Name: Détection de faibles copies numéro ADN Viral intégré formé par In Vitro l’infection par l’hépatite B (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Apprenez une méthode sensible et économique pour détecter l'intégration de l'ADN du virus de l'hépatite B dans les génomes hôtes in vitro. Cette technique permet une quantification absolue et une cartographie précise des jonctions virus-hôte.

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Cet ouvrage a reçu en financement du Centre allemand pour Infection Research (DZIF), TTU hépatite projets 5.807 et 5.704, le TRR179 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (TP 15) et le Centre australien pour le VIH et l’hépatite Virology Research.
Nous sommes reconnaissants au professeur William Mason pour son rôle dans le développement de la méthode originale d’invPCR et démonstration il nous. Nous tenons à remercier les Drs Yi Ni et Florian A. Lempp pour réactifs (lignées cellulaires et inoculum VHB). Nous reconnaissons Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt et Dr Katrin Schöneweis pour l’assistance technique. Nous sommes reconnaissants à Miriam Kleinig pour la relecture et aux professeurs Nicholas Shackel et Ralf Bartenschlager pour un soutien continu.

1. Infection et Extraction de l’ADN des cellules
<ol><li>Maintenir la culture Huh7-NTCP cellules8,9 dans de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de sérum bovin foetal 10 % v/v, 1 x pénicilline/streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Remarque : Cela a déjà été rapporté en détail40.</li>
	<li>Graine 2 x 105 cellules/mL Huh7-NTCP cellules dans une plaque de 12 puits avec 1 mL de DMEM.</li>
	<li>Si les essais de traitements aux cellules (p. ex., inhibiteurs de VHB), appliquez-les au surnageant de culture 4 h après l’ensemencement (1 jour avant l’infection par le VHB). Pour un contrôle négatif, appliquer 200 nM Myrcludex B (un puissant VHB entrée inhibiteur41).</li>
	<li>Utilisez le surnageant42 colonnes héparine purifié de HepAD3843 comme inoculum d’infecter des cellules à 1 000 VGE/cellule de 500 µL de milieux de culture (DMEM additionné de sérum de veau fœtal 10 % v/v, 1 x pénicilline/streptomycine et 2 mM de L-glutamine 2,5 % v/v DMSO), contenant 4 % w/v polyéthylèneglycol 8000 [dissous dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)].</li>
	<li>La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C (fixée à 5 % CO2 et 90 % d’humidité).</li>
	<li>Laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS stérile 1 x à post-infection 16 à 24 h.</li>
	<li>Remplacer les milieux de culture tous les 2 jours suivant l’infection par le VHB jusqu'à la récolte.</li>
	<li>Infection après jour 3, traiter les cellules avec le fumarate de 5 µM et 10 µM Lamivudine à limiter la production d’intermédiaires réplicatifs de HBV sont amplifiables par invPCR.</li>
	<li>À post-infection J5, trypsinize les cellules avec 200 µL de trypsine-EDTA et les remettre en suspension dans 2 mL de DMEM (additionné de sérum de veau fœtal 10 % v/v, 1 x pénicilline/streptomycine et 2 mM de L-glutamine), contenant également le fumarate de 5 µM et 10 µM Lamivudine.</li>
	<li>Transférer les cellules en suspension dans une plaque 6 puits pour induire une ronde de la mitose (qui a été rapportée pour induire la perte du VHB cccDNA44 et autres intermédiaires de l’ADN du VHB qui sont amplifiables par invPCR).</li>
	<li>À post-infection jour 7, trypsinize les cellules élargies de 400 µL de trypsine-EDTA et remettre le mélange dans 1 mL de DMEM. Placer la suspension dans un tube de 1,5 mL, les cellules de granule par centrifugation à 500 g pendant 5 min et retirer le surnageant par aspiration.</li>
	<li>(Facultatif) Stocker les pellets de cellule à-20 ° C jusqu'à ce qu’ils sont prêts pour l’extraction d’ADN.</li>
	<li>Extrait l’ADN le culot cellulaire à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN, selon les instructions du fabricant. Estimer la concentration finale d’ADN à l’aide de densitométrie optique. Remarque : Le rendement de l’ADN dans un volume d’élution de 100 μL est généralement ~ 250-400 ng/μl.</li>
</ol>2. l’inversion de l’ADN
<ol><li>Aliquot ~1.5–2.5 μg de l’ADN total extrait à l’étape 1 dans un tube PCR 200 μL. Ajouter la quantité appropriée de restriction enzyme master-mix causera un volume réactionnel de 40 μL contenant 1 x tampon de réaction digest (e.g., CutSmart tampon) et 10 U s/offj’ai-HF.</li>
	<li>Bien mélanger les réactions et tournez en bas dans une centrifugeuse de petit tube. Incubez la réaction de l’enzyme de restriction dans une machine PCR à 37 ° C pendant 1 h pour une efficacité optimale de la digestion.</li>
	<li>Inactiver les enzymes de restriction en incubant à 80 ° C pendant 20 min.</li>
	<li>La réaction de toute restriction enzyme dans un tube de 1,5 mL de transfert. Ajouter 400 ml de 1 x T4 DNA ligase tampon et 500 U de T4 DNA ligase et mélanger soigneusement. Le volume de la grande réaction encourage intra moléculaire (par opposition à inter moléculaires) ligature des fragments d’ADN digérés.</li>
	<li>Incubez la réaction de ligature à température ambiante pendant 2 h pour s’assurer de la ligature complète.</li>
	<li>Inactiver la ligase d’ADN T4 à 70 ° C pendant 20 min.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de 10 % p/v dodécyl sulfate de sodium à garantir l’inactivation complète de la ligase T4.</li>
	<li>Mélanger les tubes au vortex de pouls et tournez brièvement en bas le mélange réactionnel. Ajouter NaCl à une concentration finale de 100 mM et dextran (35 – 45 kDa) à une concentration finale de 90 µg/mL. Mélanger les tubes au vortex de pouls et tournez brièvement en bas le mélange réactionnel.</li>
	<li>Ajouter 900 μL d’éthanol à 100 % et mélanger par retournement. Précipiter l’ADN à-20 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Pellet l’ADN précipité par centrifugation à 14 000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant par aspiration avec une pipette de P200. Laver le culot avec 500 μl d’éthanol à 70 % v/v et centrifugation à 14 000 x g pendant 15 min.</li>
	<li>Supprimer l’éthanol par aspiration avec une pipette de P200. Sécher le culot d’ADN à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Dissoudre le culot dans 20 μL de H2O. Ajouter 20 μL d’une enzyme de restriction master-mix causera un volume réactionnel de 40 μL contenant 1 x tampon de réaction digest, 5 U de BsiHKAI et 5 U de Sphj’ai-HF incuber la réaction de l’enzyme de restriction dans un chaleur-bloc à 37 ° C (la température optimale pour Sphj’ai-HF) pendant 1 h.</li>
	<li>Tournez brièvement en bas le mélange réactionnel. Incubez la réaction de l’enzyme de restriction dans un bloc chauffant à 65 ° C (la température optimale pour BsiHKAI) pendant 1 h.</li>
	<li>Tournez brièvement en bas le mélange réactionnel.</li>
	<li>Stocker l’ADN inversé à-20 ° C jusqu’au niveau suivant.</li>
</ol>3. nested PCR
<ol><li>Retirez les amplicons potentiels un joint mat en silicone réutilisables à l’aide d’une solution de dégradation de l’ADN, rincer le tapis avec de l’eau sans ADN et il sécher à température ambiante pendant la préparation du mélange PCR.</li>
	<li>Préparer 1 mL d’un mélange de x PCR 1 contenant de l’extérieur vers l’avant (5'-TTC GCT TCA TDC CTG CAC G-3') et inverse (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3') des amorces à une concentration de 0,5 µM.</li>
	<li>Ajouter 170 μl du 1 mélange x PCR aux puits A1 et E1 dans une plaque à 96 puits PCR.</li>
	<li>Ajouter 120 μl du 1 mélange x PCR aux puits B1 à H1.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de l’ADN inversé de l’étape 2 pour puits A1 et E1 (2 différents échantillons inversés peuvent être analysés sur la même plaque PCR). Mix la réaction dans chaque puits de pipetage doucement environ 10 fois en utilisant un P1000 la valeur 100 μL.</li>
	<li>Les échantillons dilués en série de puits A1 à D1 à un ratio de 1:3 en transférant 60 μl à chaque étape. Les puits à chaque étape de la composition d’eux pipetage doucement sur 10 fois en utilisant un P1000 la valeur 100 μL. Éviter la formation de bulles. Répétez l’étape 3.6 pour bien E1, diluer jusqu'à bien H1.</li>
	<li>Aliquote 10 μl du mélange réactionnel en utilisant une pipette multi-canaux provenant de puits A1-H1 dans puits A2-H2, A3-H3, et ainsi de suite jusqu’au puits A12-H12 de la plaque de 96 puits. Couvrir la plaque PCR avec le tapis de silicone sèche à l’étape 3.1, en appuyant fermement.</li>
	<li>Placer la plaque dans une machine PCR et exécuter le programme suivant : 10 min à 95 ° C ; 35 cycles de 15 s à 95 ° C, 15 s à 54 ° C et 3 min à 72 ° C ; 7 min à 72 ° C ; Ensuite, tenir la plaque à température ambiante.</li>
	<li>Faites chauffer les broches d’un réplicateur 96 broches à chauffé au rouge avec un bec Bunsen et refroidir pendant au moins 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Remplir les puits d’une plaque PCR deuxième avec 10 μL de 1 mélange de x PCR (contenant une charge prête de tampon de gel) et l’attaquant interne (5'-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3') et inverse (5'-CAC AGC LTC GCA GCC ATG G-3') à 0,5 µM.</li>
	<li>Soigneusement retirer le tapis de silicone de la plaque PCR de la plaque à 96 puits depuis le premier tour PCR et éviter la contamination croisée entre les puits.</li>
	<li>Le réplicateur refroidi permet de transférer les produits PCR de la plaque à 96 puits de PCR de premier tour à la plaque à 96 puits nouvellement aliquotés. Réaliser la PCR nichée en utilisant les mêmes conditions qu’à l’étape 3.8, sauf pour changer l’étape initiale de la dénaturation à 95 ° C de 10 min à 2 min.</li>
</ol>4. PCR produit d’Isolation et de Gel Extraction
<ol><li>Analyser les produits PCR par électrophorèse sur gel en utilisant un 96 puits avec gel d’agarose 1,3 % w/v. Pour un gel d’agarose de 100 mL, courir à 200 V pendant 10 à 15 min.</li>
	<li>Les bandes d’ADN des à l’aide de pailles jetables des gels d’agarose de l’accise. Pour chaque produit PCR, placer la paille et gel d’agarose à brancher sur un tube de 1,5 mL et couper la paille à la taille avec des ciseaux. Remarque : Il suffit d’isoler des bandes qu’à partir de ces dilutions dans lequel seul produits PCR peuvent être résolus.</li>
	<li>(Facultatif) Stocker les tubes à-20 ° C pour l’extraction ultérieure.</li>
	<li>Éjecter les bouchons d’agarose dans chaque tube en serrant sur la fin du fragment paille. Ajouter 300 μl de tampon d’extraction gel et 5 μL de gel extraction verre perle de boue à chaque tube.</li>
	<li>Extraire les produits PCR selon les instructions du fabricant pour le kit d’extraction de gel (sauf pour le lavage des étapes en utilisant moitié-volumes) et éluer les perles avec 30 μL d’eau de l’ADN.</li>
	<li>Soumettre l’ADN purifié pour Sanger séquençage (selon les instructions du fournisseur) avec l’amorce vers l’avant pour le second tour nested PCR.</li>
</ol>5. analyse de la séquence
<ol><li>Confirmez jonctions ADN virus-cellules en nucléotides BLAST analyse (en utilisant les paramètres par défaut en alignant à la collection entière de nucléotides). NOTE : Résultats représentatifs sont détaillés dans la Figure 3 ci-dessous.<ol>
<li>Si seulement on observe un alignement partiel de la séquence, couper la séquence d’ADN du VHB 5' avant de re-exécuter une analyse de l’explosion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appliquer les critères de sélection rigoureux pour déterminer si une séquence donnée représente une jonction de véritable intégration comme suit :<ol>
<li>Inclure uniquement les séquences contenant > 20 bp d’une séquence de cellulaire pour la cartographie confiante au génome cellulaire.</li>
		<li>Ne pas tenir compte de toutes les séquences qui contiennent des sites de restriction de toute enzymes utilisées dans 10 bp de la jonction d’intégration supposé virus-cellule, puisqu’ils représentent probablement des événements in vitro la ligature, plutôt que les jonctions de véritable intégration.</li>
		<li>Ne pas tenir compte de toutes les séquences avec des niveaux de fluorescence évidente dissemblables pointe de chaque côté de la jonction de la prétendue intégration dans chromatographes de séquençage, car ce sont des artefacts probables générés par contamination croisée au cours de la réaction de séquençage ou chromatographie sur colonne capillaire.</li>
		<li>Définir une intégration unique événements que ceux avec le VHB exacte et les séquences cellulaires à la jonction de virus-cellule. NOTE : Répétition des événements d’intégration unique peut résulter d’une expansion clonale de cellules contenant ces intégrations ou contamination croisée au cours de la PCR (qui peut être testé à l’aide de réactions négatives-contrôle, décrites plus en détail dans les résultats représentatifs ci-dessous). Intégrations répétées en séquences cellulaires spécifiques devraient afficher différents sites terminaux VHB pour chaque événement de l’intégration, comme voies de fin-joining non homologue sont utilisés15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculer la fréquence d’intégration en multipliant le facteur de dilution des gabarits d’ADN inversés par le nombre de jonctions cellules virus détecté à cette dilution, suivie de normalisation au montant de l’apport total de l’ADN dans la réaction d’inversion. En règle générale, la fréquence d’intégration est l’ordre de 01:104 cellules.</li>
</ol>

S.U. est un co-candidat et co-inventeur de brevets protégeant des Myrcludex B comme un inhibiteur d’entrée VHB/HDV. T.T. ne déclare aucun conflit d’intérêt.

Avant d’exécuter le protocole, il est important de noter que ce test d’invPCR est une technique très sensible, peut amplifier les copies uniques de la matrice d’ADN. Limiter la contamination par les produits PCR est donc d’une importance capitale. Stratégies générales pour limiter la contamination des produits PCR incluent ce qui suit. (i) établir des zones physiquement distinctes pour les différentes étapes de la méthode. Chaque zone doit avoir séparé des sarraus et gants doivent être changés lors du passage entre ces domaines. Nous avons listé ces zones ci-dessous dans l’ordre de plus à la moins susceptible d’être contaminé : PCR produit d’extraction et de séquençage installation zone de réaction (post-PCR) ; Ajout de modèle PCR et flambé broches transfert de zone (avec une lampe UV décontamination avec de bons résultats, nous avons utilisé les hottes PCR) ; Zone d’extraction et une inversion de l’ADN (pre-PCR) ; et un espace de « DNA exempt de modèle » utilisé uniquement pour la préparation de stock et des solutions PCR. (ii) être au courant de circulation d’air dans le laboratoire comme un facteur potentiel de contamination croisée. En particulier, la contamination croisée des réactions de PCR au cours de l’étape de transfert de broche flambé est plus susceptible de se produire et vous conduisent à la quantification inexacte de la fréquence d’intégration. Hottes PCR peuvent être utilisés pour limiter ces regards croisés. Puits de contrôle négatif (par exemple, les échantillons traités Myrcludex B ou aucun contrôle de modèle) dans la PCR peuvent servir aussi pour tester la contamination croisée. (iii) limiter les contaminants potentiels de PCR sur les pipettes et les surfaces de travail en les essuyant régulièrement avec une solution de dégradation de l’ADN.
Le protocole spécifié ici est conçu pour détecter l’intégration d’un clone de VHB infectieux connu produit de la HepAD38 cellulaire ligne42. Si l’inoculum utilisé est d’une séquence d’ADN du VHB différente (par exemple, du sérum de patient), puis le génome du VHB doit être tout d’abord séquencé pour confirmer la compatibilité des amorces de PCR et de la conception de l’inversion. Dans les études publiées antérieurement19, nous avons utilisé 3 séries d’amorces permettant de lier des séquences d’ADN du VHB conservées flanquant le site attendu des jonctions d’intégration de l’ADN du VHB. D’autres séquences d’amorces et protocoles ont été décrites pour déterminer la séquence génomique du VHB44,45,46,47,48 et peuvent fonctionner avec succès.
En outre, les différentes cellules VHB-sensibles (par exemple, les cellules hépatocytes humains primaires, HepaRG différenciée, HepG2-NTCP) peuvent être utilisés ; Cependant, nous avons constaté que les cellules Huh7-NTCP fournissent le plus grand ratio signal-bruit, si l'on considère le nombre de virus-cellules jonctions de l’ADN qui sont amplifiées par rapport à l’ADN de virus intermédiaire qui est amplifié13. En particulier, les cellules en phase terminale différenciées comme des hépatocytes humains primaires ou HepaRG différenciée ne subissent pas efficacement la mitose, ce qui entraîne un niveau élevé d’amplifiables intermédiaires réplicatifs de l’ADN du VHB restant dans les cellules. Nous avons trouvé qu’environ 90 % des séquences amplifiées représentent réarrangements de l’ADN du VHB (et non pas des événements de l’intégration) dans les cellules en phase terminale dissociés, comparativement à 70 – 50 % dans les cellules d’hépatome, lignes13. Ces produits sont généralement les génomes de l’ADN du VHB contenant de grandes destructions dans la surface et les principaux cadres de lecture ouvert, ou ils peuvent représenter des espèces quasi VHB avec un supplémentaires Nco, j’ai du site avant la Sphje site. L’amplification de ces espèces de VHB (y compris un diagramme schématique) ont été décrites en détail auparavant13.
Il y a plusieurs inconvénients à cette méthode. En raison de la nature laborieuse et plusieurs jour de ce protocole, invPCR n’est pas adapté à des analyses de haut débit d’un grand nombre d’échantillons. En outre, qu’elle repose sur une titration de la dilution, notre méthode n’est pas très précis dans la quantification ; Bien que, il devrait mesurer facilement les changements du niveau de journal dans la fréquence d’intégration.
En outre, notre protocole d’inversion est uniquement adapté pour détecter les intégrations entre la région de DR2 et DR1 du génome du VHB, comme la plupart des intégrations de VHB ont lieu au sein de cette région49. L’analyse des tissus du patient VHB NGS a montré qu’une importante minorité (jusqu'à environ 50 %) peut également se produire en dehors de cette région49. Nouvelles conceptions d’invPCR sont théoriquement capables de détecter ces autres sites d’intégration, mais ils ont pas (à notre connaissance) été encore faite. À ce propos, en raison des sites de l’enzyme de restriction nécessaire requis en aval de la séquence de jonction de virus-cellule pour la réaction d’inversion, invPCR ne détecte pas tous les intégrations survenant dans les régions de DR2 et DR1 du génome du VHB (c.-à-d., nous On estime qu’environ 10 % de toutes les intégrations y détectables à l’aide de silico des simulations13). Toutefois, lorsqu’il est appliqué à un lot de concentré d’échantillons avec un petit nombre de différents traitements, invPCR est l’une des méthodes seulement pratiques pour détecter l’ADN du VHB intégré à une seule résolution de paires de bases.
Nous envisageons donc les applications de cette méthode qui dessert un rôle clé dans la recherche virale (via les mutations de l’inoculum de VHB), cellulaire (par le biais de masquage ou la surexpression des gènes cellulaires spécifiques, ou par application de diverses drogues) et environnementaux ( par exemple, exposition à un stress oxydatif) facteurs qui induisent l’intégration de l’ADN du VHB. Avec cette méthode et les systèmes d’infection VHB nouvellement développés, nous permettent un contrôle sans précédent de ces facteurs afin qu’ils puissent être bien isolées et mieux caractérisés. Nous espérons également que cela conduira à une compréhension clée des conséquences cellulaires de l’intégration de l’ADN du VHB, y compris quels antigènes viraux de la mesure (p. ex., HBx ou HBsAg50) sont exprimées dans l’écran intégré, ce qui contrôle cette expression, et si oui ou non l’intégration VHB modifie considérablement le phénotype cellulaire vers un État plus pro-oncogéniques. Les résultats de ces études à venir auront un impact profond sur les stratégies thérapeutiques utilisés pour traiter l’hépatite B chronique et sur la compréhension de base du virus lui-même.

VHB est un virus à ADN double brin qui peut provoquer une infection chronique permanente, conduisant à une cirrhose du foie et hepatocellular carcinoma (HCC)1,2,3. Bien qu’il existe plusieurs mécanismes moléculaires conduisant VHB persistance4 (par exemple, de forte stabilité du modèle transcriptionnelle épigénétique virale), fraude à la surveillance immunitaire et faible chiffre d’affaires des hepatocytes dans le foie et ses associés risque de CHC initiation5,6 (p. ex., une inflammation chronique et l’activation de systèmes cellulaires insister sur les voies), intégration de l’ADN du VHB dans le génome de cellules de l’hôte (un mécanisme signalé pour les deux de ces phénomènes) a été mal étudiée . Des principales raisons sont le manque d’adapté en vitro infection des systèmes pour le VHB qui permettent une détection fiable des événements de l’intégration. Nous décrivons ici un protocole mis au point récemment pour in vitro génération et détection des intégrations de l’ADN du VHB pouvant servir à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents et les conséquences qui en découlent.
Réplication du VHB et la formation d’intégration de l’ADN du VHB a été précédemment examinée en détail7. Brièvement, VHB dans les hépatocytes en utilisant le Peptide de Co-transporting pour le Taurocholate de Sodium (NTCP) comme le principal récepteur cellulaire pour infection8,9. Les nucléocapsides VHB contenant l’ADN circulaire VHB-détendu (rcDNA) génome pénètre dans le noyau, où le rcDNA est converti en épisomiques ADN circulaire fermé de façon covalente (cccDNA). Le nucléaire cccDNA agit comme le modèle transcriptionnel ARNm viraux et pré genomic RNA (Pan-RPGAA)10. Pan-RPGAA et la polymérase du VHB sont ensuite compressés dans les nucléocapsides nouvellement formé (composés de dimères de protéine core VHB). Pan-RPGAA VHB est inverse-retranscrit dans la nucléocapside, entraînant soit un génome de rcDNA soit un double brin linéaire ADN (dslDNA) génome11,12. Ces matures nucléocapsides contenant les génomes de l’ADN du VHB sont enfin enveloppés et exportées comme des virions.
Infection des hépatocytes par des particules enveloppés, contenant des molécules de dslDNA peut entraîner une intégration virale dans l’hôte cellule génome13, conduisant à des formes de réplique-incompétents de l’ADN du VHB7,14,15. Intégration de l’ADN du VHB se produit sur le site de chromosomiques bicaténaire ADN pauses15. Accumulation de preuves suggère que chaque événement d’intégration se trouve dans une position essentiellement aléatoire au sein de la cellule hôte génome16,17. En outre, l’intégration de l’ADN du VHB apparaît quelque peu rarement, à un taux de 1 pour 104 cellules13,18,19,20. Des questions importantes au sujet de l’intégration de l’ADN du VHB restent sans réponses, notamment en matière exactes voies moléculaires impliquées, la dépendance sur virale et facteurs de l’hôte, les antigènes viraux exprimées à partir de formulaires intégrés et leur éventuelle contribution 7de persistance virale. Nous avons mis en place un modèle in vitro de faire la lumière sur certaines de ces questions.
La rareté des événements de l’intégration d’ADN-VHB (à la fois en ce qui concerne les taux d’intégration par cellule et pour le nombre de copies de chaque intégration unique) dans in vitro du VHB modèles font eux difficile à détecter. Mitose de la cellule est limitée dans notre système in vitro , comme la Division des cellules ne supportent pas l’infection efficace. Ainsi, contrairement à dans les tissus du foie du patient où importante expansion clonale des hépatocytes produit18,19,,20, très que peu d’exemplaires (1 ou 2) chaque intégration est présents dans un pool donné des cellules infectées en vitro . Nous avons aussi trouvé que l’intégration se produit principalement au cours de l' infection initiale des hépatocytes (et pas en permanence dans les hépatocytes infectés chroniquement)13. En conséquence, l’intégration de l’ADN du VHB ne peut être augmentée en cultivant simplement les cellules pour une plus longue période.
En général, les méthodes précédemment utilisées pour détecter l’ADN du VHB intégrée, y compris du Sud blot hybridation21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , ligature cassette-mediated PCR28et29,30,31,32,33, le séquençage du génome n’ont pas la sensibilité pour détecter les Single-copies d’intégrations. Autres chercheurs et nous avons utilisé inverse nested PCR (invPCR) pour détecter les déterminer DNA integration de canard, marmotte et foies infectés humaine13,14,18,19, 34,35,,36. D’autres ont introduit des modifications procédurales à la technique d’invPCR qui peuvent altérer la génération de signaux de faux-positifs et restreindre la possibilité pour la quantification,37. Si le dosage est effectué comme décrit dans le présent protocole, invPCR représente un test spécifique et sensible qui identifie et quantifie (en nombre de copies absolue) plusieurs intégrations de l’ADN du VHB. La jonction de l’ADN du VHB-cellule est séquencée à une résolution de base unique paire, permettant des études bioinformatical de virale et des séquences d’ADN de l’hôte sur les sites d’intégration13.
Nous avons déjà décrit38 résultats d’invPCR sur les tissus infectés par l’ADN du VHB extraites d’un large éventail de sources, notamment des tissus du foie congelé clin d’oeil, paraffine foie sections et des échantillons de tissus extrêmement petit isolés par microdissection laser19. Ce protocole décrit une version mise à jour d’un test d’invPCR en utilisant l’ADN extraite des cellules dérivées de la culture tissus après infection in vitro , dans lequel le nombre de copies basse d’intégrations (1 – 2 copies par intégration) est généré. L’ADN du VHB intégrations formées in vitro ressemblent à ceux trouvés dans les tissus du patient en ce qui concerne leur répartition sur le génome cellulaire et la jonction dans la séquence virale est intégré13,16, ce qui suggère une voie comparable à dans un foie infecté.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Milieu DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de veau</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Inactivation thermique avant utilisation</td></tr><tr><td>Pénicilline, 10 000 U/mL ; Streptomycine 10mg/ml, 100&fois ;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, 0,5 mg/mL ; EDTA, 0,22 mg/mL, 1& fois ;</td><td>PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>PEG, MW 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td>Stock à 40 % p/v dans 1xPBS, autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>DMSO pour la spectroscopie</td><td>Merck</td><td>102950</td><td></td></tr><tr><td>Tenofovir disoproxil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS021622</td><td>Dissoudre dans le DMSO</td></tr><tr><td>Lamivudine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1295</td><td>Dissoudre dans le DMSO</td></tr><tr><td>NucleoSpin Kit de tissus</td><td>Macherey Nagel</td><td>740952.250</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotomètre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193L</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>433209</tr><tr><td>Dextran (35-45 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1662-10G</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol Absolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>BsiHKAI</td><td>NEB</td><td>R0570L</td><td></td></tr><tr><td>SphI-HF</td><td>NEB</td><td>R3182L</td><td></td></tr><tr><td>Amplitaq Gold Taq kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331816</td><td>Utilisation pour la première fois nest PCR</td></tr><tr><td>Tapis d’étanchéité en silicone pour plaques PCR à 96 puits</td><td>Biorad</td><td>2239442</td><td></td></tr><tr><td>DNAZap PCR Solution de dégradation de l’ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>Plaques PCR à 96 puits</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS6509 Réplicateur SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>à 96 broches</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Flexi Kit PCR</td><td>Promega</td><td>M8295</td><td>À utiliser pour la PCR du deuxième nid, utilisez un tampon vert pour faciliter le chargement du gel d’agarose</td></tr><tr><td>Biozym LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Kit d’extraction de gel</td><td>QIAGEN</td><td>20051</td><td></td></tr></tbody></table>

détection de faibles copies numéro adn viral intégré formé par in vitro l’infection par l’hépatite b

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Virus de l’hépatite B (VHB) est un pathogène commun véhiculés par le sang, provoquant le cancer du foie et cirrhose du foie, résultant d’une infection chronique. Le virus se réplique généralement à travers un épisomiques ADN intermédiaire ; Cependant, intégration des fragments d’ADN du VHB dans le génome de l’hôte a été observée, même si ce formulaire n’est pas nécessaire à la réplication virale. Le but exact, le calendrier et le mécanisme par lequel l’ADN du VHB intégration se produit n’est pas encore claires, mais de récentes données montrent qu’il se produit très tôt après l’infection. Ici, l’in vitro de génération et la détection des intégrations de l’ADN du VHB sont décrites en détail. Notre protocole spécifiquement amplifie les copies uniques d’intégrations de l’ADN de virus-cellules et permet la quantification absolue et la résolution de base unique paire de la séquence de jonction. Cette technique a été appliquée à divers types de cellules sensibles à VHB (y compris les hépatocytes humains primaires), aux divers mutants VHB et en collaboration avec diverses expositions de drogue. Nous prévoyons cette technique devient un test clé pour déterminer les mécanismes moléculaires sous-jacents de ce phénomène cliniquement pertinent.

Une représentation schématique de la technique d’invPCR est illustrée à la Figure 1. Un exemple gel d’agarose d’une invPCR réussie est montré dans la Figure 2 avant et après l’isolement du produit PCR. La figure 3 montre la sortie d’analyse BLAST de l’étape 5.1 dans le cas de (i) amplification de jonction de l’ADN de virus-cellules et (ii) l’amplification d’un intermédiaire réplicatif de l’ADN du VHB.
Les résultats de contrôles positifs escomptés : cellules NTCP-Huh7 infectées par héparine purifié des stocks de VHB, tel que décrit ci-dessus (Figure 1) peuvent servir de témoin positif. Dans ce cas, seul produits PCR devraient être atteints par la dilution de 1:3 de deuxième ou troisième de chaque échantillon (correspondant à environ 104 cellule équivalents par dilution, Figure 2). À ces dilutions, environ 50 % des produits représentera des jonctions de vrai virus-cellule de l’ADN, tandis que l’autre moitié représente l’amplification d’ADN de HBV intermédiaires (Figure 3).
Dans les précédentes études13, nous avons trouvé peu de cas des jonctions de virus-cellules répétées, suggérant sans sites génomiques cellulaires d’intégration de l’ADN du VHB préférentielle. Nous trouvons aussi que &gt;80 % des jonctions de virus-cellules produisent entre nucléotides 1732 et 1832 (selon le nucléotide numérotation du génotype VHB D, GenBank Accession #U95551.1), où ce dernier représente l’extrémité droite de la forme de dslDNA du VHB. Séquences de jonctions de vrai virus-cellule trouvées par le biais de notre méthode dans des expériences in vitro sont publiquement disponibles sur GenBank (numéros MH057851 à MH058006).
Résultats de contrôles négatifs attendus : non infectés cellules Huh7-NTCP ou inoculés Huh7-NTCP cellules pré-traitées avec Myrcludex B peuvent agir comme témoins négatifs. InvPCR analyse de l’ADN extrait de ces cellules ne doit produire aucun produit PCR. Ces échantillons de contrôle négatif en cours d’exécution sur la même plaque PCR comme échantillons positifs permet de tester de contamination croisée au cours du processus-PCR nichée. Le critère plus rigoureux de contamination croisée est le fonctionnement d’un échantillon de contrôle négatif dans les puits A-D et l’échantillon positif dans les puits E-H sur une plaque à 96 puits. Dans ce cas, la plus concentrée dilution de l’échantillon positif est exécutée dans une ligne directement adjacente à la moins concentrée dilution de l’échantillon négatif. Si les produits d’amplification sont observés dans des échantillons de contrôle négatif, instaurer les mesures proposées dans la discussion pour minimiser la contamination croisée des événements.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> Figure 1 : figure schématique du processus visant à détecter des intégrations de l’ADN du VHB invPCR. Après infection par le VHB, seule une minorité de cellules Huh7-NTCP contenir VHB dslDNA (rouge) intégré dans le génome de la cellule hôte (rouge), représenté dans la partie supérieure. L’ADN total est ensuite extrait des cellules (étape 1), inversé (étape 2) et amplifié par PCR nichée (étape 3). Montrés sont les positions relatives des sites de restriction enzymatique (NcoI et BsiHKAI) à la jonction de l’ADN virus-cellule excisés. La figure est une adaptation d’une précédente publication13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> Figure 2 : Agarose gel d’électrophorèse et extraction gel ultérieur d’un succès invPCR. « M » représente échelle de marqueur d’ADN. Chaque rangée de 12 représente des réplicats techniques à une seule dilution sur la plaque de la PCR. Deux échantillons d’ADN inversés peuvent être exécutés par gel de plaque / d’agarose PCR. Les produits PCR pour chaque dilution doivent titrer dehors dans un 1 ~ : ratio 3. Extraction des produits de deux dilutions moins concentrées où les bandes individuelles peuvent être facilement isolés est généralement suffisante, comme le taux d’intégration de l’ADN du VHB est déterminée par titration à l’extrémité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> Figure 3 : analyse BLAST de séquences de produit invPCR. Comme les longues étendues de séquence sont générés à partir de Sanger sequencing, la source des séquences d’ADN sont généralement sans équivoque. Alignement fort à VHB et génomes cellulaires est observé dans différentes zones du fichier séquence FASTA générés par Sanger sequencing dans le panneau supérieur, ce qui suggère une jonction d’ADN de vrai virus-cellule. Dans le panneau de fond, la séquence s’aligne seulement sur des fragments du génome du VHB, suggérant un produit généré par l’amplification d’un génome d’ADN du VHB réarrangé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous décrivons ici la production in vitro de l’ADN du VHB via un système d’infection de virus de l’hépatite B et la détection très sensible de son intégration (1 – 2 copies) à l’aide d’inverse nested PCR.

Détection de faibles copies numéro ADN Viral intégré formé par In Vitro l’infection par l’hépatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés de la virologie de l’hépatite B, comme la recherche de facteurs cellulaires ou virologiques qui influent sur l’intégration de l’ADN du VPH. Cette technique présente de multiples avantages. Il est relativement bon marché, et facile à effectuer, l’analyse des résultats est simple, et il est très sensible, jusqu’à des copies simples.Bien que cette méthode puisse être utilisée pour donner un aperçu de l’intégration du VHB, elle peut également être utilisée pour d’autres virus qui s’intègrent dans le génome des cellules hôtes, comme le VIH, le HTLV-1 ou le VPH. Pour infecter les cellules, grainez 200 000 cellules par millilitre dans une plaque de douze puits, avec 1 millilitre de D-mem. Le lendemain, utilisez la colonne d’héparine purifiée su-per-na-din de HEP-AD 38 comme inoculant pour infecter les cellules à 1000 VGE par cellule, dans 500 microlitres de milieu culturel.Ensuite, la culture des cellules à 37 degrés Celsius. Puis, le lendemain, laver les cellules deux fois avec un millilitre de stérile une fois PBS. Ensuite, remplacez le milieu de culture tous les 2 jours, jusqu’à la récolte.Au jour 3 après l’infection, traiter les cellules avec 5 micromolaires ténofovir disoproxil et 10 micromolaire Lamivudine pour limiter la production d’intermédiaires réplicateurs HBV qui sont amplifiés en mesure par PCR inverse. Au jour 5, après l’infection, trypsiniser certaines cellules avec 200 microlitres de Trypsin EDTA et les suspendre en 2 millilitres de D-mem contenant 5 micromolaires Tenofovir disoproxil et 10 micromolar Lamivudine. Par la suite, transférer les suspensions cellulaires à une plaque de six puits, pour induire une ronde de mitose.Au jour 7 après l’infection, trypsiniser les cellules élargies dans 400 microlitres de Trypsin EDTA et suspendre le mélange en 1 millileter de D-mem. Ensuite, transférez la suspension dans un tube de 1,5 millilitre. Pelleter les cellules par centrifugation à 500 fois G, pendant cinq minutes.Et enlever le Su-per-na-din par aspiration. Extraire l’ADN de la pastille cellulaire à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN, selon les instructions du fabricant. Pour l’inversion de l’ADN, allouer 1,5 à 2,5 microgrammes de l’extrait total d’ADN dans un tube PCR de 200 microlitres.Ensuite, ajoutez la quantité appropriée de mélange principal d’enzyme de restriction pour avoir comme conséquence un microlitre de volume de réaction de 40, contenant 1 fois le tampon de réaction de digestion et 10 unités NCO-1HF. Incuber la réaction enzymatique de restriction dans une machine de PCR à 37 degrés Celsius pendant une heure, pour l’efficacité optimale de digestion. Ensuite, inactivez l’enzyme de restriction en l’incubant à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes.Transférer toute la réaction enzymatique de restriction à un tube de 1,5 millilitre. Par la suite, ajouter 400 microlitres de 1 fois tampon de ligase d’ADN T4 et 500 unités de ligase d’ADN T4, et mélanger soigneusement. Le grand volume de réaction encourage la ligature intramoléculaire des fragments digérés d’ADN.Incuber la réaction de ligature à température ambiante pendant 2 heures pour assurer une ligature complète. Après 2 heures, inactivez la ligase d’ADN T4 à 70 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajouter ensuite 10 microlitres de 10 Sulfate de Dodedecyl de sodium pour assurer l’inactivation complète de la ligase T4.Ajouter le chlorure de sodium à une concentration finale de 100 millimolaires et de Dextran à une concentration finale de 90 microgrammes par millilitre. Mélanger par vortex d’impulsion, et tourner brièvement vers le bas le mélange de réaction. Ensuite, ajoutez 900 microlitres de 100 éthanol et mélangez par inversion.Précipitez l’ADN à 20 degrés Celsius négatifs pendant la nuit. Et pelleter l’ADN précipité par centrifugation à 14000 fois G pendant 15 minutes. Ensuite, retirez le Su-per-na-dine par aspiration.Laver la pastille avec 500 microlitres de 70 éthanol. Et centrifugation à 14000 fois G pendant 15 minutes. Ensuite, retirez l’éthanol par aspiration et séchez l’ADN à température ambiante pendant 20 minutes.Dissoudre la pastille dans 20 microlitres d’eau et ajouter 20 microlitres de mélange maître enzyme limite pour entraîner un volume de réaction de 40 microlitres, contenant 1 fois tampon de réaction de digestion, 5 unités BSIHK-1, et 5 unités de SPH-1HF. Nid, incuber la réaction enzymatique de restriction dans un bloc de chaleur à 37 degrés Celsius, pendant 1 heure. Tournez brièvement vers le bas le mélange de réaction, couver la réaction enzymatique de restriction dans un bloc de chaleur à 65 degrés Celsius pendant 1 heure.Dans cette procédure, retirez les amplicons potentiels d’un joint réutilisable de tapis de silicium, à l’aide d’une solution de dégradation de l’ADN. Rincez soigneusement le tapis avec de l’eau libre d’ADN et séchez-le à température ambiante. Ensuite, préparez un millileter de 1 fois le mélange PCR contenant les amorces extérieures avant et arrière à une concentration de 0,5 micromolaire.Ajouter 170 microlitres si le mélange 1 fois PCR aux puits A-1 et E-1, dans une plaque PCR 96 bien. Ensuite, ajoutez 120 microlitres du mélange 1 fois PCR aux puits B-1 et H-1. Par la suite, ajouter 10 microlitres de l’ADN inversé aux puits A-1 et E-1.Mélanger la réaction dans chaque puits, en pipetting doucement chacun, environ 10 fois à l’aide d’un P-1000 réglé à 100 microlitres. Diluer périodiquement les échantillons des puits A-1 à D-1, à un rapport de 1:3 en transférant 60 microlitres à chaque étape. Mélangez les puits à chaque étape en les pipetting doucement environ 10 fois à l’aide d’un P-1000 réglé à 100 microlitres.Évitez de former des bulles, répétez la procédure pour bien E-1, diluant vers le bas au puits H-1. Par la suite, allouer 10 microlitres du mélange de réaction, à l’aide de pipette multicanal, de Wells A-1, H-1, dans les puits A-2, H2, A-3, H-3 et ainsi de suite, jusqu’à atteindre les puits A-12, H-12 de la plaque de puits 96. Couvrir la plaque PCR d’un tapis de silicium sec et presser fermement.Ensuite, placez la plaque dans une machine PCR, et exécutez le programme indiqué, avant de transférer la plaque à température ambiante. Ensuite, chauffer les broches d’un réplicateur de 96 broches à rouge-chaud avec un brûleur Bunsen, puis refroidir pendant au moins 5 minutes à température ambiante. Remplissez les puits d’une deuxième plaque PCR de 10 microlitres de 1 fois le mélange PCR, contenant un tampon prêt pour la charge de gel, et l’avant intérieur et l’inverse à 0,5 micromolaire.Retirez soigneusement le tapis de silicium de la plaque PCR de la plaque de puits 96 du PCR premier tour et évitez la contamination croisée entre les puits. Utilisez le réplicateur refroidi pour transférer les produits PCR de la plaque de puits 96, du PCR de premier tour, à la plaque de puits nouvellement allouée 96. Effectuer le PCR imbriqué, en utilisant la condition comme indiqué.Pour isoler les produits PCR, analysez-les par électrophorèse gel, à l’aide d’une plaque de puits 96, avec 1,3 gel Agarose. Pour un gel Agarose de 100 millilitres, courir à 200 volts pendant 10 à 15 minutes. Par la suite, exciser les bandes d’ADN des gels Agarose, à l’aide de pailles jetables à boire.Pour chaque produit PCR, placez la paille et le bouchon de gel Agarose dans un tube de 1,5 millilitre, coupez la paille en taille avec des ciseaux. Par la suite, éjecter les bouchons d’Agarose dans chaque tube, en pressant à l’extrémité du fragment de paille. Ajouter ensuite 300 microlitres de tampon d’extraction de gel, et 5 microlitres de perles de verre d’extraction de gel à chaque tube.Extraire les produits PCR par fabricant des instructions pour le kit d’extraction de gel, et diluer l’ADN des perles avec 30 microlitres d’eau. Soumettez l’ADN purifié pour le séquençage Sanger, avec l’amorce avant utilisée dans le PCR imbriqué du deuxième tour. Un exemple agarose gel électrophoresis de PCR inverse réussi, avant et après l’isolement du produit PCR, est montré ici.M représente le marqueur d’ADN dernier, chaque ligne de 12 représente les répliques techniques à une dilution unique sur la plaque PCR. Dans ce cas, les produits PCR simples doivent être atteints par la deuxième ou la troisième dilution 1:3 de chaque échantillon. À ces dilutions, environ 50 % des produits représenteront de véritables jonctions d’ADN de cellules virales.Tandis que l’autre moitié représente l’amplification des intermédiaires d’ADN de HBV. Cette technique a permis aux chercheurs d’explorer l’intégration de l’ADN du VPH dans des systèmes d’infection in vitro hautement contrôlés. D’autres méthodes, telles que l’analyse biothématique, peuvent être utilisées pour répondre à d’autres questions.Par exemple, si l’intégration de l’ADN du VPH se produit dans des régions spécifiques du génome cellulaire. N’oubliez pas que le travail avec le virus de l’hépatite B peut être dangereux et des contrôles appropriés des infections, tels que les armoires de biosécurité et la vaccination préalable, doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

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