Name: Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez comment isoler des neutrophiles de faible densité du liquide de lavage péritonéal pour générer des pièges extracellulaires (NETs) et visualiser leur interaction avec les cellules tumorales. Cette méthode avance la recherche en immunologie tumorale.

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Nous remercions Mme J. Shinohara et I. Steve de travail technique et clérical. Aussi, nous remercions les Drs Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina et Kazuya Takahashi pour leur coopération pour acquisition d’échantillon en salle d’opération. Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique du ministère de l’éducation, Science, Sports et Culture du Japon et la société japonaise pour la Promotion de la Science (17K 10606).

LDN provenaient de patients recrutés pour cette étude et ont été approuvées par les institutionnels Review Board de Jichi Medical University.
1. isolement de la LDN de Lavages de la cavité abdominale et détection NET
<ol><li>Acquisition de l’échantillon<ol>
<li>Infuser 1 000 mL de sérum physiologique stérile directement dans la cavité abdominale avant de refermer les plaies chez les patients ayant subi une chirurgie abdominale due à une tumeur maligne gastro-intestinale. NOTE : Échantillons provenaient de patients qui ont subi une gastrectomie, une colectomie ou OESOPHAGECTOMIE sans préjugé fondé sur l’âge ou le sexe. Une solution saline a été transférée dans un récipient et versée dans l’abdomen entier dans la minute. Ceci est habituellement exécuté comme un lavage péritonéal postopératoire sans effets significatifs sur les patients.</li>
		<li>Lavage de la cavité abdominale durant au moins 1 minute. Remarque : Il est recommandé que le liquide perfusé est agité doucement avec les mains du chirurgien afin que les échantillons soient uniformes.</li>
		<li>Récupérer 200 mL de liquide de lavage avec quatre seringues de 50 mL. NOTE : Parfois un raccord en caoutchouc est utilisé pour absorber les liquides.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Accomplissent la purification du LDN péritonéale à l’aide de granulocytes spécifiques mAb, CD66b16. Remarque : Étant donné que la couche intermédiaire après centrifugation en gradient de densité contient beaucoup de cellules mononucléées, sélection positive des neutrophiles polymorphe à l’aide de CD66b mAb a été réalisée.<ol>
<li>Transférer le liquide de lavage péritonéal dans un tube de 50 mL. Remarque : Dans cette étape, passer les fluides par un filtre de nylon 100 µm pour éliminer les impuretés.</li>
		<li>Centrifuger le liquide péritonéal à 270 g pendant 7 min à température ambiante.</li>
		<li>Remettre en suspension les pellets dans 5 mL de PBS avec EDTA de 0,02 %.</li>
		<li>Soigneusement superposer les 5 mL de suspension cellulaire sur une solution de gradient de densité 3 mL.</li>
		<li>Centrifuger à 1 700 x g pendant 15 min à ta sans les pauses.</li>
		<li>Récolter le ~ 2-3 mL de solution contenant les couches intermédiaires (Figure 1 a) à l’aide d’une pipette et mélangez-le avec 10 mL de PBS avec EDTA de 0,02 %.</li>
		<li>Centrifuger le liquide péritonéal à 400 g pendant 7 min à ta et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter un autre 10 mL de PBS avec 0,02 % EDTA et centrifuger à 270 x g pendant 7 min à RT. jeter le surnageant.</li>
		<li>Dissoudre le culot cellulaire (1 × 10-7) en 60 µL de tampon pour le kit de séparation cellule magnétique.</li>
		<li>Ajouter 20 µL du bloc Fc dans les granules et incuber pendant 10 min à 4 ° C.</li>
		<li>Ajouter 20 µL de l’anti-CD66b conjugué avec microbilles et incuber pendant une supplémentaire de 10 min à 4 ° C.</li>
		<li>Laver et remettre en suspension les pellets dans 500 µL de tampon de MACS.</li>
		<li>Appliquer la suspension cellulaire à une colonne magnétique du champ magnétique d’un séparateur magnétique approprié et de recueillir les intermédiaires contenant CD66b(-) des cellules de la colonne avec 15 mL de tampon de lavage.</li>
		<li>Retirer la colonne du séparateur magnétique et rincer immédiatement les cellules CD66b(+) magnétiquement étiquetées en appuyant fermement sur le piston dans la colonne. Remarque : La population de cellules CD66b(+) se compose principalement des neutrophiles, tel que déterminé par analyse de FACS indiquant que > 95 % de la fraction CD66(+) sont positives pour CD11b CD15 et CD16, mais négatives pour CD14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Génération des filets<ol>
<li>Après centrifugation à 270 g pendant 7 min à ta, remettre en suspension la LDN isolée (5 x 106) dans 1 mL de RPMI1640 avec 10 % FCS.</li>
		<li>Culture de la LDN sur une plaque enduite de 6 puits poly-L-lysine (6 cm de diamètre) pendant 2 h à 37 ° c à 5 % de CO2.</li>
		<li>Ajouter le contre-colorant fluorescent vert (un membrane imperméable au colorant pour colorer le noyau et les chromosomes) à la concentration finale de 5 µM.</li>
		<li>Immédiatement, observer la morphologie des filets (les composantes ADN extracellulaires expulsés de la LDN en microscopie de fluorescence).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. la coloration des cellules tumorales avec cellule fluorescente rouge Linker Dye
<ol><li>Préparer le cancer chez l’humain des lignées de cellules MKN45, NUGC et IC-1.</li>
	<li>Laver 1 x 107 cellules avec PBS + 0,02 % et d’EDTA dans un tube de 15 mL et centrifuger à 270 x g pendant 7 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution de colorant, coloration pour les pellets et Pipeter doucement.</li>
	<li>Dissoudre 4 µL de colorant rouge Fluorescent cellule Linker dans 1 mL de solution de coloration et mélanger avec la suspension de cellules de l’étape 2.2.</li>
	<li>Incuber les boulettes pendant 4 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 4 mL de DMEM (10 % FBS) pour arrêter la réaction de coloration.</li>
	<li>Centrifuger 270 x g pendant 7 min et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.6 et 2.7 deux fois.</li>
	<li>Vérifier avec un microscope à fluorescence (excitation = 551 nm, émettant = 567 nm) que les cellules tumorales sont colorés de rouge.</li>
</ol>3. analyse de l’adhésion cellulaire tumorale aux filets
<ol><li>Remettre en suspension les cellules de tumeur tachée fluorescent rouge (1 x 10-6) dans 1 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 0,1 % de BSA.</li>
	<li>Ajouter les cellules tumorales à la culture de la LDN qui produit les filets tel que décrit à l’étape 1.3.</li>
	<li>Incuber pendant 5 min à 37 ° c, ce qui permet aux cellules tumorales de contacter les filets. Remarque : D’incubation longue induit adhérence de cellules tumorales à LDN ou aux plaques.</li>
	<li>Enlever le support et laver délicatement les puits en ajoutant 2 mL de médias préchauffée (0,1 % de BSA + RPMI 1640) et en agitant le plat.</li>
	<li>Répéter la procédure de nettoyage à l’étape 3.4 deux fois. NOTE : Depuis les filets faiblement fixer sur la plaque, le lavage se fasse aussi doucement que possible pour éviter la suppression des filets eux-mêmes.</li>
	<li>Ajouter le colorant fluorescent vert pour colorer le noyau et les chromosomes à une concentration finale de 5 µg/mL pour la visualisation des filets.</li>
	<li>Observer les filets et attaché en utilisant les filtres appropriés des cellules tumorales (verte, excitation = 504 nm, émettant = 523 nm ; rouge, excitation = 551 nm, émettant = 567 nm).</li>
	<li>Fusionner les chiffres pour montrer les cellules tumorales qui sont piégés par les filets. NOTE : Dans certaines expériences, enzyme de dégradation de l’ADN a été ajoutée à la culture de la LDN (concentration finale de 100 U/mL) 5 min avant incubation co pendant 5 min.</li>
</ol>4. time Lapse analyse vidéo des cellules tumorales piégés
<ol><li>Culture la LDN péritonéale dans un 35 mm rond plat recouvert de poly-L-lysine, tel que décrit à l’étape 1.3.</li>
	<li>Ajouter le colorant fluorescent vert pour colorer le noyau et les chromosomes de visualiser les filets tel que décrit à l’étape 1.3.</li>
	<li>Après 1 min d’incubation, retirez le support et ajouter 2 mL de 0,1 % de BSA + RPMI 1640.</li>
	<li>Retirez le support et ajouter sans coloration 1 x 106 MKN45 cellules en suspension dans 0,1 % BSA + RPMI 1640. Incuber 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Supprimez toutes les cellules tumorales seules en lavant doucement comme indiqué au point 3.4 et DMEM avec 10 % de FCS additionné de 100 u/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine.</li>
	<li>Monter la boîte de Petri dans un système d’observation de vue ensemble cellule, puis sélectionnez le champ approprié dans les tumeurs des cellules sont pris au piège par les filets.</li>
	<li>Continuer de co-culture pendant encore 2 jours et prendre des photos continues du champ toutes les 6 minutes sous une lumière normale et la fluorescence, qui permet de détecter les cellules MKN45 et filets, respectivement.</li>
	<li>Superposer les images à chaque validant et construire des vidéos time-lapse utilisant le logiciel Image Viewer.</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).</li>
<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Des études antérieures ont signalé que les cellules tumorales circulantes peut être piégé par des substrats NET en vivo10,,11. Les cellules de cancer du sein métastatique ont été démontrés pour stimuler des neutrophiles et induisent la formation des filets, qui contribue à la croissance des cellules tumorales dans les organes de cible17. En outre, nous avons constaté que les cultures à court terme de LDN de liquide de lavage posto...

Neutrophiles nucléaires polymorphe dans le sang circulant sont généralement séparés de cellules mononucléaires via la méthode de préparation de gradient de densité. Toutefois, certains neutrophiles appelés neutrophiles faible densités (LDN), avec des phénotypes CD11b(+), CD15(+), CD16(+) et CD14(-), sont conjointement purifiées avec des cellules mononucléaires. Le nombre relatif de LDN augmente de manière significative dans diverses conditions pathologiques, y compris les maladies auto-immunes1,2, septicémie3et cancer4,5. Des études antérieures ont montré que LDN constituent une classe phénotypiquement et fonctionnellement distincte de neutrophiles6. Il est à noter que LDN dans le sang circulant sont plus susceptibles de produire des pièges extracellulaires neutrophiles (filets) que la densité normale neutrophiles2,7. Les filets sont des structures de toile d’araignée composés d’acides nucléiques, histones, protéases et protéines granulaires et cytosoliques, et ils peuvent efficacement piéger et détruire les agents pathogènes8.
Récemment, les filets ont démontré pour capturer non seulement les microbes, mais aussi les plaquettes et circulation de cellules tumorales qui peuvent aider à thrombus formation9 et tumeur métastases10,11. Cependant, les mécanismes moléculaires interactions adhésives entre les filets et les plaquettes ou les cellules tumorales sont encore peu claires. Plus récemment, un essai d’adhérence in vitro ont révélé que les cellules de la leucémie myéloïde (K56212) et de cellules de carcinome du poumon (A54913) attachent à filets via les intégrines β1 et β3. Les auteurs ont utilisé le stock NET isolés des neutrophiles et activé par phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme l’adhérence substrat14. Bien que ce test permet de détecter des interactions réelles avec composantes nettes en l’absence des neutrophiles, on peut affirmer si la « acellulaire stock NET » isolé par centrifugation à haute vitesse est toujours la structure moléculaire identique à filets produits dans vivo. Récemment, nous avons trouvé ce liquide de lavage péritonéal après que chirurgie abdominale contenait de nombreux LDN mature, qui généré des filets massives et attachés aux cellules tumorales causant des métastases péritonéales,15. Dans cette étude, nous avons examiné avec succès l’adhérence des cellules tumorales aux filets intacts sans aucune manipulation physique. Ici, nous montrons les détails d’une technique pour détecter des interactions adhésives entre les filets et les cellules tumorales gratuit.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, SUÈDE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>DirectFrom&trade ; Microbilles de sang total CD66b</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Bloc Fc</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Solution de rinçage MACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Solution mère MACS BSA</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur magnétique MACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX colorant d’acide nucléique vert 5mM solution dans DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kit de liaison cellulaire fluorescente rouge pour le marquage général de la membrane cellulaire</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>Diluant C</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis</td><td>CGLDIL RPMI1640</td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modifié à glucose moyen-élevé (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)</td><td>nacalai tesque, Japon</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, qualifié, régions approuvées par l’USDA</td><td>gibco by life technologies, Mexique</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Poudre lyophilisée d’albumine sérique bovine, &ge ; 96 % (électrophorèse sur gel d’agarose)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Life Technologies Japon</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin Prophylactique</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-USA</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>MICROPLAQUE enrobée de poly-L-Lysine 6Well</td><td>IWAKI, Japon</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well</td><td>IWAKI, Japon</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope à fluorescéine</td><td>BX8000, Keyence, Osaka Japon</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Système d’observation de cellules à vue d’ensemble</td><td>Nikon, Kanagawa, Japon</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>MKN45 lignée cellulaire de cancer gastrique humain</td><td>Riken, Tukuba Japon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire de cancer gastrique humain NUGC-4</td><td>Riken, Tukuba Japon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCUM-1 Lignée cellulaire de cancer gastrique humain</td><td>Université de la ville d’Osaka, Japon</td><td>N/A</td><td>Don du Dr M.Yashiro</td></tr></tbody></table>

neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Activé des neutrophiles libération neutrophiles extracellulaire pièges (filets), qui peuvent capturer et détruire les microbes. Des études récentes suggèrent que les filets sont impliqués dans divers processus morbides, comme auto-immunes métastases maladie, thrombose et la tumeur. Ici, nous montrons une technique détaillée in vitro pour détecter les activités NET durant le piégeage des cellules tumorales libre, ce qui poussent après fixation de filets. Tout d’abord, nous avons recueilli des neutrophiles faible densité (LDN) du liquide de lavage péritonéal postopératoire des patients qui ont subi les laparotomies. Culture à court terme de la LDN a entraîné formation nette massive qui a été visualisée avec nucléaire vert fluorescent et contre-colorant chromosome. Après incubation Co de lignées cellulaires de cancer de l’estomac humain MKN45, IC-1 et NUGC-4 avec les filets, nombreuses cellules tumorales ont été piégés par les filets. Par la suite, la pièce jointe a été complètement abrogée par la dégradation des filets avec la DNase I. décomposée vidéo a révélé que les cellules tumorales, pris au piège par les NETs ne sont pas mort mais a grandi au contraire vigoureusement dans une culture continue. Ces méthodes peuvent être appliquées à la détection des interactions adhésives entre les filets et les différents types de cellules et de matériaux.

Dans la culture de 2 heures, LDN CD66b(+) dérivées de structures fluide chaîne montraient lavage péritonéal teinté avec un colorant fluorescent vert pour nucléaire et chromosome (Figure 1 b), tout en CD66b(-) les cellules mononucléaires n’ont pas (Figure 1). Toutefois, lorsque les cultures LDN prétraités avec 100 U/mL DNase I, la structure a été détruite (Figure 1), indiquant qu’ils étaient composés ...

Nous présentons ici une méthode dans laquelle neutrophiles humains de faible densités (LDN), récupérés du liquide de lavage péritonéal postopératoire, produisent massives pièges extracellulaires neutrophiles (filets) et efficacement emprisonnent quelques cellules tumorales gratuit qui poussent par la suite.

Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle des sous-populations de neutrophiles dans l’immunologie tumorale, en particulier sur l’implication mécanique des pièges extracellulaires des neutrophiles, ou TNE, dans les métastases tumorales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser les interactions adhésives des cellules tumorales avec les TNE intactes. Les implications de cette technique s’étendent au traitement du cancer.Comme les TNE dérivées de sous-ensembles spécifiques de neutrofil peuvent favoriser les métastases tumorales. La démonstration de la procédure sera assurée par Junko Shoniohara de notre laboratoire. Pour acquérir les neutrophiles, perfiez d’abord un litre de solution saline stérile normale immédiatement avant la fermeture de la plaie directement dans la cavité abdominale d’un patient qui vient de subir une chirurgie abdominale en raison d’une tumeur maligne gastro-intestinale et lavez la cavité abdominale de manière extensive pendant au moins une minute.Ensuite, mélangez la solution saline à l’intérieur de la cavité et récupérez 200 millilitres de liquide lavé avec quatre seringues de 50 millilitres. En laboratoire, transférez le liquide de lavage péritonéal à travers un filtre en nylon de 100 micromètres dans des tubes individuels de 50 millilitres pour la centrifugation. Remettez les granulés en suspension dans 5 millilitres de PBS complété par 0,02 % d’EDTA et superposez soigneusement chaque suspension cellulaire sur trois millilitres de solution à gradient de densité.Après la séparation par gradient de densité, prélevez deux à trois millilitres de la couche intermédiaire de chaque tube et lavez les échantillons de liquide péritonéal dans 10 millilitres de PBS frais plus EDTA par tube. Accumulez les granulés dans 10 millilitres de PBS frais plus EDTA pour un lavage supplémentaire et diluez les cellules à une fois 10 à 10 à la septième cellules par 60 microlitres de concentration tampon de tri cellulaire activé magnétique, ou MACS. Bloquez toute liaison non spécifique avec 20 microlitres de bloc Fc pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius suivi de l’ajout de 20 microlitres de billes magnétiques anti-CD66b.Après 10 minutes à quatre degrés Celsius, laver et remettre en suspension les cellules dans 500 microlitres de tampon MACS et ajouter les cellules à une colonne magnétique de taille appropriée dans le champ magnétique d’un séparateur magnétique approprié. Lorsque toutes les cellules négatives CD66b ont traversé la colonne, ajoutez 15 millilitres de tampon MACS frais dans le réservoir de la colonne et transférez la colonne du séparateur magnétique dans un nouveau tube conique. Ensuite, plongez immédiatement la colonne pour rincer le CD66b positif marqué magnétiquement dans le tube.Après centrifugation, remettre en suspension les neutrophiles isolés de faible densité à raison de cinq fois 10 à six cellules par millilitre de milieu RPMI1640 complété par une concentration de FBS et ensemencer 1 millilitre de neutrophiles par puits sur la plaque à six puits recouverte de poly-L-lysine. Après deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, colorez les cellules de chaque puits avec une membrane fluorescente appropriée, un colorant nucléaire et chromosomique imperméable selon les instructions du fabricant et observez immédiatement la morphologie des TNE par microscopie à fluorescence. Pour évaluer l’adhésion des cellules tumorales aux TNET, les cellules tumorales gastriques colorées avec le colorant fluorescent contrastant à une fois 10 à six par millilitre de RPMI1640 complétées par une concentration d’albumine sérique bovine de 0,1 % et ajoutez un millilitre de cellules tumorales à chaque puits des cultures de neutrophiles à faible densité.Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, retirez le surnageant de chaque puits et lavez doucement les cellules deux fois avec 2 millilitres de milieu de RPMI1640 préchauffé complété par BSA par lavage. Une incubation de cinq minutes est suffisamment longue pour détecter une liaison spécifique aux NET. Ajoutez le milieu réchauffé sur le côté de chaque puits, remuez lentement et doucement la plaque et retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur.Les TNE et les cellules tumorales attachées peuvent ensuite être observées par microscopie à fluorescence. Pour une analyse vidéo en accéléré des cellules tumorales piégées, la culture et la coloration des neutrophiles péritonéaux de faible densité dans une boîte de 35 millimètres, recouverte de poly-L-lysine, comme démontré, suivie d’un bref lavage dans deux millilitres de 0,1 % BSA plus RPMI1640. Remplacez le milieu par une fois 10 à la sixième cellules tumorales gastriques non colorées en suspension dans deux millilitres de RPMI complété par BSA pour une incubation de cinq minutes à température ambiante.À la fin de l’incubation, rincez les cellules dans deux millilitres de RPMI frais complété par de la BSA pendant cinq minutes à température ambiante, puis agitez doucement pour éliminer toutes les cellules tumorales non attachées. Ensuite, remplacez le surnageant par du DMEM complété par du FBS et des antibiotiques et montez la parabole dans un système d’observation cellulaire à vue d’ensemble pour l’analyse en accéléré du piégeage des cellules tumorales par les TNE. Après deux heures de culture, les neutrophiles de faible densité CD66b positifs dérivés du liquide de lavage péritonéal présentent des structures de cordes par coloration nucléaire et chromosomique fluorescente verte, contrairement aux cellules mononucléées CD66b négatives.Cependant, lorsque les cultures de neutrophiles à faible densité sont prétraitées avec 100 unités par millilitre d’ADN I, les structures caractéristiques sont détruites, indiquant que les structures sont composées d’ADN extracellulaire expulsé des neutrophiles. Lorsque les neutrophiles de faible densité sont cultivés sur des plaques de plastique non revêtues, de nombreux amas de TNE peuvent être observés flottant dans le milieu, avec peu de TNE attachées au fond de la boîte. Après cinq minutes d’incubation avec une lignée cellulaire de tumeur gastrique marquée par fluorescence, de nombreuses cellules tumorales se fixent aux neutrophiles à l’intérieur des NET, un phénomène qui n’est pas observé après prétraitement avec l’ADN I. Des modèles d’adhésion similaires sont également observés pour d’autres cellules tumorales.OKUM-1 et NUGC-4. Il est intéressant de noter que, alors que les TNE disparaissent progressivement en quelques heures après une co-culture prolongée de cellules tumorales, les cellules tumorales piégées par les TNE commencent à proliférer vigoureusement après la libération de TNE. Au cours de cette procédure, il est important de se rappeler que, comme les NET adhèrent faiblement à la plaque, les processus de lavage et de transfert de la vaisselle doivent être effectués de manière particulièrement prudente.Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs de divers domaines de la science biomédicale pour explorer la relation causale des TNE avec diverses maladies telles que la thrombose, le syndrome de réponse inflammatoire systémique et les maladies auto-immunes.

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Neutrophiles pièges extracellulaires (NET) sont un important mécanisme immunitaire inné pour combattre les bactéries pathogènes, champignons et parasites. Nous décrivons ici les méthodes d'isoler granulocytes neutrophiles dans le sang humain et de les activer pour former NET. Nous présentons les techniques de préparation de visualiser NET en microscopie optique et électronique.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure d’isolement des neutrophiles de basse densité, ou LDN, du liquide de lavage péritonéal d’un patient humain postopératoire. Les LDN ainsi obtenus peuvent être utilisés dans d’autres expériences en aval pour comprendre leur rôle dans la croissance et la progression tumorales.

Isolement péritonéal des neutrophiles de basse densité : une technique pour obtenir des neutrophiles de basse densité à partir d’un liquide de lavage péritonéal à l’aide du tri cellulaire activé magnétique

Cette vidéo montre la coloration fluorescente des pièges extracellulaires des neutrophiles, les composants extracellulaires de l’ADN expulsés par les neutrophiles. Cette technique permet de visualiser l’interaction adhésive entre les cellules cancéreuses et les TNE.

Microscopie à fluorescence des pièges extracellulaires neutrophiles ou TNE : une technique pour observer l’interaction adhésive entre les cellules cancéreuses et les TNE

Dans cette vidéo, nous analysons le comportement post-adhésion des cellules cancéreuses piégées dans des pièges extracellulaires de neutrophiles (TNE) en co-cultivant des neutrophiles de basse densité et des cellules cancéreuses gastriques. L’analyse vidéo en accéléré permet de surveiller divers événements cellulaires et d’étudier le rôle des TNE dans des conditions pathologiques.

Microscopie à fluorescence time-lapse des pièges extracellulaires neutrophiles ou TNE : une technique pour analyser l’interaction post-adhésion entre les cellules cancéreuses et les TNE

Cette vidéo présente une technique in vitro pour générer et isoler des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Les neutrophiles sont isolés du sang périphérique et stimulés avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA) pour produire des TNE. Au cours de l’incubation, les neutrophiles subissent un processus de mort cellulaire (NETosis) pour libérer des TNE composées de chromatine décondensée mélangée à des protéines cytoplasmiques granulaires.

Une technique in vitro pour générer des pièges extracellulaires de neutrophiles humains

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test utilisant la microscopie à fluorescence pour détecter l’adhésion des cellules cancéreuses aux pièges extracellulaires des neutrophiles (TNE). Dans les puits d’essai, il y a une augmentation notable du nombre de cellules cancéreuses marquées par fluorescence adhérant aux TNE, tandis que les puits traités avec de la DNase présentent une adhésion réduite des cellules cancéreuses aux TNE.

Essai d’adhésion in vitro pour détecter l’adhérence des cellules cancéreuses aux pièges extracellulaires des neutrophiles

Les neutrophiles jouent un rôle important non seulement dans la défense de l’hôte contre les micro-organismes envahisseurs, mais sont également impliqués dans la surveillance immunitaire des cellules tumorales. Ici, nous décrivons des techniques liées à l’isolement de neutrophiles ayant des propriétés antitumorales et des méthodes de surveillance de la fonction antitumorale des neutrophiles in vitro et in vivo.

Isolement et caractérisation de neutrophiles avec des propriétés anti-tumorales

Un protocole pour l’induction et l’analyse de pièges extracellulaires (TNE) in vitro est présenté. La quantification de l’ADN, de la cathélicidine (LL37) et de l’activité enzymatique a fourni des données qui montrent la variabilité de la composition et de la morphologie des TNE induites par des stimuli microbiens et chimiques dans des conditions contrôlées similaires.

Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Nous présentons une méthode automatisée à haut débit pour quantifier les pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles en utilisant le système d’analyse de cellules vivantes, couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire.

Technique à haut débit en temps réel pour quantifier la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles dans les neutrophiles humains

Ce protocole définit une approche de microscopie à haut débit en temps réel pour visualiser et quantifier la libération de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles humains in vitro. La méthode reproductible permet d’étudier les caractéristiques et la cinétique de la libération de TNE lors de la stimulation avec des inducteurs de NETosis distincts et permet d’évaluer la pharmacologie des antagonistes de NETosis.

Quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes

Une série de méthodes est décrite, notamment l’isolement des lipoprotéines de basse densité (LDL) du plasma humain, la différenciation des cellules HL-60 en cellules de type neutrophile, la préparation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) en présence de LDL et la stimulation des cellules endothéliales aortiques humaines avec un mélange de TNE et de LDL.

Stimulation de cellules endothéliales vasculaires à l’aide de pièges extracellulaires de neutrophiles en présence de lipoprotéines de basse densité

Découvrez comment isoler des neutrophiles de faible densité du liquide de lavage péritonéal pour générer des pièges extracellulaires (NETs) et visualiser leur interaction avec les cellules tumorales. Cette méthode avance la recherche en immunologie tumorale.

Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales (Vidéo) | JoVE Journal

Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales

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