Quantification de l’activité In Vitro de l’Hypopigmentation

Nous décrivons trois méthodes expérimentales pour l’évaluation de l’activité de l’hypopigmentation des produits chimiques in vitro : quantification du contenu de l’activité et la mélanine 2) tyrosinase 1) cellulaire et 3) mesure de mélanine de mélanine cellulaire coloration et analyse d’images.

Cette méthode peut être utile dans le développement des cosmétiques fonctionnels et de l’agent de peau avec des activités anti-melanogenic. Il est là pour effectuer et le résultat peut être obtenu rapidement. En outre, cette méthode peut être utile pour les chercheurs, qui veulent identifier ou étudier les effets ou les composés ou étudier les activités antimelanogéniques ou promelanogenic.

Pour mesurer à tyrosinase activité commencer par l’ensemencement B16-F10 Mélanicides à cinq fois 10 à la quatrième cellule par puits d’une concentration de 24 plaques de puits dans le milieu complet pendant 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, remplacez le supernatant dans chaque puits par du DMEM complété par un composé d’essai fraîchement préparé et un contrôle inhibiteur ou un contrôle négatif et retournez la plaque à l’incubateur pendant encore 72 heures. À la fin du traitement rincer les puits deux fois avec 300 microlitres de pbs froids par puits et placer la plaque sur la glace.

Ajouter ensuite 300 microlitres de tampon de lyse à chaque puits à l’aide d’un grattoir cellulaire pour recueillir les lysates cellulaires après cinq minutes. Transférez les suspensions de particules cellulaires qui en résultent dans des tubes individuels de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre. Et homogénéiser les lysates trois fois pendant deux secondes à 14 500 r/h sur la glace pour libérer la Tyrosinase intercellulaire.

Pelleter les débris cellulaires par centrifugation et transférer les supernatants à des tubes de centrifugeuse individuels de 1,5 millilitre sur la glace. Allouer 70 microlitres de chaque supernatant à des puits individuels d’une micro plaque de polystyrène clair de 96 puits et ajouter 140 microlitres de solution de substrat tyrosinase à chaque puits de supernatant. Secouer la plaque doucement pour mélanger le contenu du puits.

Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Et mesurez l’activité tyrosinase à 475 nanomètres sur un lecteur de microplaque. Mesurer la teneur en mélanine des cellules après avoir recueilli le lysate des cellules traitées comme démontré.

Recueillir les lysates par centrifugation et transférer les supernatants dans de nouveaux tubes. Ajouter 300 microlitres d’un hydroxyde de sodium normal à chaque granulé pendant une incubation d’une heure à 60 degrés Celsius. Suivi d’une centrifugation des suspensions cellulaires dissoutes.

Ensuite, transférez 200 microlitres des supernatants à chaque puits d’une plaque de puits de 96. Et mesurez le contenu de mélanine sur un lecteur de microplaque à une longueur d’onde de 400 nanomètres. Pour la coloration Fontana-Masson, laver les cellules traitées deux fois avec 300 microlitres de pbs froids et fixer les cellules avec 200 microlitres de 10% de formaline pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Rincez les cellules épaisses avec de l’eau distillée et ajoutez 200 microlitres de 58 à 68 degrés Celsius solution de travail d’argent ammoniaque à chaque puits. Pendant une heure d’incubation à 37 degrés Celsius ou jusqu’à ce que les cellules deviennent de couleur jaune-brun. Rincer les cellules tachées à l’eau distillée suivie d’une incubation de deux minutes dans du chlorure d’or à 0,1 % à température ambiante.

Rincer les cellules traitées au chlorure d’or avec de l’eau distillée et ajouter 200 microlitres de solution de thiosulfate de sodium aux cellules. Après deux minutes, rincer à nouveau les cellules. Et étiquetez les cellules avec 200 microlitres de rouge rapide nucléaire par puits pendant cinq minutes.

Lavez ensuite les cellules tachées avec de l’eau du robinet avant de l’imagerie au microscope léger. Pour l’analyse des seuils, ouvrez les images dans l’image J et sélectionnez l’image, ajustez et seuil de couleur. Pour mesurer la zone tachée de Fontana Masson, réglez la barre de paramètres de luminosité à zéro et ajustez la luminosité au point où tous les cellules tachées noires ou brunes sont incluses.

Sélectionnez Analyser et analyser les particules et cochez la case résumée dans la fenêtre Analyser les particules, puis cliquez bien pour obtenir un résumé des résultats et copier et coller les données dans une feuille de calcul. Le traitement d’Arbutin supprime de manière significative l’activité cellulaire de Tyrosinase comparée aux cellules traitées de véhicule de contrôle. De même, la teneur en mélanine des cellules stimulées par l’arbutine est considérablement réduite par rapport aux témoins.

Bien que les cellules soient morphologiquement similaires entre les groupes de traitement, arbutin diminue la zone de pigment noir par rapport aux cellules traitées de contrôle. Cette méthode est utile pour le dépistage des activités à l’aide de notre bibliothèque composée. Il y a plus de centaines d’échantillons à tester rapidement.

En outre, cette méthode peut également être utilisée pour étudier le mécanisme impliquant la mélanogenèse. Après que les composés candidats bioactifs ont été identifiés, pour leur témoignage à l’étude des mécanismes biologiques ou des applications commerciales.