Microponction de l’espace de Bowman chez les souris facilitée par 2 Photon Microscopy

Cette technique peut aider à répondre aux questions clés sur la physiologie mono-néphron, y compris les taux de filtration glomerular des protéines systémiques et des métabolites et leurs contributions à la physiologie tubulaire. Le principal avantage de cette technique de micropuncture est qu’elle permet l’accès à l’espace de Bowman et au néphron cortical chez toutes les souris. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auraient du mal parce qu’elle nécessite des étapes de préparation correctement exécutées.

Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds, appliquez de l’onguent sur les yeux et utilisez du ruban adhésif pour immobiliser les extrémités d’une souris adulte de 20 à 25 grammes. Utilisez une crème depilatory pour enlever tous les cheveux sur le côté gauche de l’animal, et utilisez la rate pour localiser le rein gauche à travers la peau sur le côté dorsal et caudal de la rate. Faire une incision de 0,5 centimètre dans la peau, suivie d’une incision plus petite dans le péritoine juste assez grand pour que le rein soit poussé à travers.

Extrudez le rein avec une pression douce et placez une forme de stabilisateur de rein en polysiloxane autour du tissu. Tapisser le rein avec l’espaceur de telle sorte que la surface latérale du rein s’étend au-delà du stabilisateur d’environ un millimètre, et fixer le rein à la forme avec adhésif cyanoacrylate. Collez une plaque de tête à la forme stabilisateur et montez la plaque de tête aux barres de montage sur la plaque de base.

Ensuite, remplissez le puits dans le support en polysiloxane avec une solution d’agarose pour cent et maintenez un glissement de couverture de 10 millimètres sur le dessus de la forme jusqu’à ce que l’agarose soit ferme. Sceller le bordereau de couverture à la plaque de tête avec de la colle et de créer un anneau autour de la feuille de couverture avec du ciment dentaire. Injectez ensuite de 100 à 150 microlitres de FITC-Dextran rétro-orbitalement et déplacez rapidement la souris et la plaque de fixation au stade du microscope à deux photons.

Après s’être concentré manuellement sur la surface rénale, passez au mode deux photons non scannant et explorez la fenêtre d’imagerie pour localiser un glomerulus cible qui est supérieur à 30 micromètres sous le glissement de couverture et à moins de 400 micromètres de la capsule rénale latérale. Enregistrez la distance latérale et verticale jusqu’au glomerulus cible. Enregistrez ensuite les coordonnées de scène x, y et z pour les glomerulus.

Et enfin, soulevez le point focal objectif d’environ un millimètre dans la colonne d’eau sans changer les coordonnées x et y étape. Conduisez la pointe pipette dans la colonne d’eau et allumez l’excitation DAPI. Déplacez la pipette dans les dimensions x et y jusqu’à la fluorescence maximale de la pointe.

Ce sera le centre de l’objectif. Changez le réglage x citation en protéine fluorescente rouge et visualisez la pipette avec la oculaire pour permettre un centrage précis dans la vue oculaire. Revenez à deux photons pour trouver la pipette sous la vue en direct à deux photons et placer la pointe précisément au centre de l’image, c’est la position d’enregistrement.

Enregistrez ensuite une image de la pipette et enregistrez la scène et les coordonnées du contrôleur de micropipette. Retirez la pipette de la colonne d’eau dans l’axe x sans déplacer l’axe y et z et déplacez la pipette z vers la cible glomerulus z-coordinate et le bord du rein. Notez l’étape x et calculez la pipette de bord de rein x en utilisant le décalage de l’étape d’enregistrement x.

Augmentez le stade x pour déplacer la scène vers la pipette jusqu’à ce que le bord du rein soit loin à gauche de l’écran, tout en restant visible. Avancez rapidement la pipette à environ 100 micromètres loin de la pipette de bord de rein X vient de calculer. Augmentez le gain rouge et commencez à avancer la pointe de pipette lentement au bord de rein sous l’imagerie en direct de deux photons tout en surveillant l’histogramme rouge de pixel.

Conduisez la pipette dans l’axe x lentement jusqu’à la pipette cible glomerulus x, en gardant un œil sur la scène x. En atteignant le glomerulus, documentez la position avec un z-stack. Avec la pipette en position, réglez la micropumpe pour injecter 100 nanolitres de perfluorodecaline sur deux minutes.

Assurer la patency de la pipette, et pour réduire la confusion du branchement de pipette pendant l’entrée. Après quatre à six minutes de filtration, réglez la micropumpe pour aspirer jusqu’à 300 nanolitres à une vitesse de jusqu’à 50 nanolitres par minute. Cette belle glomerulus proche de la surface démontre une imagerie favorable due à la position de surface du glomerulus à 20 micromètres au-dessous de la capsule rénale.

Le glomerulus est trop près de la surface pour la microinjection cependant, comme la pipette frapperait le glissement de couverture. Ces glomeruli sont positionnés de manière optimale avec les bords latéraux 250 micromètres à droite et semblent moins tranchants en raison de la réfraction causée par leur profondeur de 70 micromètres de la capsule. Les deux facteurs qui rendent le glomeruli accessible.

Dans cette image d’entrée rénale typique, une projection d’intensité moyenne à partir d’une pile z avec vue orthogonale révèle la pointe pipette dans l’espace de Bowman, notez l’artefact spectral pointe pipette rouge de la fluorescence extrêmement brillante des points quantiques disposés sur la section conique de la pointe. Ici, un rendu de volume à partir d’une pile z acquise après avoir positionnement d’une pipette dans l’espace de Bowman, montre la pointe pipette dans l’espace attenant à la touffe capillaire. Si une pipette avec une ouverture trop grande est utilisée, la capsule rénale peut se briser causant des saignements subcapsulaires et l’entrée du sang dans le lumen pipette.

En utilisant cette méthode, 17 protéines, principalement de faible poids moléculaire, ont été identifiées à partir d’un minimum de deux peptides uniques par protéine. Couplé avec cette méthode, d’autres méthodes telles que la maspectroscopy, les mesures sensibles d’électrode ion, et l’injection fluorescente d’anticorps peuvent être employées pour répondre aux questions au sujet du rôle des solutés luminaux dans la physiologie tubulaire et glomérique.