15 minutes, puis ajoutez du milieu frais dans le bioréacteur.

Remettez-le dans l’incubateur et, après avoir éliminé toutes les bulles d’air, perfuser l’échafaudage pulmonaire à six millilitres par minute. L’histopathologie d’un poumon intact montre les alvéoles et les pneumocytes. Comme on le voit ici, la décellularisation conduit à l’élimination complète des cellules pulmonaires, et l’histopathologie des poumons acellulaires révèle une membrane basale intacte.

La coloration au pentachrome et à l’élastine d’un poumon décellularisé révèle la présence de collagène, de fibrine et d’élastine avec un système vasculaire et des bronches intacts. L’analyse de l’ADN du poumon décellularisé montre une réduction de la teneur en ADN de plus de 99 %Le poumon acellulaire peut être utilisé directement dans le bioréacteur pour la culture cellulaire. Une analyse histologique montre la présence d’une croissance tumorale.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’injecter l’héparine dans le ventricule droit du cœur. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer pour explorer les altérations génétiques et épigénétiques conduisant à la métastase des cellules tumorales dans le cancer du poumon.