Name: Préparation d’une Culture de cellules primaires de haute qualité de poisson hypophyses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Apprenez à préparer des cultures primaires d'hypophyse de medaka (Oryzias latipes) avec une viabilité cellulaire supérieure à 90 %. Cette méthode optimise température, osmolalité et pH pour étudier la physiologie endocrinienne.

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Ce projet a été financé par l’Université norvégienne de Sciences de la vie et le Conseil de recherche norvégien, numéro de licence 243811 et 244461 (programme d’Aquaculture). Nous sommes reconnaissants à Lourdes Castelain Tan à l’Université norvégienne des Sciences de la vie pour le maintien de l’usine de poisson.

L’expérimentation animale dans cette étude ont été approuvées par l’Université norvégienne de Sciences de la vie, les directives suivantes pour les soins et le bien-être des animaux de recherche.
1. préparation des Solutions
<ol><li>Étalonner les instruments d’osmomètre et pH mètre selon les instructions du fabricant pour assurer des mesures correctes.</li>
	<li>
Préparer 500 mL de Ca2 +- et Mg2 +-libre tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD), ajuster le pH à 7,75 (étape 1.2.1) et l’osmolalité à 290 mOsm/kg (étape 1.2.2) avant une filtration stérilisante (étape 1.2.3).
	<ol>
<li>Ajuster le pH à 7,75 avec un pH-mètre calibré en ajoutant avec précaution les gouttes d’une solution de NaOH 1 M en remuant soigneusement la solution.</li>
		<li>Mesurer l’osmolarité de la solution en utilisant un osmomètre calibré et calculer la quantité de mannitol nécessaire à l’augmentation de l’osmolalité à 290 mOsm/kg. Ajouter la quantité requise de mannitol et ensuite mesurer l’osmolarité de la solution pour vérifier l’ajustement correct. Remarque : La quantité de mannitol nécessaire dépend de l’osmolalité mesurée, qui varie généralement entre différents lots. Une molécule de mannitol est égale à 1 particule osmotique.</li>
		<li>Stérile-filtrer la solution SPD à l’aide d’un filtre de 0,2 µm. Remarque : La solution peut être conservée à 4 ° C pendant au moins 3 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 500 mL de milieu de culture de Leibovitz (L-15) sans L-glutamine et du bicarbonate et compléter avec 10 mM NaHCO3 (étape 1.3.1), 4,5 mM de glucose (étape 1.3.2) et 2 mM de glutamine disponible dans le commerce (étape 1.3.3). Ajuster la solution à 290 mOsm/kg (étape 1.3.4), filtre stérile (étape 1.3.5) et ajouter 2,5 mL d’une solution de pénicilline-streptomycine (point 1.3.6). Remarque : La solution peut être conservée à 4 ° C pendant au moins 4 semaines.<ol>
<li>Ajouter 420 mg de NaHCO3 / 500 mL de milieu de culture pour parvenir à une solution de 10 mM.</li>
		<li>Ajouter 405 mg de glucose par 500 mL de milieu de culture pour parvenir à une solution de 4,5 mM.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de 100 actions de x d’une solution de glutamine dans 500 mL de milieu de culture pour parvenir à une solution de 2 mM. Remuer jusqu'à ce que tous les solutés sont dissous.</li>
		<li>Ajuster la solution à 290 mOsm/kg avec mannitol en utilisant un osmomètre (interprété dans temps 1.2.2).</li>
		<li>Effectuer une filtration stérile du milieu L-15 filtre 0,2 µm.</li>
		<li>Après la filtration stérile, ajouter 2,5 mL d’une solution de pénicilline-streptomycine, correspondant à 50 U/mL de pénicilline et de 50 µg/mL de streptomycine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 50 mL d’une solution de trypsine à l’aide de 1 mg/mL de type de la trypsine (0,1 %) II-S dissous dans la mis à jour le SPD (préparé à l’étape 1.2). Faire des parties aliquotes de 2 mL dans des tubes stériles en plastique et les conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation. Remarque : Les aliquotes de 2 mL peuvent être stockés à-20 ° C pendant au moins 3 mois.</li>
	<li>Préparation de 50 mL d’une solution d’inhibiteur de trypsine à l’aide de 1 mg/mL (0,1 %) la trypsine inhibiteur type j’ai-s et compléter avec 2 µg/mL de DNase j’ai dissous dans la mis à jour le SPD (préparé à l’étape 1.2). Faire des parties aliquotes de 2 mL dans des tubes stériles en plastique et les conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation. Remarque : Les aliquotes de 2 mL peuvent être stockés à-20 ° C pendant au moins 3 mois.</li>
</ol>2. préparation du matériel
<ol><li>Préparer les pipettes en verre par la pointe pour la dissociation cellulaire de polissage au feu. Faire des trucs avec 2 catégories de taille différente (une ouverture moyenne de 0,6 – 0,8 µm et une petite ouverture de 0,4 à 0,6 µm) en jouant avec le temps et la distance de la flamme tout en tournant simultanément la pipette. Placer les pipettes de verre dans un récipient en verre propre et autoclave (en utilisant le mode solid à 105 ° C pendant 45 min).</li>
	<li>Préparer une boîte en polystyrène avec de la glace.</li>
	<li>Préparez un tube en plastique avec 1,5 mL de mis à jour le SPD (préparé à l’étape 1.2) pour transférer l’hypophyse au cours de la dissection et de garder sur la glace.</li>
	<li>Préparer un tube de 15 mL, 10 ml de mis à jour le SPD (préparé à l’étape 1.2) et les conserver sur la glace jusqu'à la dissociation cellulaire.</li>
	<li>Préparer fraîches ou décongeler des aliquotes de la trypsine et de la solutions d’inhibiteur de la trypsine (préparées à l’étape 1.4 et 1.5) et garder sur la glace jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Mettre le bain d’eau à 26 ° C avant de commencer la dissection afin de permettre à l’eau à la température désirée avant la dissociation chimique de l’hypophyse.</li>
	<li>Nettoyez tous les outils de dissection avec l’éthanol à 70 % avant, pendant et après l’utilisation, y compris des pinces fines à utiliser pour la dissection et de fines aiguilles et d’une plaque de cire pour épingler le poisson. Utiliser des gants propres (changer et nettoyer fréquemment) pendant toute la procédure pour éviter une éventuelle contamination des cellules.</li>
</ol>3. hypophysaire Dissection et Dissociation cellulaire
<ol><li>Euthanasier le poisson en l’immergeant dans la neige fondante de glace (0 ° C). Laisser le poisson dans la bouillie de glace pendant au moins 1 minute pour s’assurer un choc hypothermique irréversible. NOTE : Perte d’équilibre et d’immobilisation surviendra après quelques secondes. Assurez-vous que le poisson soit totalement immergé dans l’eau glacée et ne se trouve pas sur le dessus de la glace, car ce dernier va entraîner la suffocation et potentielle peau brûle au lieu d’un choc hypothermique, rapid et sans cruauté.</li>
	<li>Rapidement transférer les poissons dans un filet sur une plaque de cire sous le microscope à dissection et détruire la colonne vertébrale par un coup de poing de l’aiguille à travers le col.</li>
	<li>Épinglez la tête du poisson sur la plaque de cire à l’aide de fines aiguilles, en insérant une aiguille à l’avant (sur la bouche) et un de chaque côté de la tête (derrière le cerveau) pour stabiliser la tête avant la dissection.</li>
	<li>Voir les poissons sous le microscope à dissection et grattez doucement les écailles au dessus de la tête à l’aide de pinces fines avec un embout coudé.</li>
	<li>Soigneusement, insérer l’extrémité inclinée de la pince fine sous la peau du côté de la tête et enlever le toit crânien en déplaçant lentement la pince dans la direction de la bouche, tout en tenant fermement à la pince enfermant le crâne.</li>
	<li>Couper la moelle épinière complètement à l’aide de pinces avec un embout coudé. NOTE : Temps est un facteur important, afin de travailler efficacement et avec précision pour limiter le temps passé de la dissection de la glande pituitaire jusqu'à ce que les cellules sont plaqués dans l’assiette. Après quelques essais, dissection hypophysaire devrait prendre environ 2 à 3 min par poisson, dont seulement environ 10 s sont nécessaires pour prendre l’hypophyse quand le cerveau est déjà exposé.</li>
	<li>Retournez soigneusement le cerveau vers la bouche pour exposer l’hypophyse et il disséquer avec une pince propre avec une pointe droite. Transférer l’hypophyse dans un tube en plastique contenant 1,5 mL modifiée SPD (pour plus de détails, reportez-vous à l’étape 2.3) mis dans la glace. Vérifier l’extrémité de la pince au microscope pour s’assurer que l’hypophyse est correctement ajoutée au tube et rien n’est laissé sur la pince. NOTE : Disséquer les hypophyses autant que nécessaire, selon le nombre de récipients de culture qui vont être préparés simultanément. En règle générale, calculer au moins 10 hypophyses de poissons adultes par plat a une densité appropriée des cellules (qui dépend de l’application en aval).</li>
	<li>Tournez en bas les hypophyses dans une centrifugeuse de table pour 1 – 2 s à température ambiante. Retirez le SPD à l’aide d’une pipette de verre délicatement et veiller à ne pas enlever les glandes pituitaires.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de la solution de trypsine (préparée à l’étape 1.4) pour laver les hypophyses, leur filer vers le bas dans une centrifugeuse de table pour 1 – 2 s et enlever la majeure partie du liquide à l’aide d’une pipette de verre avant d’ajouter 1 mL de solution de trypsine supplémentaire.</li>
	<li>Incuber le tube dans un bain d’eau à 26 ° C pendant 30 min, de préférence avec agitant doucement, ou vous pouvez également feuilleter le tube quelques fois au cours de la période d’incubation.</li>
	<li>Tournez en bas les hypophyses dans une centrifugeuse de table pour 1 – 2 s à la température ambiante et assurez-vous que toutes les glandes pituitaires sont situés au fond du tube. Enlever la plus grande partie de la solution de trypsine avec une pipette de verre et ajouter 1 mL de la solution d’inhibiteur de la trypsine (préparée à l’étape 1.5) pour inactiver la trypsine et laver la glande pituitaire.</li>
	<li>Collecter les hypophyses au fond du tube en les tournant vers le bas dans une centrifugeuse de table pour 1 – 2 s à température ambiante. Enlever la majeure partie du liquide avec une pipette de verre et ajouter 1 mL de la solution d’inhibiteur de la trypsine (préparée à l’étape 1.5). Placer le tube sur un bain d’eau à 26 ° C pendant 20 min, de préférence avec agitant doucement, ou vous pouvez également feuilleter le tube quelques fois au cours de la période d’incubation pour inactiver la trypsine.</li>
	<li>Préparer une boîte de Petri 35 mm cellule poly-d-lysine-enduit avec un fond de verre central en ajoutant 2 mL de milieu de L-15 et qui laisser incuber pendant au moins 10 min à 26 ° C et avec 1 % de CO2 pour qu’il peut atteindre la bonne température et le pH avant les cellules de placage. NOTE : Une boîte de Petri de cellule en plastique peut également être utilisé. L’avantage principal d’utiliser un plat avec un fond de verre centralisé est que la zone où les cellules sont plaqués est plus petite, et donc, moins de cellules hypophysaires sont tenus par plat. Certaines applications en aval peuvent également nécessiter un fond de verre (par exemple, certaines techniques d’imagerie).</li>
	<li>Définissez la centrifugeuse de refroidissement pour les tubes de 15 mL à 4 ° C, pour lui permettre d’atteindre la température désirée avant de commencer la dissociation mécanique.</li>
	<li>Recueillir l’hypophyse au bas du tube de la filature vers le bas le tube avec la solution d’inhibiteur de la trypsine (de l’étape 3.11) dans une centrifugeuse de table pour 1 – 2 s à la température ambiante et s’assurer que toutes les glandes pituitaires sont situés au fond du tube avant soigneusement élimination de la plupart de la solution d’inhibiteur de trypsine à l’aide d’une pipette de verre. Remarque : Effectuez toutes les étapes suivantes du protocole dans un banc de flux laminaire (LAF), certifiés pour le travail de la cellule éviter une contamination des cellules.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de glacee SPD modifiés (préparé à l’étape 2.4) dans les pièces de tissu hypophysaire et sucer doucement les morceaux de tissus haut et bas (6 – 7 x) dans une pipette de verre poli au feu (préparée à l’étape 2.1). Remarque : La température est un aspect essentiel, afin de garder toutes les solutions à 4 ° C. Partir de ce moment, exécutez toutes les étapes sur la glace lorsque cela est possible.</li>
	<li>Tournez en bas les morceaux de tissus dans une centrifugeuse de table pour 1 – 2 s à la température ambiante et transvaser avec soin la partie supérieure de la SPD contenant les cellules dissociées (presque 1 mL) dans un nouveau tube de 15 mL mis dans la glace. Évitez de déplacer la pipette vers le bas du tube où les morceaux de tissus sont laissés.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.16 – 3.17, dissocier les cellules dans 1 mL de SPD glacé à la fois, jusqu'à ce que tous les 10 mL de SPD est utilisé. Commencer à utiliser une pipette de verre avec une ouverture de taille moyenne et l’interrupteur à une pipette de verre avec une ouverture plus petite vers la fin (pour les dernier 3 – 4 mL de SPD ajouté) de la dissociation. S’il y a des morceaux de tissus encore visibles vers la fin de la procédure de dissociation, augmenter le pipetage à environ 10 x vers les 2 dernières étapes du SPD pour la dissociation et enfin laisser les morceaux de tissu résiduel. Remettre en suspension les cellules doucement et éviter de créer des bulles car cela pourrait causer des dommages aux cellules lorsque les cellules s’attachent à la surface des bulles. NOTE : C’est une étape essentielle du présent protocole et nécessite une formation pour obtenir un bon résultat.</li>
	<li>Équilibrer le tube dans la centrifugeuse (préalablement refroidi à 4 ° C) et la centrifuger les cellules à 200 x g pendant 10 min à 4 ° C. Assurez-vous de marquer le côté du tube où sera le culot cellulaire.</li>
	<li>Retirer délicatement le tube de la centrifugeuse et transférer délicatement le surnageant avec une pipette de verre à un tube en plastique vide de 15 mL directement après la centrifugation. N’oubliez pas de retirer la plupart de surnageant, mais veiller à ne pas perdre la petite pastille de cellule (souvent invisible).</li>
	<li>Soigneusement Resuspendre le culot dans 50 à 100 µL de milieu de culture L-15. NOTE : À cette étape, il est possible de compter les cellules et/ou effectuer un test de viabilité (comme une cellule de comptage en présence de bleu de trypan utilisant un hémocytomètre), mais attention qu’utilisant une partie de la suspension cellulaire pour cela fera baisser le rendement. Évitez d’utiliser un volume de suspension grand car il va augmenter le risque de diffusion en dehors du centre de l’assiette des cellules.</li>
	<li>Soigneusement égoutter les cellules dissociées dans le milieu de la boîte de Petri de cellule contenant 2 mL du milieu L-15 (préparé à l’étape 3.13). Laissez les cellules à couler au fond du plat pendant environ 5 min avant de les dans l’incubateur, afin d’éviter que les cellules se propager à l’extérieur de la partie engloutie du fond du verre.</li>
	<li>Incuber le plat à 26 ° C et 1 % de CO2 pour permettre à toutes les cellules à couler abondamment et attacher au fond du plat.</li>
	<li>Après 30 min, regardez les cellules au microscope pour s’assurer qu’ils ont attaché à la boîte de Pétri.</li>
	<li>Continuer à incuber les cellules à 26 ° C et 1 % de CO2.</li>
	<li>Modifier avec soin la plupart (mais pas tous) le support tous les 3-4 jours. Remarque : Évitez de changer le milieu plus fréquemment, car cela peut perturber les cellules et leur faire détacher le fond de verre. Utiliser les cellules pour des expériences moins d’une semaine après les semis.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Systèmes de culture in vitro cell fournissent des outils puissants pour les chercheurs de répondre à une multitude de questions biologiques si utilisé dans le droit chemin1. Il est important de se rappeler que les cellules dissociées qui ont perdu leurs connexions aux cellules voisines peuvent avoir obtenu des propriétés fonctionnelles différentes qu’ils avaient initialement in vivo. Pour éviter d’être au risque d’une mauvaise interprétation des résultats obtenus à partir des exp...

Culture cellulaire est l’un des principaux outils utilisés dans la recherche en biologie moléculaire, grâce à un système excellent modèle pour répondre à des questions biologiques différentes allant de la physiologie cellulaire normale à drogues dépistage et carcinogenèse1. Les cellules primaires, prélevés directement les tissus d’origine animale par des méthodes enzymatiques et/ou mécaniques, sont souvent considérés comme biologiquement plus pertinentes que les lignées cellulaires comme la réaction biologique peut se rapprocher de la situation in vivo . Protocoles pour la préparation de cultures de cellules primaires doivent être optimisés pour chaque type d’espèces et de cellules d’intérêt afin de reproduire les caractéristiques auxquelles une cellule est adaptée et obtenir des résultats significatifs physiologiquement.
Nombreux protocoles décrivent les conditions de culture pour les systèmes cellulaires de mammifères, tandis que les protocoles similaires, décrivant les conditions de culture primaire de cellules de poissons sont plutôt rares en comparaison. Les cellules sont vulnérables aux changements rapides de température, le pH et l’osmolalité et sont particulièrement fragiles lors de la procédure de dissociation. Commerciales solutions salines et milieux de culture utilisés pour les cultures de cellules de mammifères ne sont pas optimaux pour les poissons téléostéens, surtout en ce qui concerne les systèmes tampon de pH et l’osmolalité. Par conséquent, il est important de mesurer et d’ajuster les solutions aux niveaux physiologiquement pertinents de ces paramètres chez les espèces d’intérêt.
Les cultures primaires hypophysaires ont été apportées de plusieurs espèces de poissons téléostéens, notamment la carpe commune (Cyprinus carpio)2,3, herbe la carpe herbivore (Ctenopharyngodon idella)4, cyprin doré (Carassius auratus )5,6de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), l’anguille européenne (Anguilla anguilla)7, le tilapia (Oreochromis mossambicus)8, poisson zèbre (Danio rerio)9, et Morue de l’Atlantique (Gadus morhua)10. Mis à part le réglage de la température d’incubation de l’espèce d’intérêt, plusieurs de ces protocoles ont incubé les cellules de mammifères comme conditions pouvant être sous-optimale pour les espèces d’intérêt, avec un pH de 7,2 à 7,5 en atmosphère humidifiée contenant de 3 à 5 % de CO2. En outre, il est difficile de savoir si l’osmolalité des solutions utilisées pour la préparation de plusieurs de ces cultures de cellules primaires ont été ajustée et stable entre différentes solutions.
Le protocole actuel repose sur des travaux antérieurs avec des cultures primaires de morue de l’Atlantique10 et comprend les réglages de la température d’incubation, osmolalité, pH et pH tampon systèmes, y compris la pression partielle de dioxyde de carbone (pCO2), à la physiologie des médakas (o. latipes). Chez les sujets exposés sont un poisson d’eau douce de petite taille (3 à 4 cm), originaire d’Asie du sud-est. Ces jours-ci, il est utilisé comme une espèce de modèle dans de nombreux laboratoires de recherche dans le monde entier, car il est relativement facile à reproduire et très résistants à beaucoup de maladies poisson commun11. Il y a plusieurs avantages à utiliser des médakas comme modèle, y compris une tolérance à la température de 4 à 40 ° C11, un temps de génération court, embryons transparents, un déterminant le sexe génétique12et un génome séquencé13, ainsi que plusieurs autres ressources génétiques disponibles.
Les conditions de culture primaire dans le présent protocole sont optimisées pour correspondre à la température de 26 ° C régressées conservés à dans l’usine de poisson. En outre, l’osmolalité est ramenée de 320 mOsm/kg de morue vivant dans l’eau salée à 290 mOsm/kg pour le médaka vivant en eau douce et est conforme à l’osmolarité normale de medaka plasma14. En comparaison, l’osmolalité typique du plasma chez les mammifères est de l’ordre de 275 – 295 mOsm15. Poisson vit dans une variété de températures et ont des branchies qui sont en contact direct avec l’eau, ce qui rend la capacité de pH et de la mémoire tampon du sang et de liquide extracellulaire chez les poissons différentes de celles des mammifères. Milieux de culture chez les mammifères comprennent généralement des systèmes tampons qui permettent à un pH d’environ 7,4 lors les médias soient équilibrés à une atmosphère standard de 5 % de CO2 dans l’air humidifié à 37 ° C. Le pH est dépendante de la température et la valeur de pH neutre (en eau) augmente avec une baisse de température16. Typique de poissons téléostéens plasma pH varie de 7,7 à 7,917. L’optimisation du présent protocole notamment une diminution de pH 7,85 cabillaud conservées à 12 ° C à un pH de 7,75 pour médaka maintenue à 26 ° C en augmentant le CO2 de 0,5 % à 1 %.
En outre, la capacité de tampon bicarbonate est très différente dans les poissons et les mammifères. CO2 est facilement échangés sur les branchies chez les poissons et le BCP2 dans l’eau n’est qu’une petite fraction du pCO2 dans le poumon18. Changement de la température ou la pCO2 va changer le pH et le tampon du milieu. Par conséquent, ni le pH ni la pCO2 suggérés en incubant les cellules de mammifères est optimal pour les cellules de poissons, et par conséquent, les milieux de culture doit être optimisée avec des systèmes tampons qui contiennent des valeurs physiologiquement pertinents pour les poissons et les espèce d’intérêt. Ce protocole décrit comment préparer des cultures de cellules primaires de glandes pituitaires médaka et inclut les ajustements de la système d’incubation température, osmolalité, pH et pH tampon, en plus d’autres paramètres importants à considérer lors de la préparation de cellules primaires cultures des espèces non mammifères.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (dPBS), sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)</td><td>D8537</td><td>Ajuster la solution à un pH de 7,75 avec 1M de NaOH et 290 mOsm avec du mannitol.</td></tr><tr><td>Milieu L-15 (Leibovitz), sans L-glutamine</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)</td><td>L5520</td><td>Supplément 500 ml de milieu de culture avec 10 mM de NaHCO3, 4,5 mM de glucose, 2 mM de Glutamax. Ajuster la solution à 290 mOsm avec du mannitol et filtrer la solution à travers un 0,2 & micro ; Filtre stérile en PES, avant d’ajouter 2,5 mL de solution de pénicilline-streptomycine (voir ci-dessous pour plus de détails).</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)</td><td>S5881</td><td>Ajouter des gouttes de la solution 1 M pour augmenter le pH du dPBS et du milieu de culture à 7,75.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)</td><td>S5761</td><td>10 mM de NaHCO3 équivaut à 420 mg par milieu de culture de 500 ml.</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)</td><td>63565</td><td>Utiliser pour augmenter l’osmolalité du dPBS et du milieu de culture. Calculez la quantité correcte nécessaire pour atteindre une osmolalité de 290 mOsm.</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)</td><td>G5400</td><td>4,5 mM&nbsp ; Le D-glucose équivaut à 405 mg par milieu de culture de 500 ml.</td></tr><tr><td>Supplément GlutaMAX</td><td>Gibco (Life Technologies, Paisley, Royaume-Uni)</td><td>35050-061</td><td>Alternative à la L-glutamine, avec une stabilité accrue. 2 mM de Glutamax équivaut à 5 ml de 100x stock dans un milieu de culture de 500 mL.</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)</td><td>P0781</td><td>Solution mère 10 000 unités de pénicilline et 10 mg de streptomycine par ml. Utiliser 2,5 mL de solution mère dans un milieu L-15 de 500 mL (équivalent de 50 U/mL de pénicilline et de 50 &micro ; g/mL de streptomycine).</td></tr><tr><td>Trypsine de type II-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)</td><td>T7409</td><td>Préparer 1 mg/mL dans une solution de dPBS.</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine de type I-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)</td><td>T6522</td><td>Préparer 1 mg/mL dans une solution dPBS, compléter avec 2 &micro ; g/ml Dnase I (voir détails ci-dessous).</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)</td><td>D5025</td><td>Utilisation dans une solution d’inhibiteur de la trypsine (voir ci-dessus).</td></tr><tr><td>0,2 et micro ; m Système de filtration stérile en polyéthersulfone (PES)</td><td>Corning Inc. (Corning, NY)</td><td>431097</td><td>Utilisation pour la filtration stérile du milieu dPBS et L-15 après ajustements.</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire de 35 mm avec fond en verre, revêtement en polyd-lysine</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Peut également être remplacée par une boîte en plastique, en fonction de l’application en aval.</td></tr><tr><td>Pince fine Dumont #5</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11254-20</td><td>Pointe droite</td></tr><tr><td>Pince fine Dumont #5/45</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11253-25</td><td>Pointe coudée 45&deg ;</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope SZ61</td><td>Olympus Corp. (Tokyo, Japon)</td><td></td><td>À utiliser pour la dissection des hypophysaires.</td></tr><tr><td>Alegra X-22R Centrufuge</td><td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td><td></td><td>Avec option de refroidissement (similaire au modèle actuel XR-30).</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Techne (Staffordshire, Royaume-Uni)</td><td></td><td>N’importe quel bain d’eau avec la possibilité de régler la température fera l’affaire.</td></tr><tr><td>Pipettes en verre Pasteur</td><td>VWR (NY)</td><td>612-1701</td><td>Diamètre extérieur 1,6 mm, polissage au feu et autoclave avant utilisation.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table Galaxy MiniStar</td><td>VWR (NY)</td><td>521-2844</td><td>N’importe quelle petite centrifugeuse de table fera l’affaire.</td></tr><tr><td>Aiguilles fines/épingles à insectes</td><td>Outils scientifiques fins (CA)</td><td>26001-40</td><td>Diamètre 0,03 mm. D’autres aiguilles fines peuvent être utilisées à la place.</td></tr><tr><td>Plaque</td><td></td><td></td> de cire <td>fabriquée sur mesure en ajoutant de la cire de paraffine fondue dans une grande boîte de Pétri.</td></tr></tbody></table>

préparation d’une culture de cellules primaires de haute qualité de poisson hypophyses

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Culture cellulaire primaire est un outil puissant couramment utilisé par les scientifiques pour étudier les propriétés cellulaires et les mécanismes des cellules isolées dans un environnement contrôlé. Malgré les grandes différences dans la physiologie entre les mammifères et les poissons, les protocoles de culture de cellules primaires de poissons reposent souvent sur des conditions de culture chez les mammifères, souvent avec des modifications mineures. Les différences environnementales affectent non seulement la température corporelle, mais aussi le sérum sanguin paramètres tels que l’osmolalité, du pH et pouvoir tampon pH. Comme milieux de culture cellulaire et des solutions de travail similaires sont censées imiter les caractéristiques du liquide extracellulaire et/ou sérum sanguin auquel une cellule est adaptée, il est crucial que ces paramètres soient adaptées spécifiquement à l’animal en question.
Le protocole actuel décrit les conditions de culture primaire optimisé pour medaka (Oryzias latipes). Le protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d’isoler et de maintenir en bonne santé dissocient des cellules hypophysaires pendant plus d’une semaine et comprend les étapes suivantes : 1. l’adaptation de l’osmolalité aux valeurs trouvées dans le plasma sanguin de medaka, 2. l’adaptation de la température d’incubation à température normale medaka (ici dans l’installation de l’aquarium) et 3. l’ajustement du pH et du bicarbonate tampon aux valeurs comparables à d’autres espèces de poissons vivant à des températures similaires. Les résultats présentés en utilisant le protocole décrit promouvoir physiologiquement significatives résulats médaka et peuvent être utilisés comme un guide de référence par les scientifiques faisant des cultures de cellules primaires des autres espèces non mammifères.

Ce protocole décrit la préparation d’une culture de cellules primaires de glandes pituitaires médaka et fournit des cellules saines qui peuvent être maintenues dans une culture pendant au moins une semaine. Le protocole repose sur des valeurs pertinentes physiologiques pour le médaka14 et est en outre optimisé pour le tissu hypophysaire chez les poissons adultes, à l’aide d’un pH de 7,75 et une osmolalité de 290 mOsm/kg pendant toute la procédure de la récolte de t...

Nous décrivons ici un protocole pour établir et maintenir des cultures primaires de cellules hypophysaires de medaka (Oryzias latipes). Les conditions optimisées dans le présent protocole compte paramètres importants tels que la température et l’osmolalité pH en imitant les conditions physiologiques du poisson, ce qui permet des résultats physiologiquement plus significatifs.

Préparation d’une Culture de cellules primaires de haute qualité de poisson hypophyses

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’endocrinologie concernant le fonctionnement et l’interaction des cellules hypophysaires dans un environnement contrôlé. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle favorise des résultats physiologiquement significatifs pour le medaka et fournit un guide de référence pour la réalisation de cultures cellulaires primaires à partir d’autres espèces. Commencez par fixer la tête du medaka à la plaque de cire avec une aiguille fine insérée sur la bouche et une de chaque côté de la tête derrière le cerveau.Placez le poisson sous un microscope de dissection et utilisez une pince fine avec une pointe inclinée pour gratter doucement les écailles du haut de la tête. Insérez soigneusement la pince sous la peau du côté de la tête et déplacez lentement la pince vers la bouche pour retirer le toit du crâne. Coupez complètement la moelle épinière avec la pince et retournez soigneusement le cerveau vers la bouche pour exposer l’hypophyse.Récoltez la glande à l’aide d’une pince propre avec une pointe droite dans un tube en plastique contenant 1,5 millilitre de DPBS modifié sur de la glace. Lorsque toutes les hypophyses ont été prélevées, faites tourner les tissus avec une microcentrifugeuse pendant une à deux secondes à température ambiante et utilisez une pipette en verre pour retirer soigneusement le DPBS en prenant soin de ne pas déranger la pastille hypophysaire. Lavez le tissu avec un millilitre de solution de trypsine pendant encore une à deux secondes dans la microcentrifugeuse et utilisez la pipette en verre pour aspirer la majeure partie du surnageant.Lorsque toute la trypsine a été retirée, ajoutez un autre millilitre de trypsine à l’échantillon et incubez le tissu dans un bain-marie à 26 degrés Celsius pendant 30 minutes en effleurant doucement de temps en temps. À la fin de l’incubation, centrifugez les hypophyses pendant une à deux secondes et utilisez une pipette en verre pour retirer la majeure partie de la trypsine sans perturber les tissus. Ensuite, lavez l’échantillon avec un millilitre de solution d’inhibiteur de trypsine pour inactiver la trypsine et centrifugez-le pendant une à deux secondes.Après avoir retiré le surnageant, ajoutez un autre millilitre de solution d’inhibiteur de trypsine dans le tube et incubez l’échantillon dans un bain-marie à 26 degrés Celsius pendant 20 minutes en effleurant. Pendant que le tissu est en incubation, ajoutez deux millilitres de milieu L-15 dans une boîte de culture cellulaire codée en poly-D-lysine de 35 millimètres avec un fond central en verre et équilibrez la plaque à 26 degrés Celsius et 1 % de dioxyde de carbone pendant au moins 10 minutes. À la fin de l’incubation, centrifugez l’hypophyse pendant une à deux secondes et aspirez soigneusement toute la solution inhibitrice de la trypsine du tube.Dans une hotte à flux laminaire, ajoutez un millilitre de DPBS modifié glacé à froid sur les morceaux de tissu hypophysaire et utilisez une pipette en verre poli au feu pour triturer doucement les tissus six à sept fois sur de la glace en prenant soin d’éviter les bulles. Après une autre centrifugation d’une à deux secondes, transférez doucement environ un millilitre de la cellule dissociée contenant la couche supérieure de DPBS dans un nouveau tube de 15 millilitres sur de la glace. Répétez la trituration et la collecte de cellules dissociées neuf fois de plus jusqu’à ce que les 10 millilitres du DPBS aient été utilisés, en commençant par la pointe de la pipette avec une ouverture de taille moyenne et en passant à une pointe de pipette avec la plus petite ouverture pour les trois à quatre derniers millilitres de DPBS.La dissociation mécanique à l’aide d’une pipette en verre est une étape critique de ce protocole et nécessite une certaine formation pour obtenir un bon résultat. Pipetez doucement la solution cellulaire pour éviter d’endommager les cellules dissociées fragiles. Après la 10e trituration, marquez le côté de chaque tube où se trouvera la pastille et faites tourner l’échantillon dans une centrifugeuse pré-refroidie.À la fin de la centrifugation, retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse et utilisez une pipette en verre pour transférer immédiatement mais doucement le surnageant dans un tube en plastique de 15 millilitres en prenant soin d’éliminer la majeure partie du surnageant sans déranger la petite pastille souvent invisible, puis remettez soigneusement la pastille en suspension dans 50 à 100 microlitres de milieu de culture L-15. Versez soigneusement les cellules dissociées au milieu de la boîte de culture cellulaire préalablement préparée et laissez les cellules couler au fond de la boîte pendant environ cinq minutes avant de déplacer la boîte dans l’incubateur pour éviter que les cellules ne se propagent en dehors de la zone enfoncée du fond de verre. Après 30 minutes à 26 degrés Celsius et 1 % de dioxyde de carbone, vérifiez les cellules par microscopie optique pour confirmer qu’elles se sont fixées au fond de la boîte et renvoyez la culture de cellules hypophysaires dissociées dans l’incubateur pendant sept jours maximum.La récolte d’environ 10 hypophyses medaka adultes donne généralement une densité d’environ 50 000 à 100 000 cellules par boîte après l’ensemencement. Le nombre de cellules mourantes est presque constant au fil du temps, avec plus de 95 % des cellules viables après un jour et plus de 90 % encore vivantes après trois jours, avec une légère baisse de la viabilité observée à une semaine de culture. Les enregistrements électrophysiologiques des cellules gonadotropes de l’hormone lutéinisante exprimant la GFP démontrent que les cellules hypophysaires dissociées sont capables d’activer spontanément des potentiels d’action après quatre jours de culture.De plus, lors de la stimulation de l’hormone de libération des gonadotrophines, une hyperpolarisation transitoire initiale de la membrane cellulaire est suivie d’une augmentation spectaculaire de la fréquence de décharge concomitante à la dépolarisation et à l’augmentation de la durée des potentiels d’action. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler de manière précise et efficace pour maintenir les cellules hypophysaires dans un état sain. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la qPCR ou des techniques d’imagerie avancées peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont des traitements spécifiques peuvent modifier la physiologie des cellules hypophysaires.

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