Name: Cellulaire et acellulaire poumon modèle pour étudier les métastases tumorales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Découvrez un modèle pulmonaire ex vivo cellulaire et acellulaire pour étudier la progression tumorale et les métastases. Cette technique permet d'isoler des tumeurs primaires, des cellules tumorales circulantes et d'évaluer l'efficacité thérapeutique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kim P. min bénéficié du soutien de subvention le deuxième John W. Kirklin bourse de recherche, American Association for thoracique chirurgie, Graham Research Foundation, Houston méthodiste spécialité médecin subvention de groupe et M. Michael et Joann H. cône Research Award. Nous remercions Ann Saikin pour la langue de rédaction du manuscrit.

Les protocoles pour l’expérimentation animale ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme à l’Institut de recherche de méthodiste de Houston et d’institutionnels animalier et effectuées conformément à tous les règlements, lois, directives et politiques.
1. récolte de poumon de rat
<ol><li>Anesthésier un rat Sprague-Dawley mâle de 4 à 6-semaines par injection intrapéritonéale (IP) de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) dans son flanc. S’assurer que l’anesthésie en vérifiant l’absence de mouvement quand l’orteil du membre postérieur est pincé avec une pince.</li>
	<li>Après 10 min, raser la poitrine et l’abdomen et essuyer la peau avec un tampon de la chlorhexidine.</li>
	<li>Enlever la peau par ramasser avec une pince et il inciser avec un scalpel jetable. Après avoir ouvert la cavité thoracique par incision avec bistouri, réaliser une thoracotomie bilatérale en coupant la partie antérieure de la cage thoracique, à gauche et à droite du diaphragme avec des ciseaux. Remarque : Il s’agit d’une chirurgie sans survie.</li>
	<li>Tenez la cage thoracique vers le haut et injecter 2 mL d’héparine (1 000 unités/mL) dans le ventricule droit du cœur battant à l’aide d’une aiguille de 27 G. Remarque : Cela empêchera toute formation de caillots sanguins dans les poumons.</li>
	<li>Complètement enlever la cage thoracique avec des ciseaux et une aiguille 18 G dans le ventricule gauche comme un évent, jusqu'à ce que le sang sort. Ensuite, injecter 15 mL de solution saline tamponnée au phosphate héparinée (12,5 unités/mL ; PBS hépariné) dans le ventricule droit à l’aide d’une aiguille 25 G.</li>
	<li>Couper la veine inférieure et supérieure, cave deux grosses veines sur le côté droit du cœur, puis rincez les poumons avec une autre 10 mL de PBS hépariné dans le ventricule droit à l’aide d’une aiguille de 27 G. Remarque : La veine cave inférieure est visualisée sous le fond du cœur comme un grand navire rempli de sang rouge. De même, la veine cave supérieure est visualisée dans la partie supérieure du cœur comme un gros navire.</li>
	<li>Couper la trachée à la base de la thyroïde. Retirer délicatement l’aorte au niveau de la veine hémiazygos et les branches de l’aorte à l’arche.</li>
	<li>Retirez le bloc coeur-poumons de la cavité thoracique et le reste de l’organisme du rat.</li>
	<li>Exécuter ventriculotomy en coupant la moitié des ventricules droit et gauche et placer une canule de l’aiguille en acier inoxydable 18 G préremplie sur mesure à travers le ventricule droit dans l’artère pulmonaire (PA).</li>
	<li>Fixer la canule avec une cravate de soie de 2-0 et exposer avec soin le ventricule droit et l’atrium.</li>
	<li>Placer une cloison Luer femelle dans le ventricule gauche et le fixer avec une cravate de soie de 2-0.</li>
	<li>Rincer le bloc coeur-poumons avec 20 mL de PBS hépariné via la canule de PA et le placer dans un tube de 50 mL contenant des milieux de culture ou hépariné PBS. Remarque : Pour un modèle cellulaire, passez à l’étape 3.1 à mettre en place le bioréacteur. Pour un modèle acellulaire, passez à l’étape 2.1 pour la DÉCELLULARISATION.</li>
</ol>2. poumon DÉCELLULARISATION
<ol><li>
Préparation de l’unité de DÉCELLULARISATION
	<ol>
<li>Préparer chaque chambre DÉCELLULARISATION/bouteille en perçant deux trous dans le bouchon de la bouteille et en coupant un raccord Luer femelle dans les trous (Figure 1 a et 1 b). Fixer avec une bague en nylon noir de l’autre côté. De même, percez un petit trou dans un autre bouchon de la bouteille pour attacher ensemble par voie intraveineuse (Figure 1). Remarque : La Figure 1 a et 1 b sont des capsules de bouteille même des deux côtés différentes. La figure 1 est un plafond différent avec un seul trou comme indiqué ci-dessus dans l’étape 2.1.1.</li>
		<li>Fixez un tube de 0,5 pouce (à l’artère pulmonaire ou à la fin de la PA) et les tubes de 6 pouces (Figure 1J) à un raccord Luer femelle d’à l’intérieur des capsules de bouteilles (Figure 1 a et 1 b) et fixez un raccord Luer-lock mâle aux extrémités. Régler le verrouillage avec une bouteille de 500 mL comme la chambre de DÉCELLULARISATION/bouteille.</li>
		<li>Connectez une extrémité de deux tubes de 2 pi (qui sont raccordés avec un raccord Luer-lock mâle) aux deux extrémités du tube pompe (Figure 1 H), qui est attaché à la tête de pompe (Figure 1E et 1F) par une cartouche (Figure 1) avec un raccord Luer femelle serrure (Figure 1I).</li>
		<li>Branchez l’autre extrémité des ft 2 tubes (de l’étape 2.1.3) chacun à une tête de verrouillage Luer femelle sur le chapeau de chambre/bouteille DÉCELLULARISATION (Figure 1 L).</li>
		<li>Mettre en place une 250 mL héparinée bouteille de PBS (avec 200 mL de PBS) en accrochant une bouteille renversée sur un stand avec l’extrémité proximale d’un ensemble par voie intraveineuse (Figure 1) inséré dans le bouchon de la bouteille et l’extrémité distale, remplacement du tube de 2pi relié à la c DÉCELLULARISATION Hamber/bouteille à la fin de la PA (Figure 1 b). Connectez ce tube 2 ft à la bouteille de défausse. Remarque : Les bouteilles sont configurées en carton, comme illustré à la Figure 1 K. Les tubes intraveineux sortent les bouteilles pendaison pour distribuer les réactifs de l’échafaud de poumon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Processus de DÉCELLULARISATION poumon
	<ol>
<li>Exécutez le PBS hépariné à une pression de perfusion physiologique de 30 mm Hg (Figure 1 K) jusqu'à ce qu’il coule à flot dans la chambre de DÉCELLULARISATION/bouteille et, ensuite, fixez le bloc coeur-poumons à l’extrémité de PA par la canule de PA.</li>
		<li>Garder de faire fonctionner la pompe en permanence, afin que toute solution de tampon/excès à l’intérieur de la chambre/bouteille DÉCELLULARISATION obtient mis au rebut.</li>
		<li>Le PBS hépariné, traversent la PA pendant 15 min à une pression de perfusion de 30 mm Hg pour le lavage initial (Figure 1 K).</li>
		<li>Remplacer la bouteille de PBS héparinée avec 0,1 % dodécylsulfate de sodium (SDS) dans l’eau désionisée et perfuse le poumon pendant 2 h pour la DÉCELLULARISATION.</li>
		<li>Après la DÉCELLULARISATION, perfuse autoclavée désionisée par le biais de l’échafaud de poumon pendant 15 min.</li>
		<li>Puis, perfuse 1 % de détergent non ionique dans l’eau désionisée pendant 10 min.</li>
		<li>Remplacer la DÉCELLULARISATION chambre/bouteille 500 ml de PBS autoclavé additionné d’antibiotiques de x 1 (pénicilline-streptomycine amphotéricine), conservant le poumon suspendus avec le bouchon à l’intérieur de la bouteille.</li>
		<li>Jeter l’intraveineuse la valeur, mettre le tuyau de 2 pieds attaché au conteneur discarding remonte à la fin de l’artère pulmonaire de la chambre de DÉCELLULARISATION et faire fonctionner la pompe à 6 mL/min (Figure 1D).</li>
		<li>Perfuse les poumons pendant 72 h et garder changeant le PBS avec antibiotiques toutes les 12 h. Remarque : Le poumon acellulaire est prêt pour une utilisation immédiate. Il peut être conservé à-80 ° c jusqu'à ce que nécessaire. Si les taches roses ou des caillots de sang peuvent être visualisées clairement dans les lobes pulmonaires, jeter le poumon. Il est possible de tester au hasard pour l’ADN ou l’histopathologie. Un poumon acellulaire complet n’affichera pas de cellules et 99,9 % de l’ADN vont être lavé. Remarque : Lorsque vous travaillez avec un modèle cellulaire pulmonaire, ignorez la DÉCELLULARISATION. Le poumon récolté (étape 1) peut être défini directement dans le bioréacteur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bioréacteur Set-up
<ol><li>Préparer le biberon de bioréacteur et les éléments nécessaires à la mise en place.<ol>
<li>Percez trois trous dans un bouchon de bouteille de 500 mL à égale distance et fixer un raccord Luer femelle dans chacun des trois trous, à l’aide de bagues en nylon noir (Figure 2 a et 2 b). Remarque : Dans les deux trous, le raccord Luer lock termine face l’extérieur, tandis que l’intérieur de la bouteille fait face à une extrémité.</li>
		<li>Couper un 6 en tube de la pompe, un 2 en tube, un 6 en tube, un tube de 1,5 pi, un tube de 2 pieds et un tube d’oxygénateur de 10pi par bioréacteur.</li>
		<li>Couper une aiguille en acier inoxydable de 18 G et, encore une fois, raccordez les extrémités avec la tuyauterie biocompatible pour une canule trachéale.</li>
		<li>Enrouler le tube de l’oxygénateur, avec raccords Luer lock aux extrémités, sur un treillis de solénoïde utilisant des bandes de l’autoclave (Figure 2).</li>
		<li>Autoclave susmentionné points et conservez-les dans UV lumière pendant 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettre en place la pompe à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire normale (37 ° C, 5 % de CO2) avec un espacement approprié entre les plateaux pour s’adapter facilement à une bouteille de 500 mL.</li>
	<li>Pulvériser de l’éthanol à 70 % sur la cartouche de pompe et connecter le tuyau de la pompe avec la femelles raccords Luer lock aux deux extrémités à la pompe.</li>
	<li>Mettre en place l’oxygénateur enroulé autour de solénoïde grillage à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire en branchant une extrémité (la sortie) de l’oxygénateur sur le tuyau de la pompe et l’autre extrémité avec le tube de 1,5 pi dans le bioréacteur.</li>
	<li>Mettre en place la bouteille de bioréacteur à une prévention des risques biotechnologiques armoire avec des conditions d’asepsie.<ol>
<li>Attacher un robinet à 3 voies (jaune) à la tête de l’un de la femelle Luers pour contrôler le flux par le biais de l’autorité palestinienne.</li>
		<li>Brancher un robinet à sens unique (bleu) d’une autre cloison de serrure de Luer femelle pour cellule ensemencement par le biais de la trachée (Figure 2F).</li>
		<li>Connecter 2 dans un tube à l’extérieur (blanc) et 6 dans un tube à l’intérieur de la bouteille pour faire circuler les médias dehors. Monter un raccord Luer-lock mâle dans un tube de 2 pieds et attachez un style de cosse Luer femelle Tee à fournir l’accessibilité pour ajouter ou supprimer quoi que ce soit.</li>
		<li>Fixer un robinet à sens unique sur une des ouvertures du connecteur 3 voies (femelle Luer patte style Tee).</li>
		<li>Fixez un raccord Luer-lock mâle et une femelle Luer-lock à tubes de 2 pi.</li>
		<li>Ajouter 200 mL de RPMI1640 avec 10 % SVF et 1 % antibiotiques milieu de culture cellulaire (varie selon l’exigence de la cellule) et placer le bioréacteur dans l’étuve. Connecter le tuyau de l’oxygénateur aux deux extrémités ouvertes (robinet unidirectionnel et connecteur Tee) d’en faire un bioréacteur à boucle fermée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pré de fonctionner la pompe à 6 mL/min à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire avec des milieux de culture cellulaire pour remplir les tubes et oxygénateur, afin qu’aucune bulle d’air n’existe dans le tube.</li>
	<li>Une fois que les tubes sont remplis de médias, fermer le robinet et enlever la bouteille de bioréacteur de l’incubateur en déconnectant les oxygénateurs des deux extrémités de la bouteille de bioréacteur.</li>
	<li>Placer le biberon de bioréacteur dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet, à passer des milieux de culture à travers le robinet d’arrêt et fixer la canule de PA de l’échafaudage de poumon (acellulaire ou cellulaire) au robinet d’arrêt à travers le connecteur Luer mâle. NOTE : Ici, il est possible d’utiliser le modèle acellulaire (suivant le processus de DÉCELLULARISATION) ou un bloc coeur-poumon fraîchement récoltés (c'est-à-dire, le modèle cellulaire, car il conserve les cellules natives de rat).</li>
	<li>Passer des milieux de culture à travers un aller simple robinet pour enlever tout l’air et attacher la canule trachéale par un fil de soie à la trachée.</li>
	<li>Veillez à éviter toute torsion de la PA et de la trachée. Fermer le bouchon du flacon bioréacteur avec le poumon échafaudage à l’intérieur encore une fois, aseptiquement placer le bioréacteur dans l’étuve et, démarrer la pompe à une vitesse de 6 mL/min.</li>
	<li>Exécuter des milieux de culture pendant 10-15 min pour s’assurer que tous les lobes se gonflaient et le poumon semble en bonne forme (Figure 2).</li>
</ol>4. modèle métastases et ensemencement de la cellule
Remarque : Passez à la cellule d’ensemencement avec le modèle de poumon ci-dessus pour une étude de la croissance de la tumeur primaire. Modifier l’échafaud de poumon (acellulaire ou alvéolaire) comme suit pour le modèle métastatique.
<ol><li>Retirez le bioréacteur à l’échafaud de poumon de l’incubateur et mettez-le dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.</li>
	<li>Utiliser une seringue à embout Luer lock pour passer de 5 mL de milieu de culture à travers la trachée et ouvrir le bouchon de bioréacteur avec la pendaison échafaudage pulmonaire (Figure 2F).</li>
	<li>À cette étape, une personne de plus est nécessaire pour aider à la modification du poumon à un modèle métastatique.</li>
	<li>Téléchargez soie 2-0 prêt et pince angulaire permet de faire un passage à travers la trachée au point de bifurcation.</li>
	<li>Attachez la trachée va du poumon droit au point de bifurcation et vérifier la libre circulation des médias par le biais de la trachée au poumon gauche en passant des milieux de culture. Remarque : Une fois que la trachée est liée au point de bifurcation, cellules ensemencées à travers la trachée seront automatiquement dirigés aux semences aux lobes gauche. Il peut être testé avant d’ensemencer les cellules par des milieux de culture pousse à travers la trachée. Dans le modèle métastatique, les médias seront déplacera aux lobes gauche uniquement, qui seront gonfle, et pas aux lobes droite10.</li>
	<li>Définir une seringue 20 mL de verrouillage Luer sur le dessus de la canule trachéale et ajouter des cellules de cancer du poumon ATCC (A549, H1299) dans 50 mL de milieu de culture complet RPMI1640 (Figure 2F).</li>
	<li>Effectuer la cellule ensemencement dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Ajouter 15 mL de cellules dans la seringue et laisser passer à travers les lobes pulmonaires par gravité. Ajouter le reste des cellules avant que les bulles d’air passent à travers.</li>
	<li>Dans le poumon acellulaire ensemencement, recueillir les médias perfusés gouttes vers le bas dans la bouteille de bioréacteur et laisser passer à travers la trachée à nouveau 3 x. NOTE : Les médias perfusé ont parfois les cellules cancéreuses ensemencées. Par conséquent, pour l’ensemencement efficace, remettre les médias encore une fois dans la trachée par le biais de la seringue.</li>
	<li>Une fois que les graines, enlevez la seringue, attendre 15 min, ajouter les supports neufs et revenir le bioréacteur à un incubateur. Éliminez les bulles d’air dans le tuyau.</li>
	<li>Démarrer la pompe pour perfuse les médias à 6 mL/min.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics%2C+2017%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Cancer+Statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li>
<li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Bissell, M. J., Hines, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+don%27t+we+get+more+cancer%3F+A+proposed+role+of+the+microenvironment+in+restraining+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression.</a> Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308(2012).</li>
<li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+A549+cells+from+tissue+of+4D+model+predicts+poor+prognosis+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer.+Journal+International+du+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients.</a> International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+four-dimensional+lung+cancer+model+mimics+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li>
<li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441(2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le poumon de 4D ex vivo fournit l’occasion d’étudier la croissance tumorale et les métastases dans une configuration de laboratoire. Une matrice de poumon natif est un système complexe qui offre un soutien aux tissus normaux et maintient les interactions cellule-cellule, interactions cellule-matrice, différenciation cellulaire et organisation tissulaire. Il offre la possibilité d’ajouter des composants de microenvironnement tumoral pour étudier leurs effets sur la croissance tumorale et l’interaction avec d’autr...

Métastases du cancer est le coupable derrière la plupart des décès liés au cancer et pose le défi ultime dans l’effort pour combattre le cancer. L’objectif général de cette méthode est de concevoir un protocole pour une culture de quatre dimensions (4D) cellulaire qui a une dimension de flux, en plus de la croissance tridimensionnelle (3d) cellulaire. Il représente les trois phases du processus de métastase [c'est-à-dire, la tumeur primitive, tumeur cellules circulantes (CTC) et lésions métastatiques].
Durant les trois dernières décennies, les scientifiques du monde entier a donné une richesse inégalée d’informations pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent la progression métastatique dans différents cancers qui ont amélioré la perspective d’une guérison ou de survie sans progression. La prise en charge clinique de certains cancers, comme le cancer, sensiblement améliorée1; Cependant, certains cancers, tels que le cancer du poumon, ont toujours un faible taux de survie à2. Modèles animaux in vitro et in vivo ont grandement contribués à générer de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui sous-tendent le développement de la maladie. Dans ces dernières années, dérivé de xénogreffes (CDX) de cellules et xénogreffes dérivés de patient (PDX) ont été plus intéressants car ils conservent de nombreuses fonctionnalités pertinentes de tumeur humaine primaire3, telles que la cinétique de croissance, les caractéristiques histologiques, comportementales caractéristiques et la réponse au traitement. Toutefois, chaque modèle a ses limites pour comprendre le mécanisme de formation de la CCT et métastase d’un organes éloignés4,5,6.
Récemment, nous avons développé un modèle 4D ex vivo pulmonaire du cancer en utilisant le concept de réingénierie d’orgue et culture cellulaire basé sur la perfusion. Elle imite la croissance du cancer du poumon chez l’humain en formant des nodules pleins : tumeurs qui se développent au fil du temps avec un homme similaire du cancer-sécrétée protéine production7. Il représente la signature d’expression de gène qui prédit faible taux de survie chez les patients atteints de cancer et montre également une réponse thérapeutique par une régression tumorale sur cisplatine traitement8,9. Le modèle du poumon a été modifié afin qu’il peut former des lésions métastatiques. La CTC se développent à partir d’une tumeur primaire et intravasate dans le système vasculaire et extravasate dans le poumon controlatéral pour former des lésions métastatiques10. Études d’expression de gène suggèrent un profil d’expression distincte de la tumeur primitive, la CTC et les lésions métastatiques et la stimulation de l’expression du sous-ensemble de gènes nécessaires pour le phénotype10. Ce processus métastatique se produit en raison de la présence de conditions biologiques observées chez les patients atteints de cancer. L’avantage de ce modèle est la présence d’une matrice naturelle et l’architecture et une perfusion de nutriments qui conduit à la formation de nodules de la tumeur. En outre, il fournit également l’occasion d’étudier les effets des différentes composantes du microenvironnement tumoral ou de la drogue sur la progression tumorale dans le temps. Ce modèle peut être utilisé pour développer une gamme de cellules cancéreuses (cancer du poumon, cancer du sein, sarcome etc.) dans une mise en place de laboratoire.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Écouvillon mâle</td></tr><tr>à<td>la chlorhexidine</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 18</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 cravate en soie</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Pompe Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Tête de pompe Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Cartouche de pompe Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tube Tygon</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>Tube de pompe MasterFlex</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Connecteurs Luer lock femelles</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Connecteurs Luer lock mâles</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>anneau en nylon noir</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Set intraveineux</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (FDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Oxygénateur en silicone</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, États-Unis</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-Wire</td></tr> <tr><td>mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Fil</td></tr><tr><td>Femelle luer Lug Style TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>Bague de verrouillage intégrale luer mâle à la série 200 Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Coupleur de style filetage luer femelle</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur Clave</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo et commerce ; Robinet d’arrêt 4 voies avec serrure luer mâle pivotante</td><td>Médical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Tube de pompe</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>pour canule</td></tr></tbody></table>

cellulaire et acellulaire poumon modèle pour étudier les métastases tumorales

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Il est difficile d’isoler des cellules tumorales à différents moments de la progression tumorale. Nous avons créé un modèle ex vivo du poumon qui peut montrer l’interaction des cellules tumorales avec une matrice naturelle et un flux continuel d’éléments nutritifs, ainsi qu’un modèle qui montre l’interaction des cellules tumorales avec les composants cellulaires normales et naturelles de la matrice. Le modèle de poumon acellulaire ex vivo est créé en isolant un bloc coeur-poumon de rat et enlever toutes les cellules en utilisant le procédé de DÉCELLULARISATION. La bronche principale droite est liée au large et les cellules tumorales sont placés dans la trachée par une seringue. Les cellules se déplacent et remplir le poumon gauche. Le poumon est ensuite placé dans un bioréacteur où l’artère pulmonaire reçoit un flux continu de médias dans un circuit fermé. La tumeur sur le poumon gauche est la tumeur primitive. Les cellules tumorales qui sont isolées dans les médias circulants sont en circulation les cellules tumorales et les cellules tumorales dans le poumon droit sont des lésions métastatiques. Le modèle de poumon cellulaires ex vivo est créé en sautant le processus DÉCELLULARISATION. Chaque modèle peut être utilisé pour répondre aux questions de recherche différents.

Le poumon récolté rat maintient intact système vasculaire et les alvéoles11 (figures 3 a et 3 b). Après DÉCELLULARISATION, les composants de la matrice extracellulaire d’un poumon acellulaire, telles que l’élastine, collagène et la fibronectine sont préserver11 (Figure 3, 3D, 3Eet 3F). La DÉCELLULARISATION conduit à...

Nous présentons ici un protocole pour un ex vivo du poumon Cancer du modèle qui imite les étapes de la progression tumorale et contribue à isoler une tumeur primaire, diffuser les cellules tumorales et les lésions métastatiques.

Cellulaire et acellulaire poumon modèle pour étudier les métastases tumorales

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à la progression tumorale. Le modèle pulmonaire acellulaire et cellulaire ex vivo permet la formation d’une tumeur primaire qui se développe au fil du temps et forme des cellules tumorales circulantes et des lésions métastatiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier la progression du cancer dans un temps abrégé et la croissance de différents types de cellules cancéreuses.Les implications de cette technique s’étendent à notre thérapie personnalisée, car les cellules tumorales des patients peuvent être utilisées dans le modèle pour évaluer l’efficacité de médicaments thérapeutiques, y compris les cellules immunitaires. Commencez avec un rat profondément anesthésié. Rasez la poitrine et l’abdomen et essuyez la peau avec un tampon de chlorhexidine.Après avoir ouvert la cavité thoracique, effectuez une thoracotomie bilatérale en coupant le côté antérieur de la cage thoracique à gauche du côté droit du diaphragme. Tenez la cage thoracique vers le haut et injectez deux millilitres de 1000 unités par millilitre d’héparine dans le ventricule droit du cœur battant à l’aide d’une aiguille de calibre 27 pour empêcher la formation de caillots sanguins dans les poumons. Après avoir retiré la cage thoracique, placez une aiguille de calibre 18 dans le ventricule gauche comme un évent pour permettre au sang de s’échapper, puis utilisez une aiguille de calibre 25 pour injecter 15 millilitres de 12,5 unités par millilitre de PBS hépariné dans le ventricule droit.Ensuite, coupez la trachée à la base de la thyroïde et retirez soigneusement l’aorte descendante au niveau de la veine hémiazygos et les branches de l’aorte au niveau de l’arcade. Après avoir retiré le bloc cœur-poumon de la cavité thoracique, coupez la moitié des ventricules droit et gauche, puis placez une canule à aiguille en acier inoxydable de calibre 18 faite sur mesure à travers le ventricule droit dans l’artère pulmonaire principale. Fixez la canule avec l’attache en soie 2-0 et exposez soigneusement le ventricule et l’oreillette droits.Commencez par faire fonctionner le PBS hépariné à une pression de perfusion physiologique de 30 millimètres de mercure jusqu’à ce qu’il s’écoule librement dans la bouteille de l’unité de décellularisation, puis fixez le bloc cœur-poumon à l’unité de décellularisation à l’extrémité de l’artère pulmonaire à travers la canule de l’artère pulmonaire. Après 15 minutes de lavage avec du PBS hépariné, remplacez la bouteille de PBS héparinée par une contenant 0,15 % de dodécylsulfate de sodium et de l’eau déminéralisée, et perfuser le poumon pendant deux heures pour la décellularisation. Après la décellularisation, perfuser de l’eau autoclavée désionisée à travers l’échafaudage pulmonaire pendant 15 minutes, suivie d’un détergent non ionique à 1 % dans de l’eau désionisée pendant 10 minutes.Enfin, remplacez le flacon par 500 millilitres de PBS autoclavé complété par des antibiotiques. Faites fonctionner la pompe à six millilitres par minute et perfuser les poumons pendant 72 heures, après quoi le poumon acellulaire est prêt à être utilisé immédiatement. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur la cartouche de la pompe et configurez l’oxygénateur en connectant l’extrémité de sortie de l’oxygénateur au tube de la pompe et l’autre extrémité à un tube de 1,5 pied dans le bioréacteur.Installez la bouteille du bioréacteur dans une enceinte de biosécurité dans des conditions aseptiques. Fixez un robinet d’arrêt à trois voies à la tête d’un Luer lock femelle pour contrôler le débit dans l’artère pulmonaire, puis connectez un robinet d’arrêt à un autre verrou Luer femelle pour l’ensemencement des cellules à travers la trachée. Connectez un tube de deux pouces à l’extérieur et un tube de six pouces à l’intérieur de la bouteille pour faire circuler le fluide.Préparez le tube pour connecter la bouteille du bioréacteur à l’oxygénateur. Installez un verrou Luer mâle sur un tube de deux pieds et fixez un crampon Luer femelle de style T pour assurer l’accessibilité, et fixez un verrou Luer mâle et un verrou Luer femelle à deux tubes de pied. Ajoutez du milieu de culture cellulaire et transférez le bioréacteur dans l’incubateur.Connectez le tube de l’oxygénateur aux deux extrémités ouvertes pour en faire un bioréacteur en boucle fermée. Pré-faites fonctionner la pompe à six millilitres par minute pour remplir l’oxygénateur et les tubes avec du milieu de culture afin qu’il n’y ait pas de bulles d’air dans le tube. Une fois les tubes remplis de fluide, fermez le robinet d’arrêt et débranchez les oxygénateurs des deux extrémités de la bouteille du bioréacteur.Placez la bouteille du bioréacteur dans l’enceinte de biosécurité, passez le milieu de culture à travers le robinet d’arrêt et fixez la canule pulmonaire de l’échafaudage pulmonaire. Si vous travaillez avec le modèle de poumon cellulaire, sautez la décellularisation. Le poumon prélevé peut être placé de manière dyadique dans le bioréacteur.Passez à nouveau le milieu de culture à travers le robinet d’arrêt unidirectionnel pour éliminer l’air et attachez la canule trachéale à la trachée par un fil de soie, puis fermez le bouchon de la bouteille du bioréacteur. Transférez le bioréacteur dans l’incubateur et démarrez la pompe. Passez le milieu de culture pendant 10 à 15 minutes pour vous assurer que tous les lobes sont gonflés et que le poumon semble en bon état.Modifier l’échafaudage pulmonaire acellulaire ou cellulaire comme suit pour le modèle métastatique. Ouvrez le capuchon du bioréacteur avec l’échafaudage pulmonaire suspendu et utilisez une seringue Luer lock pour faire passer cinq millilitres de milieu de culture à travers la trachée. Utilisez une pince angulaire pour passer la soie 2-0 à travers la trachée au point de bifurcation.Attachez la trachée en allant vers le poumon droit au point de bifurcation et vérifiez la libre circulation du milieu à travers la trachée vers le poumon gauche en passant le milieu de culture. Préparez un volume de 50 millilitres de cellules cancéreuses du poumon telles que A549 ou H1299 dans un milieu de culture complet RPMI 1640 à une concentration de deux à trois millions de cellules par millilitre. Placez une seringue Luer lock de 20 millilitres sur le dessus de la canule trachéale et ajoutez 15 millilitres de cellules dans la seringue.Laissez la suspension cellulaire passer à travers les lobes pulmonaires par gravité. Ajoutez le reste des cellules avant que les bulles d’air ne passent. Une fois ensemencée, retirez la seringue et attendez 15 minutes, puis ajoutez du milieu frais dans le bioréacteur.Remettez-le dans l’incubateur et, après avoir éliminé toutes les bulles d’air, perfuser l’échafaudage pulmonaire à six millilitres par minute. L’histopathologie d’un poumon intact montre les alvéoles et les pneumocytes. Comme on le voit ici, la décellularisation conduit à l’élimination complète des cellules pulmonaires, et l’histopathologie des poumons acellulaires révèle une membrane basale intacte.La coloration au pentachrome et à l’élastine d’un poumon décellularisé révèle la présence de collagène, de fibrine et d’élastine avec un système vasculaire et des bronches intacts. L’analyse de l’ADN du poumon décellularisé montre une réduction de la teneur en ADN de plus de 99 %Le poumon acellulaire peut être utilisé directement dans le bioréacteur pour la culture cellulaire. Une analyse histologique montre la présence d’une croissance tumorale.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’injecter l’héparine dans le ventricule droit du cœur. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer pour explorer les altérations génétiques et épigénétiques conduisant à la métastase des cellules tumorales dans le cancer du poumon.

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Cet article décrit les procédures d'un essai de métastases expérimentales qui est utilisé pour déterminer le potentiel métastatique de lignées cellulaires humaines de cancer.

Assay Métastases expérimentales

Une métastase pulmonaire expérimentale et CTL modèle de souris d'immunothérapie pour l'analyse de l'interaction des cellules tumorales des...

Métastases expérimentales et CTL Modèle adoptifs souris Transfert immunothérapie

L’objectif de ce protocole est d’étudier la tumorigenèse mammaire. Avec cette technique, les tumeurs mammaires de souris sont retirées et des cellules primaires sont préparées à partir des tumeurs. Un protocole d’extraction pulmonaire est inclus pour l’étude des métastases pulmonaires. De plus, un autre protocole d’analyse des fibroblastes embryonnaires de souris à partir de l’embryon de souris est inclus.

Tumeur primaire et MEF cellule d&#39;isolement pour étudier métastases pulmonaires

Cet article décrit une méthode pour quantifier l’accumulation de cellules de tumeur dans les poumons dans un modèle animal de métastases tumorales.

Analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire

Nous décrivons une méthode relativement simple pour ex vivo l'imagerie en direct de la tumeur interactions cellule-stroma dans les métastases du poumon, en utilisant journalistes fluorescentes chez la souris. Utilisation à disque rotatif microscopie confocale, cette technique permet de visualiser les cellules vivantes pendant au moins 4 heures et peut être adapté à l'étude d'autres maladies pulmonaires inflammatoires.

Ex vivo l&#39;imagerie en direct de métastases pulmonaires et leur microenvironnement

La capacité des clones métastatiques à coloniser des sites distants dépend de leur capacité de prolifération et/ou de leur capacité à survivre dans le microenvironnement hôte sans prolifération significative. Ici, nous présentons un modèle animal qui permet une visualisation quantitative des deux types de colonisation hépatique par des clones métastatiques.

Avancée Modèle animal de colorectal métastatique du foie: Techniques d&#39;imagerie et propriétés des métastatiques Clones

L’objectif de cet article est de fournir une description détaillée du protocole pour le dosage de métastase pulmonaire (PuMA). Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier la croissance des cellules dans les tissus pulmonaires à l’aide d’une fluorescence widefield ou microscope confocal à balayage laser ostéosarcome métastatique (OS).

Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires

Un modèle animal est nécessaire pour décrypter le rôle des cellules tumorales (CTC) dans la promotion de la colonisation lors de métastases du cancer pulmonaire en circulation. Ici, nous avons mis en place et a effectué avec succès une in vivo test d’essai spécifiquement l’exigence de la fibronectine polymériques (polyFN) Assemblée sur CTC pour la colonisation de poumon.

La mise en place d’un essai de colonisation poumon pour la visualisation de cellules de tumeur dans les tissus pulmonaires en circulation

L’injection intraveineuse de cellules cancéreuses est souvent utilisée dans la recherche sur les métastases, mais la charge tumorale métastatique peut être difficile à analyser. Ici, nous démontrons un modèle d’injection de métastases dans la veine de la queue et incluons une nouvelle approche pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique qui en résulte.

Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

Nous présentons ici un protocole pour l’implantation chirurgicale d’une fenêtre optique à demeure permanente pour le thorax murin, qui permet une imagerie intravitale à haute résolution du poumon. La permanence de la fenêtre la rend bien adaptée à l’étude des processus cellulaires dynamiques dans le poumon, en particulier ceux qui évoluent lentement, tels que la progression métastatique des cellules tumorales disséminées.

Une fenêtre permanente pour enquêter sur les métastases cancéreuses au poumon

Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

In vivo Imagerie pour mesurer les métastases pulmonaires spontanées de cellules tumorales mammaires injectées orthotopiquement

Découvrez un modèle pulmonaire ex vivo cellulaire et acellulaire pour étudier la progression tumorale et les métastases. Cette technique permet d'isoler des tumeurs primaires, des cellules tumorales circulantes et d'évaluer l'efficacité thérapeutique.

Cellulaire et acellulaire poumon modèle pour étudier les métastases tumorales

Explorer plus de vidéos