Name: PCR quantitative du bactériophage T7 de criblage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Apprenez une méthode de qPCR quantitative pour énumérer le bactériophage T7 avec précision. Cette technique permet une quantification rapide de nombreux échantillons complexes en virologie et microbiologie.

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Ce travail a été soutenu par PhRMA subvention de la Fondation recherche Starter et le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health octroyer sous attribution numéro R01HL138251.

1. amorce conception et analyse de l’ADN génomique Phage T7
<ol><li>Conception des amorces pour l’amplification de l’ADN génomique de phage T7. NOTE : F (avec impatience) et amorces de R (marche arrière) (voir la Table des matières) amplifient la séquence d’ADN T7 située en amont de la région variable de bibliothèque (Figure 1).</li>
	<li>Choisir un analyseur d’apprêt approprié pour évaluer les paramètres des amorces, y compris la température de fusion (Tm), pourcentage contenu de chromatographie gazeuse (GC %), dimères d’amorce, formation en épingle à cheveux et les qualités PCR (Figure 1).</li>
	<li>Commandez les oligonucléotides amorces (oligos) et à l’arrivée, remettre en suspension les oligos lyophilisée dans la DNase et RNase free ultra-pures faire concentrations stock de 100 µM dans un tube à centrifuger 1,5 mL, et conserver à-20 ° C pendant plusieurs mois.</li>
	<li>Faire plusieurs parties aliquotes (environ 50 µL dans chaque tube de 1,5 mL) du stock amorce 100µm. Remarque : Cette étape sert à éviter les cycles de gel-dégel fréquents.</li>
</ol>2. élaborer des normes pour la Quantification de l’ADN génomique de Phage T7
<ol><li>Diluer en série référence de 0,1 µg/µL (1,0 x 108 fg/µL) ADN du phage T7 (acheté ; à une concentration de 0,1 µg/µL, voir matériaux) 10 fois plus de 1,0 x 106 à 1,0 x 100 fg/µL avec ultra purs H2O en tubes PCR de 0,2 mL. Préparer chaque concentration dans un volume total de 20 µL (Figure 2).</li>
	<li>Vortex du PCR tubes pour assurer un mélange complet à chaque étape de dilution. Aussi, changer des conseils lors de l’ajout de l’échantillon d’ADN à la dilution suivante. Remarque : Il est recommandé de préparer la nouvelle solution de normes d’ADN pour une courbe d’étalonnage pour chaque lot de l’expérience de qPCR.</li>
	<li>L’équation 1 (ci-dessous) permet de convertir pour référence phage T7 concentrations d’ADN de fg/µL de copies du génome (gc) /µL (Figure 2).</li>
	<li>Concentration d’ADN de phage T7 en gc/µL = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq1.jpg">(1) NOTE : bp : paires de bases ; Référence T7 l’ADN génomique est 37314 bp.</li>
</ol>3. traitement préalable des échantillons avant de Phage qPCR préparation de réaction
<ol><li>
(Option 1) Pipeter 20 µL d’un clone de T7 (phage) choisis parmi les protéines contre in vitro la fibrose kystique (FK)-comme le modèle de mucus dans les tubes à centrifuger 1,5 mL. Ajouter 1,25 unités de DNase I (0,5 µL) de chaque échantillon de 20 µL. NOTE : Bibliothèque des heptapeptide contraint de cystéine bactériophage T7 (CX7C) a été biopanned contre CF type mucus enduit sur inserts membrane 24 puits (voir Table des matières) pendant 15 min. Des précisions sont fournies dans la section résultats. Un clone de T7 a été choisi pour la préparation de l’éluat qPCR.<ol>
<li>Option 2 : Pipeter 200 µL de la T7 cloner dans des tubes de 1,5 mL et ajouter 5 unités de DNase I (2 µL) à chaque échantillon. Remarque : Le volume d’échantillon de phage sélectionné à cette étape dépend du volume collecté de criblage. Bien que la mise au point du protocole sur la qPCR du phage biopanned, les étapes criblage sont détaillées dans le protocole utilisateur du phage T7 l’ensemble (voir Table des matières)13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Boucher les tubes à échantillon phage T7 (étape 3.1) et les incuber à 37 ° C pendant 10 min dans un Bain thermostaté sec (c'est-à-dire, le bloc chauffant).</li>
	<li>Incuber les tubes (de l’étape 3.2) à 100 ° C pendant 15 minutes dans un Bain thermostaté sec (Figure 3 a). ATTENTION : Puisque l’évaporation et condensation se produisent pendant l’étape de chauffage, assurez-vous que les tubes de centrifugeuse de 1,5 mL sont plafonnées complètement.</li>
	<li>Tournez les phages traité thermiquement à l’étape 3.3 à 18 534 x g pendant 10 s. Mix les phages en plaçant le tube sur un vortex placés à mode de toucher-activation pour 10 s et un essorage à 18 534 x g pendant 10 s à nouveau. Remarque : Le cycle de mélange-spin-spin est pour s’assurer que les échantillons de phage chauffée sont bien mélangés.</li>
	<li>Refroidir les tubes à échantillon à la température ambiante (RT) en les laissant sur le banc de l’expérience ou le conserver à 4 ° C dans un réfrigérateur pendant la nuit. Remarque : L’expérience peut être suspendu à cette étape.</li>
</ol>4. préparer des réactions de qPCR
NOTE : Une réaction de PCR est pour un seul échantillon. Chaque réaction PCR contient 5 µL de qPCR master mix (voir documentation), 1 µL de 5 µM amorce paire mix, 2 µL de H2O et 2 µL de l’échantillon de phage T7 traité thermiquement. Pour plusieurs réactions de PCR, tous les réactifs à l’exception des échantillons de phages sont prémélangées dans un tube de 1,5 mL. Le volume de chaque réactif dans le prémélange dépend du nombre d’échantillons de phage pour qPCR.
<ol><li>Préparer le prémélange de qPCR 10 échantillons de phage biopanned de concentration inconnue et 7 échantillons de concentration standard en triple exemplaire. En conséquence, il y a 51 échantillons totaux et par conséquent, 51 réactions qPCR (c.-à-d., une réaction par exemple). 51 réactions, préparer un prémélange de 255 µL du mélange maître qPCR (51 x 5 µL), 51 µL d’amorces (51 x 1 µL) et 102 µL d’H2O (51 x 2 µL). Remarque : Il est recommandé de préparer quelques réactions de PCR supplémentaires pour compenser la perte de volume pendant l’aliquotage le mélange PCR dans chaque puits de la plaque de 96 puits qPCR.</li>
	<li>Aliquote 8 µL de prémélange PCR dans chaque puits de la plaque de 96 puits qPCR pour un total de 51 puits (c.-à-d., 51 réactions de qPCR). Il n’y a pas besoin de changer des conseils pendant l’aliquotage.</li>
	<li>Ajouter 2 µL d’échantillons de phage T7 traité thermiquement (étape 3.4) ou référence de phage T7 ADN (point 2.1) dans chaque puits (Figure 3 b) ; changer les conseils lors de l’ajout de différents échantillons d’ADN dans le puits pour prévenir la contamination croisée. En outre, dispenser les 2 échantillons d’ADN µL au-dessous de la surface du prémélange de qPCR (c.-à-d. dans le prémélange PCR 8 µL).</li>
	<li>Sceller la plaque de qPCR avec film adhésif. Remarque : Cette étape est critique, quel que soit le type de plaque de qPCR. Utiliser le kit recommandé pour sceller la plaque complètement ; Sinon, n’importe quelle région non scellées dans la plaque engendrera la perte de volume pendant l’ACP cyclisme.</li>
	<li>Enrouler la plaque qPCR avec du papier d’aluminium pour réduire au minimum le photoblanchiment de fluorescence et aller de l’avant de l’exécuter sur l’équipement de qPCR.</li>
</ol>5. qPCR Conditions de cyclisme
NOTE : qPCR conditions cyclisme ont été installées sur l’équipement spécifique qPCR (voir Table des matières).
<ol><li>Exécutez la plaque 96 puits qPCR sur l’équipement de qPCR. Sur le matériel, sélectionnez Paramètres dans le menu pour mettre en place les conditions expérimentales suivantes (Figure 3).</li>
	<li>Mettre en place de conditions comme suit pour un volume d’échantillon de 10 µL de cyclisme : un cycle à 50 ° C pendant 2 min, un cycle à 95 ° C pendant 2 min, suivie de 40 cycles de (95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 1 min). Après, exécutez les paramètres de courbe de fusion : un cycle de 95 ° C pour 15 s, 60 ° C pendant 1 min et 95 ° C 15 s.</li>
	<li>Procéder à l’analyse des données, tel que décrit à l’étape 6.</li>
</ol>6. analyser la qPCR données brutes et de convertir de qPCR Ct valeur à gc/µL de bactériophages T7
<ol><li>Analyser les données brutes qPCR et évaluer la qualité des données en analysant les parcelles caractéristiques des données brutes (Figure 4). NOTE : Amplification intrigue, intrigue multicomposant et tracé de courbe de fonte sont que la caractéristique clée complote pour valider la qualité des données de qPCR.</li>
	<li>
Calculer les valeurs seuil moyen de cycle (Ct) des échantillons en triple à chaque concentration de la courbe d’étalonnage (étape 2.1).
	<ol>
<li>Tracer la moyenne Ct (Y) contre le journal (gc/µL) (X) pour obtenir la courbe linéaire Y = kX + b (k est la pente de la courbe linéaire, b est l’ordonnée à l’origine).</li>
		<li>Calculer le coefficient linéaire14 R2 (R2 doit être &gt; 0.99).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser la courbe d’étalonnage Y = kX + b pour calculer le nombre de phages T7 dans les échantillons de protéines (c.-à-d., les phages sélectionnés contre CF type glaire) au gc/µL (Figure 5). NOTE : k est la pente de la courbe standard.</li>
	<li>Calculer l’efficacité de l’amplification par l’équation suivante <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq2.jpg">(2) NOTE : k est la pente de la courbe standard produite de référence ADN qPCR. La plage idéale de l’efficacité de l’amplification est de 90 à 110 %.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11848876">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li>
<li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+technologies%3A+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li>
<li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20020040">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li>
<li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li>
<li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li>
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<li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li>
<li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li>
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<li>T7Select Biopanning Kit. , Millipore Sigma. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP ">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP </a> (2018).</li>
<li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21116397">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li>
<li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemitry%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li>
<li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li>
<li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29180282">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li>
<li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro%2C+Oropouche%2C+and+oropouche-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li>
<li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons développé des méthodes de qPCR pour quantifier le phage d’ADN génomique5, et ici nous avons décrit et adapté une méthode de qPCR pour énumérer les phages T7 sélectionnés contre une barrière de type CF glaire. Minimum d’informations pour connaître les instructions Publication de Quantitative Real-time PCR expériences (MIQE) ont été adaptés afin de développer et de valider la méthode de qPCR pour dénombrement des phages de T715. Le protocole que nous avons mis au p...

Technologie d’affichage bactériophage (phage), mis au point par George Smith en 1985, est une approche puissante et à haut débit afin d’identifier des ligands peptidiques ou de protéines contre des cibles ou des récepteurs de la membrane cellulaire, les antigènes de la, les organites cellulaires ou spécifiques organes et tissus dans les dernières deux décennies1,2. Ici, les librairies aléatoires des polypeptides ou des anticorps de la seule chaîne sont affichées sur les protéines de manteau de phages (typiquement M13 ou T7) et des ligands spécifiques peuvent être identifiés de panoramique contre les protéines immobilisées in vitro ou in vivo systèmes biologiques à travers un processus itératif de sélection. Puis, les ligands peuvent être couplés avec des agents d’imagerie ou thérapeutiques pour le diagnostic et le traitement des maladies3,4. Il est essentiel d’énumérer avec précision les phages pendant plusieurs étapes de protéines : (1) pour quantifier les phages qui se lient au substrat et (2) pour quantifier les phages pour déterminer s’il y a enrichissement avec chaque tour de sélection (enrichissement du phage indique biopanned affinité du phage pour la cible). L’étalon-or actuel pour la quantification, essai de plaque double-couche, présente plusieurs défis ; C’est fastidieux, lourd et potentiellement inexacts pour un grand nombre d’échantillons. Par conséquent, notre groupe a développé une méthode de réaction en chaîne (qPCR) de polymérase quantitative sensible, reproductible, précises et économes en temps pour énumérer des particules de protéines5bactériophages M13 et T7.
qPCR est une méthode attrayante et faisable de quantifier avec précision les phages T7 et M13. Étant donné que chaque particule individuelle phage ne peut contenir qu’une seule copie de l’ADN génomique (dsDNA ou ADN simple brin), un génome phagique équivaut à une particule de phage ; en quantifiant le nombre de génomes de phage, il est possible de quantifier le nombre de phages. Au cours de qPCR, journaliste fluorescent colorants lient l’ADN génomique de phage non spécifique ou plus précisément par les amorces spécifiques de séquence au cours de l’amplification par PCR et la fluorescence signal augmente avec chaque tour d’amplification. Lorsque le signal de fluorescence atteint le seuil, ronde/cycle d’amplification est remarqué que le cycle seuil (Ct). Les concentrations connues du phage référence ADN sont tracées contre leurs valeurs de Ct pour tracer une courbe d’étalonnage. À l’aide de la courbe d’étalonnage avec les valeurs de Ct d’échantillons d’ADN, les concentrations de phages peuvent être interpolées.
Alors que de nombreuses stratégies ont été développées précédemment et largement utilisés pour quantifier les phages de criblage, chacun d’eux a des défis particuliers. Méthode la plus populaire et traditionnelle est double couche plaque de dosage. Ici, les hôtes de bactéries sont infectés par des phages préparés à des dilutions successives, sont cultivées sur un substrat solide agar et sont recouvertes d’agar ; les phages sont énumérés avec le nombre de plaques formées (i.e., unités formant des plaques ou pfu) sur la gélose. Essai de plaque est sensible mais fastidieux, chronophage et imprécise, surtout pour les nombreux échantillons et avec des concentrations élevées de5. En outre, les dosages immuno-enzymatiques (ELISA) ont été adaptés pour énumérer les M13 et T7 phage particules6,7,8. Ici, les phages à différentes dilutions sont liés et capturé sur un substrat solide (c.-à-d. une microplaque), hybridés avec des anticorps spécifiques phage et détectés en utilisant des reporters (p. ex., enzyme sensible substrats chromogènes, fluorophores) à déterminer le nombre de particules phagiques présents. Les afficheurs (p. ex., fluorescence, absorbance) des échantillons peuvent être utilisés pour quantifier les concentrations inconnues contre normes phage à des concentrations connues. Différents tests ELISA axée sur les phages ont été développées, mais ils ont limites potentielles. Un groupe a élaboré un sandwich ELISA, sur papier, avec une gamme de quantification qui a duré sept ordres de grandeur (2-10 109 UFP/mL) ; Cependant, cette méthode requise plusieurs étapes du revêtement de l’anticorps et a pris pour une journée entière pour le dosage de8. Notre groupe a également mis au point une méthode ELISA pour quantifier les particules phagiques M13 mais avait une portée de détection moins sensible de 106 à 1011 UFP/mL5. Lanthanide commutable fluorescence sondes ont été développés pour énumérer des M13 et données de quantification peuvent être obtenues dans les 20 min ; Toutefois, ce test a une étroite plage dynamique de 109 1012 UFP/mL9. Un groupe utilisé microscopie à force atomique pour énumérer les particules phagiques M13 en solution, mais cela requiert la microscopie électronique avancée et ne fonctionnait que dans une fourchette étroite de concentrations10. Une autre étude utilisé monodispersés émulsions pour piéger les phages de journaliste M13 et T4 fluorescents et compter les phages par le nombre de gouttelettes fluorescents ; Cependant, cette approche présentait également une gamme étroite de quantification de 102 106 UFP/mL11. Tout en gouttelettes que numérique PCR a été utilisée pour quantifier les phages M13, cette approche ne peut pas faire la différence entre le nombre de particules infectieuses et non-infectieuses phage12.
Notre groupe a récemment mis au point des méthodes de qPCR pour énumérer des phages T7 et M13 identifiés de criblage contre un modèle de barrière hémato - encéphalique cellulaire à l’aide de deux journaliste fluorescents différents colorants5. Par rapport aux méthodes de quantification susmentionnés, les méthodes de qPCR, nous avons développé étaient haut débit et temps-efficace pour quantifier les nombreux échantillons et capable de différencier les phages infectieux et non infectieux à la DNase I avant le traitement de la échantillons de phages. Ce qui est important, cette approche peut reproductible et précisément quantifier des bactériophages M13 et T7 dans des échantillons de protéines. Pour guider les chercheurs débutants dans le domaine du phage qPCR, nous décrivons ici une méthode détaillée de qPCR pour énumérer des particules de phage T7 auprès d’une bibliothèque sont limitées cystéine (CX7C) batées contre une barrière de mucus in vitro la fibrose kystique (FK). De ce travail, qPCR méthode peut être étendue pour quantifier les particules phagiques depuis d’autres types de protéines et d’autres sources, y compris l’eau, le sol et les fluides de corps.

<table><tbody><tr><td>Materials and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amorces pour l’ADN génomique T7</td><td>IDT</td><td></td><td>F : CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R : TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td></tr><tr><td>T7 Select packaging control DNA</td><td>EMD Millipore</td><td>69679-1UG</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp plaque réactionnelle optique à 96 puits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td><td>Applied biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp kit de film adhésif optique</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4313663</td><td></td></tr><tr><td>T7Select 415-1 Cloning Kit EMD</td><td>Millipore</td><td>70015</td><td>Protocoles utilisateur : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td></tr><tr><td>DNase I solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de transpuits à 24 puits</td><td>Corning</td><td>3472</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Système de PCR en temps réel avec bloc rapide à 96 puits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Pico 21 Microcentrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002415</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Mélangeur vortex numérique</td><td>Fisher Scientific Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>HERMO SCIENTIFIC Chauffage Multi-Blok</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Modèle :2001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall Legend X1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004220</td><td></td></tr><tr><td>M-20 Microplaque Rotor à godet oscillant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>><Entreprise><</td><td>strong>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Logiciel de PCR en temps réel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>v1.2</td></tr><tr><td>Conception d’amorces qPCR en temps réel</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pcr quantitative du bactériophage t7 de criblage

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Ce protocole décrit l’utilisation de la PCR quantitative (qPCR) pour énumérer les phages T7 d’expériences de sélection phage (c'est-à-dire, « biopanning »). qPCR est une approche axée sur la fluorescence pour quantifier l’ADN, et ici, il est adapté pour quantifier les génomes phagiques comme une approximation des particules phagiques. Dans le présent protocole, un procédé de préparation d’ADN de phage facile est décrite à l’aide de chauffage haute température sans purification d’ADN supplémentaire. La méthode n’a besoin que de petites quantités de phages traité thermiquement et de petits volumes de la réaction de qPCR. qPCR est haut débit et rapide, capable de traiter et d’obtenir des données d’une plaque à 96 puits de réactions en 2 à 4 h. par rapport aux autres approches d’énumération phage, qPCR soit le plus court possible. Ici, qPCR est utilisée pour énumérer les phages T7 identifiés de criblage contre modèle in vitro de mucus comme la fibrose kystique. La méthode de qPCR peut être étendue pour quantifier les phages T7 d’autres expériences, y compris d’autres types de protéines (p. ex.., dépistage de phage immobilisé la liaison aux protéines, in vivo ) et d’autres sources (par exemple, les systèmes de l’eau ou des liquides organiques). En résumé, ce protocole peut être modifié afin de quantifier des virus à ADN-encapsulé.

Outils de conception d’amorce différents permet de concevoir des amorces de qPCR. En général, amorces programmes ont leurs propres algorithmes intégrés pour calculer et valider les paramètres clés des amorces, par exemple, GC %, Tm, dimère d’amorce ou formation en épingle à cheveux, etc. en général, les principaux critères sont similaires dans les différents outils de conception d’amorce et amorces peuvent être conçus en suivant leurs instructions. Amorce BLAST peut être...

Reproductible, précise et temps efficace quantitative PCR (qPCR) décrit une méthode pour énumérer bactériophage T7 est ici. Le protocole décrit clairement la préparation d’ADN génomique de phage, préparation de réaction PCR, qPCR conditions cyclisme et analyse de données de qPCR.

PCR quantitative du bactériophage T7 de criblage

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Cette méthode pourrait aider à résoudre les problèmes clés dans les domaines de la virologie et de la microbiologie liés à l’énumération des bactériophages à partir d’échantillons complexes et de diagnostics et thérapeutiques à base de bactériophage. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification efficace et précise du temps d’un grand nombre d’échantillons provenant d’expériences de biopannage d’affichage de phages qui ne sont pas réalisables avec les essais traditionnels. Rashmi Mohanty et Jasmim Leal, étudiants diplômés de mon laboratoire, démontreront la procédure.Après avoir conçu les amorces et créé une concentration de stock, obtenir l’ADN de phage T7 de référence à une concentration de 0,1 microgramme par microlitre. En utilisant de l’eau ultrapure, diluer en série cet ADN décuplé, d’un million de femtogrammes par microlitre à un femtogramme par microlitre dans des tubes PCR de 0,2 millilitre. Préparer 20 microlitres de chaque concentration, en s’assurant de changer les pointes de pipette et vortex les tubes entre chaque étape de la dilution.Ensuite, convertir la concentration d’ADN de référence t7 phage des femtogrammes par microlitre en copies du génome par microlitre. Tout d’abord, pipette 200 microlitres du clone de phage T7 échantillon dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre pour chacun des 10 échantillons désirés. Ajouter deux microlitres de DNase un à chaque tube.Capez les tubes et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bain sec chauffé. Puis incuber à 100 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un bain sec chauffé. Centrifugeuse les tubes contenant les phages traités à la chaleur à 18, 534 fois g pendant 10 secondes.Placez les tubes centrifugés sur un mélangeur vortex réglé en mode activation tactile pendant 10 secondes pour mélanger les phages. Tournez à nouveau à 18, 534 fois g pendant 10 secondes. Après cela, laissez les échantillons sur le banc de laboratoire environ une heure pour les refroidir à température ambiante.Préparer le prémémix qPCR pour 10 échantillons de phages biopannés de concentration inconnue et sept échantillons de concentrations standard en triplicate. Résultant en un prémétrage pour 51 échantillons contenant 255 microlitres de mélange principal qPCR, 51 microlitres d’amorces et 102 microlitres d’eau. Aliquot huit microlitres du mélange PCR préparé en 51 puits d’une plaque qPCR de 96 puits.Ajoutez ensuite deux microlitres d’échantillons de phages T7 traités à la chaleur à chacun de ces puits, en les distribuant sous la surface du prémémix qPCR. À l’aide d’un film adhésif, sceller la plaque. Envelopper la plaque dans du papier d’aluminium pour minimiser le blanchiment des photos de fluorescence, puis procéder à l’utilisation de la plaque sur l’équipement qPCR.Configurer les conditions de cycle et les paramètres de la courbe de fusion tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. Une fois le qPCR exécuté, la parcelle d’amplification, la parcelle de courbe de fusion et la parcelle multicomposante sont analysées à partir des données brutes. La parcelle d’amplification indique si l’amplification PCR de chaque échantillon est réussie ou non.La parcelle multicomposante représente l’amplification et la décomposition du signal fluorescent tout au long des cycles d’amplification. Alors que la parcelle de courbe de fusion est utilisée pour valider la spécificité des amorces, puisque chaque produit PCR a une température de fusion unique. La courbe standard est ensuite générée à partir de l’ADN de référence.Ici, l’efficacité de l’amplification est calculée à 92,4% Les données représentatives d’une étude qPCR sont ensuite comparées au même phage qui ont été quantifiés par un essai de plaque à double couche à la gamme testée de 10 à 10 millions d’exemplaires du génome par microlitre. Comme on le voit ici, le nombre de phages dans la quantitation qPCR est plus élevé que dans l’analyse de plaque. La répétabilité de la méthode qPCR telle que représentée par le coefficient de variance est considérée comme avoir des valeurs allant de 2,85 à 27,2%Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler qu’il existe de nombreuses considérations dans le développement et l’utilisation de qPCR pour quantifier avec précision les phages, y compris le traitement soigneux et la préparation des échantillons et l’étalonnage de l’équipement pertinent.Suivant cette méthode, d’autres techniques peuvent être réalisées afin d’énumérer les particules de phage dans une variété d’applications incluses dans le biopannage vivo, la préparation de l’ADN de la bibliothèque de phages et la détection de séquençage et de phage de prochaine génération dans des échantillons environnementaux complexes. N’oubliez pas que les phages sont considérés comme des dangers biologiques en laboratoire et que les précautions telles que l’équipement de protection individuelle, y compris les gants et les blouses de laboratoire, doivent toujours être portées pendant l’exécution de la procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous discutons de la réaction en chaîne quantitative par polymérase, qPCR, pour dénombrer les bactériophages T7 par quantification de l’ADN. Le colorant fluorescent dans le mélange PCR se lie aux brins d’ADN nouvellement synthétisés et émet une fluorescence, qui est mesurée.

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Cette vidéo présente une méthode permettant d’étudier les interactions protéine-médicament à l’aide du biopanoramique basé sur le biocapteur QCM de la banque de peptides T7 affichée par phage. Le biopannage des phages affichant un peptide spécifique sur le biocapteur QCM permet l’isolement spécifique des peptides de haute affinité, suivi d’un séquençage d’acides aminés, ce qui permet d’identifier des sites d’interaction spécifiques sur la protéine cible.

Biopanning basé sur un biocapteur de microbalance à cristaux de quartz pour étudier les interactions protéine-médicament

La présentation de phage est une technique puissante pour capturer des protéines ou des fragments protéiques qui interagissent avec une molécule d'intérêt immobilisé. Une fois la décision du type de banque d'ADNc de phage pour créer et écran a été fait, le protocole décrit ici permet la sélection d'affinité efficace menant à l'identification des interacteurs.

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Nous décrivons des tests discontinus sensibles à base de gel pour examiner la cinétique de l’initiation des brins retardés à l’aide des protéines de réplication du bactériophage T7.

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Une nouvelle génération de plates-formes de transcription-traduction acellulaire a été conçue pour construire des systèmes biochimiques in vitro par le biais de l’exécution des circuits de gène. Dans cet article, nous décrivons comment bactériophages MS2, ΦΧ174 et T7, sont synthétisés à partir de leur génome en utilisant un système tous les e. coli acellulaire TXTL.

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Cette étude visait à présenter une stratégie pour identifier les interactions médicament-peptide. La stratégie consiste à biopanner les peptides courts reconnaissant les médicaments à partir d'un biocapteur de microbalance quartz-cristal (QCM), suivi d'une analyse bioinformatique pour évaluer quantitativement les informations obtenues pour la reconnaissance et l'annotation des sites de liaison médicamenteux sur les protéines.

Stratégie d&apos;analyse biopanning et bioinformatique à haut débit basée sur biocapteur pour la validation globale des interactions médicament-protéines

Ce protocole permet de révéler l’impact des prophages sur leurs hôtes. Les cultures bactériennes sont synchronisées en utilisant les conditions qui soutiennent le mieux l’état lysogénique, limitant ainsi l’induction spontanée. La RT-qPCR distingue sans équivoque les gènes restreints aux prophages et ceux qui ne sont pas couplés au contrôle des phages de ceux qui sont exprimés pendant le cycle de réplication lytique.

Comprendre l’impact des bactériophages tempérés sur leurs lysogènes grâce à la transcriptomique

Les bactériophages (phages), des virus qui infectent les bactéries, font partie intégrante du microbiome intestinal. Bien que ces habitants symbiotiques déterminent la forme physique bactérienne et la dynamique des populations, on comprend peu de choses sur leur impact sur l’homéostasie intestinale et les maladies. Ce protocole étudie des phages T4 isolés dans un modèle murin, adaptable à d’autres paires phage-bactérie.

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

La quantification précise des copies du génome du vecteur du virus adéno-associé (AAV) est essentielle, mais un protocole standardisé n’a pas encore été établi. Ce protocole décrit une méthode validée pour la préparation d’échantillons d’AAV purifiés et la réalisation d’une réaction en chaîne par polymérase (dd_PCR) numérique en gouttelettes afin de quantifier de manière fiable le titre du génome viral.

Quantification de génomes viraux adéno-associés dans des échantillons de vecteurs purifiés par réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes

Nous décrivons ici des méthodes d’échantillonnage dans les zones euphotiques des écosystèmes marins et d’eau douce pour isoler les cyanophages (et leurs hôtes) et des processus de post-échantillonnage qui enrichissent les génotypes uniques et caractérisent la dynamique d’interaction virus-hôte.

Échantillonnage environnemental des microbes photosynthétiques et de leurs virus : du champ au laboratoire

Apprenez une méthode de qPCR quantitative pour énumérer le bactériophage T7 avec précision. Cette technique permet une quantification rapide de nombreux échantillons complexes en virologie et microbiologie.

PCR quantitative du bactériophage T7 de criblage

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