Quantification des protéines solubles végétales et glucides digestibles contenu, à l’aide de maïs (Zea mays) As an Exemplar

Cette méthode permet aux chercheurs dans le domaine des sciences végétales et de l’écologie nutritionnelle de mesurer avec précision les concentrations de protéines solubles et de glucides digestibles dans les tissus végétaux. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles offrent une méthode rapide et facile pour quantifier ces deux macronutriments incroyablement importants avec une grande précision. Ces techniques ont de fortes implications pour le domaine de l’écologie car les protéines végétales et les glucides constituent la base des réseaux trophiques terrestres.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique peuvent avoir des difficultés car il y a plusieurs étapes et certaines techniques qui ne sont pas couramment exécutées dans un laboratoire d’utilisation générale. Pour commencer, pesez des échantillons répétés de chaque tissu dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre étiquetés. Ensuite, enregistrez la masse précise de chaque échantillon.

À l’aide d’une micropipette, ajoutez 500 microlitres d’hydroxyde de sodium à 0,1 molaire dans chaque tube. Fermez bien les couvercles et chauffez les tubes pendant 30 minutes. Ensuite, placez les tubes dans un bain d’eau chaude préchauffé pendant 15 minutes.

Après cela, centrifugez les tubes à 15 000 G pendant 10 minutes. Pipetez le surnageant dans de nouveaux tubes de microcentrifugation étiquetés, à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette pour chaque échantillon. Ajoutez 300 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire à la pastille et répétez la centrifugation pendant 10 minutes.

Après cela, retirez le surnageant et transférez-le dans les tubes contenant le surnageant de la première centrifugation. Pour neutraliser le pH du surnageant, ajoutez 11 microlitres d’acide chlorhydrique 5,8 molaires. Utilisez du papier tournesol pour confirmer que le pH est d’environ sept.

Ensuite, ajoutez 90 microlitres d’acide trichloracétique à 100 % dans chaque tube. Ensuite, incubez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifuger les échantillons à 13 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Utilisez soigneusement une ligne de vide et une pointe de micropipette en verre pour éliminer l’acide trichloracétique. Faites très attention à ne pas déranger le granulé avec l’embout d’aspiration. Ensuite, lavez la pastille avec 100 microlitres d’acétone refroidie à 20 degrés Celsius, puis laissez l’acétone s’évaporer dans une hotte.

Dissoudre la pastille de protéine avec un millilitre d’hydroxyde de sodium. Des cycles supplémentaires de chauffage, de vortex et de chauffage sonique peuvent être nécessaires. Ajoutez 160 microlitres de chaque solution étalon IGG à une plaque de 96 puits en trois exemplaires, en commençant par la position A1 Ensuite, dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, ajoutez 50 microlitres de chaque solution d’échantillon à 950 microlitres d’eau distillée.

Ajoutez ensuite 60 microlitres de chaque échantillon dilué sur la plaque du puits en trois exemplaires, en commençant par la position H1. Ajoutez 100 microlitres d’eau distillée à tous les puits d’échantillonnage vierges et inconnus. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 40 microlitres de colorant protéique Coomassie Brilliant Blue G-250 dans chaque puits de la plaque.

À l’aide d’une aiguille, faites éclater les bulles présentes dans les puits. Après cela, laissez la plaque incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Utilisez ensuite un spectrophotomètre à microplaques pour enregistrer les valeurs d’absorbance de chaque puits à 595 nanomètres.

Tout d’abord, pesez les répétitions de chaque échantillon de tissu dans des tubes en verre de 15 millilitres. Étiquetez les tubes et notez la masse exacte de chaque échantillon. Ensuite, ajoutez un millilitre d’acide sulfurique 0,1 molaire dans chaque tube et fermez bien les bouchons.

Placez ensuite les tubes dans un bain d’eau bouillante pendant une heure. Transférez les tubes dans un bain-marie tiède pour qu’ils refroidissent. Versez ensuite le contenu des tubes dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre étiquetés.

Après cela, centrifugez les tubes à 15 000 G pendant 10 minutes. À l’aide d’une micropipette, transférez le surnageant dans des tubes de 1,5 millilitre nouvellement étiquetés. À l’aide d’une pipette, transférez 15 microlitres de chaque échantillon inconnu dans son propre tube à essai.

Ajoutez ensuite 385 microlitres d’eau distillée dans chaque tube. Dans une hotte, ajoutez 400 microlitres de 5 % de phénol dans chaque tube à essai d’échantillon standard et inconnu. Immédiatement après, ajoutez deux millilitres d’acide sulfurique dans chaque tube.

Assurez-vous d’ajouter l’acide sulfurique à la surface de la solution. Après avoir incubé les tubes pendant 10 minutes, faites tourbillonner les tubes. Ensuite, incubez le tube pendant 30 minutes supplémentaires.

Transférez 800 microlitres de chaque tube d’échantillon dans trois demi-cuvettes en polystyrène de 1,5 millilitre. Ensuite, réglez le spectrophotomètre pour qu’il lise à 490 nanomètres et calibrez avec une cuvette vierge. Enfin, passez chaque cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez l’absorbance.

À l’aide de ce protocole, la teneur en protéines solubles et en glucides digestibles de quatre tissus différents de maïs de grande culture et de maïs sucré de trois régions géographiques a été analysée. Des différences significatives de teneur en protéines solubles ont été observées entre les régions, ce qui a nécessité des analyses distinctes pour chaque région. D’une région à l’autre, il y avait plusieurs différences dans la teneur en protéines solubles et en glucides digestibles entre les tissus.

Dans le Minnesota, la teneur en protéines solubles des tissus ne variait que tandis que celle des tissus de la Caroline du Nord variait à la fois en protéines solubles et en glucides digestibles. La variabilité de la teneur en macronutriments des tissus au Texas dépendait de la variété. Cette technique permettra aux chercheurs du domaine des sciences végétales et de l’écologie nutritionnelle de mesurer précisément les protéines végétales solubles et les glucides digestibles, plutôt que d’extrapoler à partir de mesures élémentaires.

N’oubliez pas que travailler avec de l’azote liquide, des acides et des bases concentrés, peut être extrêmement dangereux. Utilisez donc toujours des précautions telles que des gants, des lunettes de sécurité, des tabliers et des chaussures fermées lorsque vous travaillez avec ces produits chimiques.