Name: Saccharomyces cerevisiae Cinétique de croissance exponentielle en Culture pour analyser le métabolisme respiratoire et fermentatif (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Apprenez à estimer le métabolisme respiratoire et fermentatif de Saccharomyces cerevisiae par ajustement de la croissance exponentielle. Cette méthode permet le criblage à haut débit des effets de substances sur le métabolisme.

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Ce projet a bénéficié de subventions du Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (numéro de licence 293940) et Fundación TELMEX-TELCEL (numéro de licence 162005585), tous deux à IKOM.

1. milieux de Culture et de la préparation de l’Inoculum
<ol><li>Préparation de 100 mL de milieu liquide extrait-peptone-dextrose (DPJ) levure de 2 % (ajouter 1 g de levure extrait, 2 g de peptone de caséine, et 2 g de glucose pour 100 mL d’eau distillée). Diluer 3 mL des médias dans des tubes coniques stérilisable 15 mL. Autoclave les médias pendant 15 min à 121 ° C et 1,5 lb/po2. Remarque : Les médias peuvent être stockés pendant jusqu'à un mois, 4 – 8 ° c.</li>
	<li>Ensemencer un tube conique rempli de 3 mL de bouillon de la DPJ 2 % stérile cool avec 250 μl de cellules de S. cerevisiae conservés en glycérol à-20 ° C. Incuber pendant la nuit dans un agitateur orbital à 30 ° C sous agitation à 200 tr/min.</li>
	<li>Ensemencer une boîte de Pétri (60 x 15 mm2) rempli d’agar de la DPJ stérile 2 % (ajouter 10 g de levure extrait, 20 g de peptone de caséine, 20 g de glucose, et 20 g d’agar bactériologique à 1 000 mL d’eau distillée) avec les cellules cultivées dans le tube à fond conique à l’aide d’une anse stérile. Incuber le de Petri à 30 ° C jusqu'à ce que les colonies isolées montrent une croissance.</li>
	<li>Préparation de l’inoculum avant en inoculant une seule colonie isolée dans un tube conique contenant 10 mL de cool bouillon stérile de la DPJ 2 % et du jour au lendemain il incuber à 30 ° C sous agitation continue à 200 tr/min.</li>
</ol>2. les milieux de Culture et les courbes de croissance en microplaques
<ol><li>Préparer 10 mL de bouillon de la DPJ de 1 % (ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,1 g de glucose à 10 mL d’eau distillée), 10 mL de bouillon de la DPJ de 2 % (ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,2 g de glucose à 10 mL d’eau distillée) et 10 mL de bouillon de la DPJ de 10 % (ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 1 g de glucose à 10 mL d’eau distillée). Autoclave ces milieux de croissance pendant 15 min à 121 ° C et 1,5 lb/po2. Remarque : Les milieux de culture sert à un contrôle de croissance fermentaire.</li>
	<li>Préparer 10 mL de bouillon de 2 % levure extrait-peptone-éthanol (YPE) et 10 mL de bouillon de 2 % levure extrait-peptone-glycérol (GPJ). 2 % YPE : ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,2 mL d’éthanol à 10 mL d’eau distillée. 2 % GPJ : ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,2 mL de glycérol à 10 mL d’eau distillée. Autoclave ces milieux de croissance pendant 15 min à 121 ° C et 1,5 lb/po2. NOTE : Glycérol et l’éthanol sont des sources de carbone non fermentescibles qui sont exclusivement métabolisés par la respiration mitochondriale. Pour cette raison, ils sont utilisés comme un contrôle de croissance respiratoire. Dans cette étape, le type et la concentration de la source de carbone dans les milieux de culture peuvent être réglées pour tester les effets sur le phénotype de la croissance en utilisant le levure extrait-peptone (YP) bouillon (10 g d’extrait de levure et 20 g de peptone de caséine dans 1 000 mL d’eau distillée) comme base. Pour tester les effets d’autres éléments nutritifs en plus de carbone, un milieu synthétique (SC) complet est complété selon le but de l’expérience. La base de la moyenne de SC est 1,8 g d’azote de levure base sans acides aminés, 5 g de sulfate d’ammonium [(NH4)2SO4], 1,4 g de phosphate monosodique (NaH2PO4), et 2 g d’abandon mélanger dans 1 000 mL d’eau distillée. Compléter les médias avec une source de carbone et la source d’azote supplémentaire dans les concentrations nécessaires.</li>
	<li>Ajouter 145 μL de milieux de culture approprié pour le protocole expérimental dans chaque puits d’une microplaque stérile (10 x 10 puits) avec un couvercle et les ensemencer avec 5 μL de l’inoculum avant. Remarque : Si le but est d’éliminer l’influence de substances/composés sur le métabolisme énergétique de la levure, cet substance/composé devrait être ajouté au cours de cette étape. En outre, n’importe quel type de microplaque avec un couvercle devrait être utile.</li>
	<li>Incuber les plaques multipuits dans un lecteur de microplaques à 30 ° C sous agitation constante à 200 tr/min pendant 48 h. mesurer la densité optique (do) à 600 nm toutes les 30 ou 60 min. Remarque : Si le lecteur de microplaque ne possède pas l’option pour incuber la microplaque, il peut être incubé dans un agitateur orbital dans les mêmes conditions entre chaque mesure de la Division d’opposition.</li>
</ol>3. croissance courbes dans des fioles coniques secoués
<ol><li>Ajouter 4,8 mL du milieu de culture approprié à l’autoclave et fioles coniques de 20 mL. Inoculer chaque fiole avec 200 μl de la culture pré inoculum à OD600nm ~ 2 dans le bouillon de la DPJ 2 % frais et stérile. Les incuber à 30 ° C sous agitation constante à 250 tr/min pendant 24 h. Remarque : Si la période d’incubation est supérieure à 24 h, ajouter 12 mL du milieu de culture approprié à l’autoclave et fioles coniques de 50 mL. Les ensemencer avec 500 μL d’inoculum avant. Il est également important d’examiner les contrôles croissance fermentaire (médias YP avec 1 %, 2 %, soit 10 % de glucose) et les contrôles de croissance respiratoire (médias YP avec 2 % de glycérol ou éthanol).</li>
	<li>Prendre 100 μL de la culture de la fiole conique secoué et diluez-la dans 900 μL d’eau distillée dans une cuvette de spectrophotomètre de 1 mL et mélanger doucement en pipettant également. Mesurer le diamètre extérieur à 600 nm à l’aide d’un spectrophotomètre toutes les 2 h. Pour obtenir la vraie OD, multipliez le résultat par dix.</li>
</ol>4. traitement des données et calcul des paramètres cinétiques
<ol><li>
Créez un nouveau fichier de projet dans le logiciel progiciel de statistiques. Dans la section « nouveau tableauet graphique », choisissez l’option « XY » .
	<ol>
<li>Sélectionnez l’option : « Commencer par un tableau de données vide » dans la section « Exemples de données » .</li>
		<li>Sélectionnez le type de graphique « Points et la ligne de connexion » . Quitter la section « X » non sélectionnée dans le segment des « Subcolumns pour des répétitions ou des valeurs erronées », et dans « Y » section Choisissez l’option : « Entrer des valeurs répétées (10) en côte à côte subcolumns et tracer la moyenne et l’erreur SD ». Cliquez sur le bouton créer. Remarque : Le format de table comporte une colonne X et plusieurs colonnes de Y, chacune avec les 10 subcolumns choisis précédemment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Écrire l’heure à laquelle OD les mesures ont été prises dans la colonne de X (par exemple, 0, 30, 60, 90 min ou 0, 1, 1,5, 2 h). Dans les colonnes de Y, écrire les valeurs de OD obtenus à partir des cultures.</li>
	<li>Identifier la phase exponentielle de croissance transformant les données de colonne Y en logarithmes. Cliquez sur le bouton « Analyser » , choisissez l’analyse « Transformer » , sélectionnez les valeurs de Y à l’aide de Y = système. Allez à la « Galerie des résultats », sélectionnez « Transform » table de données, cliquez sur le bouton « Analyser » et choisissez l’analyse de « Régression linéaire » . Exclure les valeurs do qui ne suivent pas un comportement linéaire. Pour exclure des valeurs, sélectionnez-les dans le tableau de données, puis tapez « Ctrl + E ». Remarque : Il est important d’exclure les valeurs qui ne suivent pas la phase exponentielle, puisque l’équation exponentielle correspond bien à la phase exponentielle.</li>
	<li>Dans la « Galerie de tableaux de données », sélectionnez la table de données « donnée 1 ». Cliquez sur le bouton « Analyser » et choisissez l' analyse de « Régression non-linéaire (ajustement de courbe) » parmi les « analyses XY ».</li>
	<li>Sélectionnez les jeux de données à analyser, puis cliquez sur le bouton « OK » . Dans l’onglet « Ajuster » choisir la section « Équation exponentielle » et sélectionnez l' « équation de croissance exponentielle » (où X est la concentration cellulaire, X0 est la concentration cellulaire au temps zéro, μ est le taux de croissance spécifique, et t est le temps). Utilisez la « méthode des moindres carrés digne » comme une méthode de lissage et laisser désélectionnées la section interpoler. Cliquez sur le bouton « OK » . Remarque : L’onglet avec les résultats de forme non linéaires est dans la « Galerie des résultats ». Le logiciel calcule doublement temps (Dt) et spécifiques au taux de croissance (μ). Le logiciel montre μ comme K dans l’onglet résultats.</li>
	<li>Ouvrez un nouveau fichier de projet et dans la section « nouveau tableau et graphique » , sélectionnez le choix de la colonne. Choisissez l’option « Démarrer avec une table de données vide » et sélectionnez le graphe désiré. Choisissez tracer la moyenne avec la SD, sélectionnez le bouton « Créer » .</li>
	<li>Copier les valeurs de Dt ou de μ dans l’onglet résultats fit non linéaire qui est dans la « Galerie des résultats » et les coller dans une colonne. Enfin, cliquez sur le bouton « Analyser » et choisissez l’analyse désirée dans la section « Analyses de colonne » pour comparer les paramètres cinétiques des différentes conditions éducationnels. Remarque : Les paramètres cinétiques obtient des contrôles croissance fermentaire (médias YP avec 1 %, 2 %, soit 10 % de glucose) et contrôles de croissance respiratoire (médias YP avec 2 % de glycérol ou éthanol) permet d’établir le seuil de la respiration par fermentation et mitochondriale, respectivement. En comparant la cinétique les paramètres de l’état nutritionnel et de la substance/composés testés avec la croissance de l’appareil respiratoire et fermentative aident à identifier l’effet possible sur le métabolisme respiratoire ou par fermentation.</li>
</ol>

<ol><li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li>
<li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li>
<li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect%3F+A+review+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li>
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<li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17(2014).</li>
<li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li>
<li>Monod, J. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.mi.03.100149.002103">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li>
<li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022247X07002260">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li>
<li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800(2014).</li>
<li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li>
<li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li>
<li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+curves%3A+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Beaucoup de temps s’est écoulé depuis J. Monod10 exprimé que l’étude de la croissance des cultures bactériennes est la méthode de base de la microbiologie. L’avènement des outils moléculaires retarde l’utilisation et l’étude de la croissance en tant que technique. Malgré la complexité de la croissance, ce qui implique de nombreux processus interdépendants, ses mécanismes sous-jacents peuvent être décrit en utilisant des modèles mathématiques11. Il s’agit d’une approche soli...

Croissance de Saccharomyces cerevisiae a été un outil précieux pour identifier des dizaines de mécanismes physiologiques et moléculaires. La croissance est mesurée principalement par trois méthodes : dilutions en série pour spot test, unité formant colonie comptant et courbes de croissance. Ces techniques peuvent servir seul ou en combinaison avec une variété de substrats, les conditions environnementales, des mutants et produits chimiques pour l’étude des réponses spécifiques ou phénotypes.
La respiration mitochondriale est un processus biologique dans lequel cinétique de croissance a été appliquée avec succès pour découvrir les mécanismes inconnus. Dans ce cas, lorsqu’il s’agit de milieux de culture avec carbone non fermentescibles sources tels que le glycérol, lactate ou éthanol (qui sont exclusivement métabolisé par la respiration mitochondriale), car la seule source de carbone et d’énergie permet d’évaluer la croissance respiratoire, ce qui est importante de détecter les perturbations dans la phosphorylation oxydative activité1. En revanche, c’est compliqué à utiliser des modèles cinétiques de croissance comme méthode pour décrypter les mécanismes derrière la fermentation.
L’étude de la fermentation et de la respiration mitochondriale est essentiel afin d’élucider les mécanismes moléculaires derrière certains phénotypes comme le Crabtree et Warburg effets2,3. L’effet Crabtree est caractérisée par une augmentation du flux glycolytique, répression de la respiration mitochondriale et mise en place de la fermentation comme la voie principale pour générer de l’ATP en présence de fortes concentrations de glucides fermentescibles (> 0,8 mM)4,5. L’effet Warburg est métaboliquement analogue à l’effet Crabtree, la différence étant que dans les cellules de mammifères, le principal produit de fermentation est lactate6. En effet, l’effet Warburg est illustré par une variété de cellules cancéreuses, déclenchant l’absorption du glucose et la consommation, même en présence d’oxygène7. Ainsi, étudier la base moléculaire du passage de la respiration à la fermentation dans l’effet Crabtree possède des répercussions biotechnologiques (pour la production d’éthanol) et impacts potentiels en recherche sur le cancer.
La croissance de S. cerevisiae peut être un outil approprié pour étudier les effets de Crabtree et Warburg. Cette idée est fondée sur le fait que dans la phase exponentielle de la levure, les voies centrales utilisées pour produire de l’ATP sont la respiration mitochondriale et la fermentation, qui sont essentielles pour soutenir la croissance. Par exemple, la croissance de S. cerevisiae est intimement liée à la fonction des voies génératrices de ATP. Dans les molécules de S. cerevisiae, la respiration mitochondriale produit environ 18 ATP par molécule de glucose, alors que la fermentation ne génère que 2 molécules d’ATP, donc il est prévu que le taux de croissance a des liens serrés avec les voies métaboliques production d’ATP,8. À cet égard, lorsque la fermentation est la principale voie pour générer de l’ATP, la levure compense la faible production d’ATP en augmentant le taux d’absorption du glucose. Au contraire, la consommation de glucose par les cellules de levure qui utilisent la respiration mitochondriale comme la principale source d’ATP est faible. Cela indique qu’il est important pour la levure pour la disponibilité de glucides sens avant de déterminer comment ATP sera généré. Par conséquent, la disponibilité de glucose joue un rôle important dans le commutateur entre la fermentation et de la respiration mitochondriale dans S. cerevisiae. En présence de quantités élevées de glucose, la levure préfère fermentation comme la voie centrale pour générer de l’ATP. Fait intéressant, lorsque la levure est en train de fermenter, le taux de croissance spécifique est maintenu à son maximum. En revanche, en vertu de faibles niveaux de glucose, S. cerevisiae produit ATP à l’aide de la respiration mitochondriale, maintenir des taux de croissance inférieurs. Ainsi, la variation de la concentration de glucose et de l’utilisation d’autres sources de carbone induire des changements dans la préférence de la levure entre croissance fermentaire et respiratoire. En tenant compte de ce fait avec l’équation exponentielle, on peut obtenir la signification biologique des paramètres cinétiques telles que le doublement des temps (Dt) et le taux de croissance spécifique (µ). Par exemple, des valeurs plus faibles de µ trouvées lorsque la levure utilise la respiration mitochondriale comme la voie principale. Au contraire, dans des conditions qui favorisent la fermentation, des valeurs de µ plus élevées trouvées. Cette méthode peut être utilisée pour mesurer les mécanismes probables de tout produit chimique influant sur la fermentation et la respiration mitochondriale dans S. cerevisiae.
L’objectif de cet article est de proposer une méthode basée sur la cinétique de croissance pour contrôler les effets d’un substance donné/composé sur la respiration mitochondriale ou fermentation.

<table><tbody><tr><td>Agitateur orbital</td><td>Thermo Scientific</td><td>4353</td><td>Pour l’incubation d’inoculum ou les cultures en fût coniques</td></tr><tr><td>Bioscreen&nbsp ;</td><td>Courbes de croissance</td><td>C MBR</td><td>Pour les cultures discontinues en microplaques</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>G7021</td><td>Pour la préparation du bouillon YPD</td></tr><tr><td>Peptone à partir de caséine, digest enzymatique</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>82303</td><td>Pour la préparation du bouillon YPD</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>09182-1KG-F</td><td>Pour la préparation du bouillon YPD</td></tr><tr><td>Gélose bactériologique</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A5306</td><td>Pour la préparation de gélose YPD</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>S8282</td><td>Pour la préparation de bouillon SC</td></tr> <tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A4418</td><td>Pour la préparation de bouillons SC</td></tr><tr><td>Base d’azote de levure sans acides aminés et sulfate d’ammonium</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>Y1251</td><td>Pour la préparation du bouillon SC</td></tr><tr><td>Levure synthétique drop-Out medium suppléments</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>Y1501</td><td>Pour la préparation de bouillon SC</td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium granulaire</td><td>J.T. Baker</td><td>0792-R</td><td>Pour une supplémentation moyenne, exemple</td></tr><tr><td>Resvératrol</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>R5010</td><td>Pour une supplémentation moyenne, exemple</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>G8270</td><td>Pour une supplémentation moyenne, exemple</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>S7903</td><td>Pour une supplémentation moyenne Exemple</td></tr><tr><td>Absolut éthanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td>Pour une supplémentation moyenne Exemple</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>J.T. Baker</td><td>2136-01</td><td>Pour une supplémentation moyenne</td></tr><tr><td>Exemple GraphPad Prism</td><td>GraphPad Logiciel</td><td></td><td>Pour l’analyse de données</td></tr><tr><td>Microplaques en nid d’abeille</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502550</td><td>Pour les cultures de microplaques</td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae cinétique de croissance exponentielle en culture pour analyser le métabolisme respiratoire et fermentatif

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Cellules de Saccharomyces cerevisiae en phase exponentielle soutiennent leur croissance par la production d’ATP par fermentation ou la respiration mitochondriale. La concentration de carbone fermentescibles principalement régit la façon dont les cellules de levure génèrent de l’ATP ; ainsi, la variation des niveaux de glucides fermentescibles lecteurs le métabolisme énergétique de S. cerevisiae. Cet article décrit une méthode de haut débit basée sur la croissance exponentielle de levure pour estimer les effets des changements de concentration et la nature de la source de carbone sur le métabolisme respiratoire et fermentatif. La croissance de S. cerevisiae est mesurée dans une microplaque ou secouée conique fiole par la détermination de la densité optique (do) à 600 nm. Ensuite, une courbe de croissance est construite par traçage OD par rapport au temps, qui permet l’identification et la sélection de la phase exponentielle et est équipé de l’équation exponentielle pour obtenir des paramètres cinétiques. Les taux de croissance spécifique faible avec des temps de doublement supérieurs représentent généralement une croissance respiratoire. À l’inverse, des taux plus élevés de croissance spécifique avec des temps de doublement inférieurs indiquent une croissance fermentaire. Seuils de doubler le temps et le taux de croissance spécifique sont estimées à l’aide de conditions respiratoires ou fermentatives bien connues, telles que les sources de carbone non fermentescibles ou des concentrations plus élevées de sucres fermentescibles. Ceci est obtenu pour chaque souche spécifique. Enfin, les paramètres cinétiques calculées sont comparées avec les valeurs de seuil pour établir si la levure montre la croissance fermentaire et/ou respiratoire. L’avantage de cette méthode est sa relative simplicité pour comprendre les effets d’un substance/composé sur le métabolisme fermentaire ou respiratoire. Il est important de souligner que la croissance est un processus biologique complexe et complex ; par conséquent, les données préliminaires de cette méthode doivent être corroborées par la quantification de la consommation d’oxygène et l’accumulation des sous-produits de la fermentation. Ainsi, cette technique peut servir comme un examen préliminaire des composés/substances susceptibles de déranger ou améliorer le métabolisme fermentaire ou respiratoire.

Courbes de croissance peuvent être utilisés pour distinguer provisoirement respiratoires et fermentatives phénotypes dans la levure S. cerevisiae . Donc, nous avons effectué des cultures en batch de S. cerevisiae (BY4742) avec des concentrations de glucose différentes qui ont été signalées pour induire la croissance par fermentation : 1 %, 2 % et 10 % (p/v)9. Les cultures présentant un phénotype fermentatif ont une phase de latence faible et une p...

Nous présentons ici un protocole afin d’évaluer le métabolisme respiratoire et fermentatif en ajustant la croissance exponentielle des Saccharomyces cerevisiae à l’équation de croissance exponentielle. Calcul des paramètres cinétiques permet le dépistage des influences de substances/composés sur la fermentation ou la respiration mitochondriale.

Saccharomyces cerevisiae Cinétique de croissance exponentielle en Culture pour analyser le métabolisme respiratoire et fermentatif

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines biotechnologiques et biomédicaux tels que la base moléculaire derrière les effets de Warburg et de Crabtree. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude à haut débit des effets de certaines substances dans le métabolisme respiratoire et fermentatif. Commencez par inoculer un tube conique de 15 millilitres contenant trois millilitres de cellules de levure froides et stériles d’extrait de levure peptone dextrose, ou bouillon YPD, avec 250 microlitres de cellules de levure S.cerevisiae conservés en glycérol à 20 degrés Celsius négatifs.Incuber la levure pendant la nuit dans un shaker orbital à 30 degrés Celsius et 200 rpm. pour strier sur un plat petri rempli d’agar de 60 millilitres et de 2 %, le lendemain matin. Culture du plat à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies isolées soient observées.Puis inoculer une seule colonie isolée dans un nouveau tube conique contenant 10 millilitres de bouillon frais et stérile de 2%YPD pour la culture nocturne à 30 degrés Celsius avec secousses. Pour la configuration de la courbe de croissance des microplaques, ajouter 145 microlitres d’un milieu culturel expérimental approprié à chaque puits d’une microplaque stérile de puits 10 par 10 avec couvercle et inoculer chaque puits avec cinq microlitres de la culture nocturne. Puis incuber la plaque multi-puits dans un lecteur de microplaque à 30 degrés Celsius avec agitation constante à 200 rpm pendant 48 heures, mesurant la densité optique à 600 nanomètres toutes les 30 ou 60 minutes.Pour la configuration conique secouée de croissance-courbe de flacon, inoculer des flacons coniques de 20 millilitres contenant 4,8 millilitres d’un média de culture stérile approprié avec 200 microlitres de culture pré-inoculum à une densité optique de 600 nanomètres de deux pour l’incubation à 30 degrés Celsius et 250 rpm. L’agitation à 250 révolutions par minute est essentielle pour atteindre une croissance appropriée dans de faibles concentrations de sources de carbone qui exercent une croissance respiratoire que nous avons observé une croissance réduite de levure dans des conditions respiratoires à des vitesses d’agitation inférieures. Pour permettre la mesure de la densité optique à 600 nanomètres toutes les deux heures pendant 24 heures, diluer 100 microlitres de la culture de flacon conique secoué dans 900 microlitres d’eau distillée dans une cuvette spectrophotomètre d’un millilitre et mélanger délicatement par pipette.Pour le traitement des données, dans un logiciel de paquet statistique approprié, créez un nouveau fichier de projet, ouvrez le nouveau menu de table et de graphique et sélectionnez XY. Sous le menu de données de l’échantillon, sélectionnez commencer par une table de données vide et un graphique de ligne de connexion. Laissez la section X non sélectionné dans les sous-comités pour les répétitions ou les valeurs d’erreur. Dans la section Y, sélectionnez entrez 10 valeurs de répétition dans des sous-comités côte à côte et tracez la moyenne et l’erreur SD. Cliquez ensuite créer.Entrez l’heure à laquelle les mesures de la DO ont été obtenues dans la colonne X et les valeurs d’OD obtenues à partir des cultures de la colonne Y. Pour identifier la phase de croissance exponentielle transformant les données de la colonne Y en logarithmes, cliquez sur analyser et sélectionner l’analyse de transformation. Utilisez Y égale le journal Y pour sélectionner les valeurs Y et ouvrir la galerie de résultats.Sélectionnez la table de données transformatrice, cliquez sur analyser et sélectionnez l’analyse de régression linéaire, à l’exclusion des valeurs de densité optique qui ne suivent pas une tendance linéaire en sélectionnant les valeurs de la table et en déprimant le contrôle et l’E.In la galerie de tableaux de données, sélectionnez les données d’une table et cliquez sur analyser. Sélectionnez l’analyse de l’ajustement de la courbe de régression non lignenelle et les ensembles de données à analyser, et cliquez sur OK. Appliquez ensuite les moindres carrés adaptés aux données, en laissant la section interpolate non sélectionné, et cliquez sur OK. Ensuite, ouvrez un nouveau fichier de projet, et dans le nouveau menu table et graphique, sélectionnez le choix de la colonne, commencez par une table de données vide et le graphique désiré. Définissez le graphique pour tracer la moyenne avec l’écart type, et cliquez sur créer.Copiez les valeurs moyennes ou delta du temps à partir du tableau des résultats de l’ajustement non ligneux dans la galerie de résultats et coller les données dans une colonne. Enfin, cliquez sur analyser et sélectionner l’analyse de l’intérêt dans le menu des analyses de colonne pour comparer les paramètres cinétiques des différentes conditions nutrimentales. Les valeurs du seuil cinétique de croissance varient d’une force à l’autre et doivent être évaluées en fonction des conditions que nous utilisons dans l’analyse.Les cultures démontrant un phénotype fermentatif ont une petite phase de décalage et une phase exponentielle avec un taux de croissance élevé. Les cultures qui obtiennent de l’énergie principalement par phosphorylation oxydative présentent une phase de décalage plus longue avec un taux de croissance lent pendant la phase exponentielle. Le calcul du taux de croissance spécifique et le doublement du temps des courbes de croissance à l’aide de l’équation de croissance exponentielle permettent d’établir des seuils pour les valeurs de croissance respiratoires et fermentatives.Par exemple, dans ces expériences représentatives, les effets de différentes concentrations de resvératrol sur les cellules BY4742 de S.cerevisiae révèlent la modification du statut énergétique cellulaire en réponse aux concentrations variables de glucose. Ici, la supplémentation avec 10%glucose démontre que les concentrations inférieures d’ammonium favorisent le métabolisme fermentatif comme en témoigne une phase de croissance exponentielle prolongée dans ces cultures, tandis qu’une concentration plus élevée induit un métabolisme respiro-fermentatif comme en témoigne une phase de décalage prolongée et un taux de croissance plus lent pendant la phase exponentielle. Enfin, de fortes différences dans les valeurs fermentatives de doublement du temps peuvent être observées entre ces deux souches de levure différentes cultivées dans les mêmes conditions, soulignant la nécessité de valider le seuil de double temps pour chaque souche analysée.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que ce protocole n’est utilisé que pour dépister le phénotype. Les effets spécifiques sur la respiration et la fermentation doivent être confirmés par des analyses de consommation d’oxygène ou par l’accumulation de sous-produits de fermentation respectivement.

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Saccharomyces cerevisiae Cinétique de croissance exponentielle en Culture pour analyser le métabolisme respiratoire et fermentatif (Vidéo) | JoVE Journal

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