Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de l’efférocytose, telles que le rôle des molécules de signalisation dans la médiation de l’absorption des cellules apoptotiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une quantification claire de l’absorption des cellules apoptotiques, y compris l’absorption partielle ou fragmentaire des cellules apoptotiques, ce qui n’est pas toujours évident avec d’autres méthodes. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’efférocytose par les cellules immunitaires, elle peut également être appliquée à d’autres types de cellules, telles que les cellules épithéliales ou cancéreuses.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à optimiser les paramètres d’acquisition du microscope. Après avoir préparé les macrophages humains et les cellules apoptotiques de Jurkat, utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules apoptotiques. Transférez ensuite une quantité suffisante de cellules apoptotiques dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Granulez les cellules Jurkat par centrifugation à 500 fois g pendant cinq minutes. Remettez ensuite les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS. Pendant que les cellules Jurkat sont dans la centrifugeuse, aliquote 10 microlitres de DMSO dans un nouveau tube de microcentrifugation.

Ensuite, dissolvez une quantité minimale de NHS-Biotine dans le DMSO. Après cela, transférez 500 microlitres de la cellule apoptotique et de la suspension PBS dans le tube contenant du DMSO et de la NHS-Biotine. Ensuite, diluez un colorant de suivi cellulaire approprié selon les instructions du fabricant.

Incuber la suspension cellulaire à température ambiante pendant 20 minutes dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez un volume égal de RPMI 1640 avec 10 % FBS et incubez la suspension à température ambiante dans l’obscurité pendant cinq minutes supplémentaires. Après cela, granulez les cellules par centrifugation à 500 fois g pendant cinq minutes.

Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules colorées dans 100 microlitres de RPMI 1640 avec 10 % FBS. Ajoutez 100 microlitres de suspension de cellules colorées goutte à goutte à chaque puits de macrophages. Ensuite, centrifugez la plaque à 200 fois g pendant une minute.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 dans un incubateur de culture tissulaire. Après la période d’incubation appropriée, retirez les cellules de l’incubateur. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS.

Après cela, ajoutez de la streptavidine diluée conjuguée à la FITC dans chaque puits. Et incubez l’assiette pendant 20 minutes dans l’obscurité. Lavez les cellules trois fois avec un millilitre de PBS et secouez doucement les échantillons pendant cinq minutes après chaque rinçage.

Fixez ensuite les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Rincez les cellules une fois avec du PBS pour éliminer tout excès de PFA. Fixez des lamelles sur une lame d’imagerie et transférez la lame dans un microscope à fluorescence.

Capturez des piles Z d’un nombre suffisant de cellules pour la quantification. Il est essentiel de régler la distance entre ces sections de manière à ce que tout le matériau apoptotique englouti soit détecté. La distance maximale entre ces sections ne doit pas être supérieure à la profondeur focale de votre objectif, généralement de 0,5 à un micromètre.

Chargez l’une des piles Z dans le logiciel à l’aide de la fonction Importer. Sélectionnez ensuite Densité intégrée comme option de mesure dans le panneau Définir les mesures. L’analyse est plus facile à effectuer si les canaux de teinture de suivi de la streptavidine et des cellules sont affichés en superposition.

Tout objet présentant une coloration à la streptavidine n’importe où le long d’une circonférence doit être considéré comme positif à la streptavidine et, par conséquent, ne doit pas être quantifié comme négatif à la streptavidine. Une fois l’image chargée, à l’aide de la streptavidine et de l’outil de sélection à main levée ou de polygone, encerclez tous les négatifs négatifs à la streptavidine dans un seul plan de la pile Z. Ensuite, mesurez l’intensité intégrée du colorant de suivi cellulaire dans la région.

Dans la même section Z, utilisez la coloration à la streptavidine et l’outil de sélection à main levée ou polygonale pour entourer toute la cellule de suivi du colorant positif positif à la streptavidine. Enfin, mesurez l’intensité intégrée de cette région. Grâce à cette procédure, plus de 95 % des cellules Jurkat traitées avec de la staurosporine sont passées par l’apoptose.

Dans la plupart des expériences, la fraction de cellules apoptotiques qui sont efférocytosées a augmenté de manière dépendante du temps. Lors de l’optimisation de ce protocole pour différents types de cellules efférocytaires, ou différentes cibles de cellules apoptotiques, il est important de tester la gamme de rapports entre cellules apoptotiques et cellules efférocytaires. Habituellement, les ratios de 10 pour un ou de 30 pour un fonctionnent le mieux.

Cette procédure peut être facilement modifiée pour suivre l’activation des molécules de signalisation, ou le trafic intracellulaire en exprimant des gènes rapporteurs fluorescents dans les cellules efferocytaires, permettant ainsi d’imager ces processus pendant l’efférocytose.