Name: Un modèle de Culture tissulaire d’oestrogène-production primaire Bovine Granulosa cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Découvrez un modèle de culture tissulaire de cellules de granulosa bovines productrices d'œstrogènes. Cette méthode par cryopréservation permet d'étudier la physiologie cellulaire et la régulation hormonale sans dépendance au tissu frais.

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Nous remercions Veronica Schreiter pour son excellente assistance technique et les modifications utiles du modèle de culture technique et cellule cryoconservation établies. En outre, nous aimerions remercier Maren Anders et Swanhild Rodewald pour leur excellente assistance technique dans l’analyse qui suit.

Remarque : Les ovaires Bovine ont été obtenues dans un abattoir commercial. La collecte des sous-produits de l’abattoir n’exige pas une approbation éthique selon le droit allemand.
1. Conditions de travail et préparations
<ol><li>Afin de garantir la stérilité, effectuer tous les supports et préparation du tissu, mais aussi toute la culture travaille dans un laboratoire de culture de cellules spécialisées à l’aide d’un banc de flux laminaire.</li>
	<li>Préparer 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4), additionnée de 100 UI de pénicilline, 0,1 mg/mL de streptomycine et 0,5 µg/µL amphotéricine pour le transport des ovaires. Remarque : La durée maximale entre la réception des ovaires et isoler le GC est de 2 h dans ce set-up.</li>
</ol>2. isolement des cellules de la Granulosa Bovine
<ol><li>
Laver les ovaires plusieurs fois dans du PBS 1 x (avec 100 UI de pénicilline, 0,1 mg/mL de streptomycine et 0,5 µg/µL amphotéricine) pour enlever le sang de la surface avant de commencer la procédure d’isolement. Utiliser un bécher, placer les ovaires à l’intérieur, remplissez-le avec du PBS 1 x et jeter les PBS à nouveau.
	<ol>
<li>Répétez cette étape de lavage 3 – 4 x, jusqu'à ce que les ovaires sont nettoyés de tout sang restant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Essuyer un ovaire utilisant un laboratoire imbibé d’alcool à 70 %, afin de minimiser les contaminations possibles.</li>
	<li>Avec une seringue de 3 mL et une aiguille 18 G, aspirer la GC par ponction des follicules de taille petite à moyenne (< 6 mm, mesuré avec une règle) et mettre en commun le liquide folliculaire dans un tube à centrifuger 50 mL. Remarque : Pour humidifier la seringue, prendre une petite quantité de PBS 1 x (avec 100 UI la pénicilline, 0,1 mg/mL de streptomycine et 0,5 µg/µL amphotéricine). Cela aide à percevoir de petits montants de liquide folliculaire et empêche les cellules de s’en tenir à l’intérieur de la seringue.</li>
	<li>Après perforation de plusieurs follicules, rincer la seringue et l’aiguille avec 1 x PBS pour le nettoyage intermédiaire.</li>
</ol>3. la cryoconservation des cellules
<ol><li>
Utiliser une coloration bleu trypan et compter les cellules sous un hémocytomètre.
	<ol>
<li>Pour compter le nombre de cellules viables, préparer un tube avec 1,5 µL d’une solution de bleu de trypan de 0,25 %. Remarque : Les cellules vivantes restera sans tache parce que le bleu trypan ne peut accéder à la barrière cellulaire des cellules mortes, qui apparaissent alors en bleu.</li>
		<li>Ajoutez 15 µL de la suspension de cellules de la granulosa à la solution de bleu de trypan et mélanger doucement.</li>
		<li>Placer le mélange dans les deux chambres un hémocytomètre. Compter le nombre de vie (p. ex., non souillées enregistré) de cellules dans une grande place par chambre. Remarque : Bien que certaines cellules sanguines peut être vu, ils se distingués par leur très petite taille.</li>
		<li>Calculer le nombre de cellules vivantes avec la moyenne des deux carrés de chambre selon les orientations générales ; la proportion de cellules vivantes peut varier entre ovaires mais devrait dépasser 60 %13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prélever un échantillon provenant du pool de cellules de granulosa fraîchement isolées comme une référence pour une analyse ultérieure.
	<ol>
<li>Selon le nombre d’éléments du CG isolé, mis de côté un nombre adéquat de cellules sous forme d’échantillons de référence pour ARN, ADN ou préparation de protéine. Remarque : Pour l’ARN et l’évaluation ultérieure de l’expression génique, 1 x 105 cellules sont suffisantes, alors que d’autres analyses subséquentes peuvent nécessiter le nombre de cellules différentes, généralement plus élevés.</li>
		<li>Placez une ou plusieurs parties aliquotes des cellules de référence dans un nouveau tube et il Centrifuger pendant 1 min à température ambiante et la vitesse maximale (12 000 x g) pour obtenir un culot cellulaire. Jeter le surnageant.</li>
		<li>Immédiatement-congélation des échantillons dans l’azote liquide. Conserver l’échantillon à-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Effectuer la cryoconservation comme suit.
	<ol>
<li>Préparer le milieu de congélation à l’aide de 80 % de sérum de veau foetal (FCS) et 20 % de diméthyl sulfoxide (DMSO).</li>
		<li>Pour doucement à pellets le GC, centrifuger le GC pendant 3 min à température ambiante et 500 x g.</li>
		<li>Retirez le surnageant soigneusement et doucement remettre les cellules en suspension dans 100 % FCS (p. ex., 1 mL) jusqu'à ce qu’aucune cellule plus massifs sont visibles.</li>
		<li>Ajouter 1 volume (p. ex., 1 mL) du médium gel préparé à la suspension cellulaire et transférer le mélange dans un flacon cryogénique. Remarque : La concentration finale des médias cryo-protection sera 90 % FCS et 10 % DMSO.</li>
		<li>Placez la cuvette cryogénique dans un conteneur de congélation (disponible dans le commerce) spécialisé qui empêche la congélation rapide. Le taux de refroidissement des échantillons ne doit pas dépasser-1 ° C/min. transfert du conteneur congélation dans un congélateur-80 ° C pendant au moins 4 h.</li>
		<li>Pour une conservation plus longue, placez les coupes cryogéniques dans les conteneurs d’ultra basse température (par exemple, conteneurs d’azote liquide phase). Remarque : Le protocole peut être arrêté ici, car la cryoconservation permet une conservation plus longue.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. préparation des supports et plaques de Culture pour la Culture cellulaire
<ol><li>
Enduire les plaques de culture cellulaire avec 0,02 % collagène R. Remarque : Le collagène R est connu pour être indispensable pour une meilleure saisie des GC dans la culture.<ol>
<li>Préparer une solution de R de collagène de 0,02 % à l’eau purifiée pour culture cellulaire.</li>
		<li>Ajouter 150 µL / puits dans une plaque 24 puits (= 2 cm2/bien) et s’assurer que la surface entière de la culture est bien couvert avec la solution de collagène R.</li>
		<li>Laissez la solution sécher avec le couvercle ouvert pendant quelques heures ou toute la nuit dans la hotte à flux laminaire.</li>
		<li>Lorsque les plaques de culture sont complètement sèches, elles irradient avec lumière UV pendant 10-15 min minimiser la contamination.</li>
		<li>Si nécessaire, stocker les plaques à 4 ° C pendant 2 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les médias et les suppléments pour la culture sous une hotte à flux laminaire. Pour une récupération réussie de la GC, elles doivent être traitées immédiatement après décongélation.</li>
	<li>
Préparer les supports suivants.
	<ol>
<li>Compléter un milieu essentiel α-Minimal (α-MEM) avec 2 mM de L-glutamine, bicarbonate de sodium de 0,084 %, 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 20 mM HEPES, sélénite de sodium 4 ng/mL, 5 transferrine µg/mL, 10 ng/mL d’insuline et des acides aminés non essentiels 1 mM.</li>
		<li>En outre, ajouter 100 UI la pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine aux médias. Remarque : Les antibiotiques, une fois réchauffés, sont stables pendant environ 48 heures. Par conséquent, aliquote la quantité désirée de médias pour la mise en place de la culture et des médias prévues d’échange. Réchauffez seulement les aliquotes de médias à 37 ° C dans un bain d’eau. Les supports préparés peuvent être stockés à 4 ° C pendant pas plus de 3 mois.</li>
		<li>Pour induire l’activité stéroïde en élevage bovin GC, Supplément le α-MEM en outre avec l’hormone de 20 ng/mL folliculo - stimulante (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 et 2 µM androstènedione. NOTE : Toujours compléter ces composants peu avant le début d’un échange de culture ou des médias. Éviter les cycles de gel-dégel répétés pour des solutions mères FSH et d’IGF-1, car cela pourrait compromettre l’activité stéroïde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cellule Culture travail
<ol><li>Décongeler les cellules rapidement dans un bain-marie à 37 ° C pendant 3 à 4 min et transférer la suspension cellulaire à 37 ° C préchauffé α-MEM (sans supplément d’hormone). Pour la centrifugation, un volume de 10 mL est recommandé.</li>
	<li>Centrifuger le GC pendant 3 min à température ambiante et à 500 x g. Jeter le surnageant. Ajouter le α-MEM préchauffé et complétée et remettre en suspension les cellules soigneusement.</li>
	<li>Semences du GC à une densité de 1 x 105 ou 1 x 106 cellules / puits dans un volume final de 500 µL. incluent réplicats techniques d’au moins trois puits de culture par l’État.</li>
	<li>Incuber la culture de cellules dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 8 jours.</li>
	<li>Effectuer un échange de médias tous les deux jours. Remplacer seulement les deux tiers des milieux de culture pour réduire le stress et pour faciliter l’adaptation des cellules pour les supports neufs. Remarque : Le CG forment un phénotype typique de fibroblastes-comme après quelques jours de culture et ont tendance à se regrouper ensemble. Dans la culture de cellule haute-densité, clusters plus importants sont trouvent plus fréquemment par rapport à la culture de densité normale GC (Figure 1, panneau de droite gauche vs ).</li>
</ol>6. analyse des cellules de la Granulosa cultivées
<ol><li>Pour effectuer une analyse des hormones stéroïdiennes, recueillir les médias et le congeler à-20 ° C. Utiliser des méthodes appropriées pour analyser la concentration d’estradiol et de progestérone dans le médias usé [par exemple, le dosage radio-immunologique (RIA)]14.</li>
	<li>Pour l’analyse ultérieure des molécules cibles différentes (ARN, ADN, protéines, etc.), lyser les cellules directement dans la boîte de Petri avec un agent de lyse approprié tel que recommandé par le fournisseur. Remarque : Pour la plupart des procédures d’isolement, il est possible d’arrêter le protocole ici, comme les cellules lysées peuvent être stockés à-20 ° C pendant 1 semaine. Une conservation plus longue, les cellules doivent être conservés à-80 ° C.</li>
	<li>Pour déterminer l’abondance de la transcription, synthèse de cDNA et mesurer les transcriptions précises par quantitative Real-Time polymerase chain réaction (qPCR) techniques15. Une évaluation statistique doit inclure au moins trois répétitions de cultures de cellules différentes, originaires de préparations de cellules différentes (réplique biologique).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le modèle de culture cellulaire présenté fournit un outil pour analyser la granulosa de différenciation cellulaire in vitro. Plusieurs études ont montré qu’une culture sans sérum est une condition sine qua non pour maintenir l’activité stéroïde en élevage bovin GC ou GC autres espèces8,9. En outre, revêtement de la boîte de Pétri avec les composants de la matrice extracellulaire (p. ex., collagène R)13, la fixation des cellules considérablement améliorée. Une autre caractéristique importante est la période de culture prolongée. Récemment, il a été démontré qu’une culture à long terme est nécessaire pour obtenir une activité stéroïdogène suffisante et une expression équilibrée de la granulosa cellule identité marqueurs17. Il semble que le GC nécessite le temps de récupérer du stress physique au cours de la procédure d’isolement.
Les suppléments de médias FSH, IGF-1 et l’androstènedione sont connus pour induire l’activité d’aromatase dans culture GC. En particulier, la supplémentation en androstènedione est absolument nécessaire, comme le GC besoin un précurseur pour la synthèse de l’estradiol. Cela a été publié précédemment11,18 et, par conséquence, n’a pas encore examiné au cours de la présente étude. Cependant, une adaptation des concentrations de l’androstènedione, IGF-1 et FSH peut être nécessaire pour les autres montages expérimentaux.
La technique de cryoconservation décrite ici peut aider à améliorer l’Organisation des expériences de culture de tissu en les rendant plus indépendantes de l’alimentation variable avec les ovaires. Selon des analyses précédentes, cryoconservation n’affecte pas le phénotype GC ou la production de stéroïdes dans la culture. En outre, l’abondance des transcriptions de marqueur dans les cellules cultivées n’a pas révélé des différences significatives en comparant les échantillons préparés à partir des cellules fraîchement isolées avec ceux précédemment soumises à la cryoconservation16.
Un paramètre déterminant pour le présent modèle de culture de GC est la cellule densité de placage. Comme en témoignent les Résultats de représentant, augmentant la densité placage induit des changements remarquables caractéristiques physiologiques et moléculaires. Plusieurs gènes sont régulés de manière spécifique, ressemblant à des changements qui sont induits par la stimulation de LH en vivo4,19. Le fait qu’une augmentation de la densité cellulaire peut piloter des processus de différenciation-comme dans l’élevage bovin GC est à considérer méticuleusement ce modèle de in vitro GC afin d’éviter des résultats contradictoires entre les répétitions. Par conséquent, des résultats contradictoires avec d’autres études pourraient être attribuées à des densités cellulaires différentes et doivent être examinées de plus près.
Le modèle de culture décrit ici révélé être irrecevable à LH, comme les transcriptions du récepteur LHCGR sont proches de la limite de détection. Par conséquent, une simulation de la LH tant la situation in vivo n’a provoqué aucune différenciation13. Néanmoins, ce modèle fournit un outil utile pour étudier l’estradiol active GC en culture primaire, en particulier car aucune fonctionnelle bovine GC lignes existent à l’heure actuelle.
Protocoles de traitement différents peuvent être testés dans le présent modèle de culture GC qui contribuent à élucider les mécanismes de régulation de la production de stéroïdes ou de différenciation de la GC. En outre, seul des facteurs qui participent au processus de développement peuvent être analysés séparément. Par conséquent, ce modèle de culture fournit une base pour de nombreuses applications.

Luteinization et ovulation réussie dépendent des altérations moléculaires finement à l’écoute et bien orchestrées dans types de différentes cellules folliculaires somatique. Étant donné que les détails de ces processus de développement ne sont pas encore bien compris, outre des précisions sont nécessaires. Des approches in vivo sont complexes et coûteuses et, en particulier, ne sont pas des mécanismes moléculaires spécifiques adresse qui se produisent au cours de la folliculogenèse. Par conséquent, réductionniste dans vitro modèles sont nécessaires en outre, pour donner un aperçu des détails cellulaires et moléculaires. Différentes études décrivent la culture des follicules ensemble dans le contexte de in vitro fertilization techniques1,2,3. Parce que les chercheurs s’intéressent aux mécanismes de la différenciation, de nombreuses études se concentreront sur GC folliculaire. Ces cellules, directement associées à l’ovocyte, sont les principales sources de production d’oestrogènes et, ainsi, jouent un rôle essentiel tout au long de la folliculogenèse et luteinization4.
Immortalisée cell lines de GC ont été développés de différentes espèces. La plupart d'entre eux, cependant, ne montre pas une suffisante hormone stéroïde production5. Jusqu'à présent, qu’une seule lignée de bovins que GC a été établie6, mais cette ligne a perdu son activité stéroïdogène après plusieurs passages7. C’est pourquoi, depuis la stéroïdogenèse et, en particulier, production d’estradiol est une caractéristique essentielle de la fonctionnalité de GC, il est conseillé d’étudier ces aspects dans les modèles de culture de cellules primaires. Dans des études antérieures, il a été démontré qu’une production considérable d’estradiol ne peut être observée sous des conditions de culture sans sérum8,9. Plus loin, lorsqu’il s’agit d’un précurseur de la synthèse de l’estradiol est une autre condition préalable, comme le GC ne parviennent pas à exprimer l’enzyme nécessaire qui peut convertir la progestérone en androstènedione10. De plus, l’effet synergique de FSH et IGF-1 supplementation in vitro ont démontré une activité optimisée de l’aromatase, l’enzyme clé de l’estradiol de synthèse11. Dans le présent protocole, les autres facteurs importants qui ont un impact important sur le modèle de culture de GC sont également décrites. En particulier, la cellule placage densité a des effets considérables sur les résultats de l’expérience de12. En outre, une technique de cryoconservation de GC bovine qui n’interfère pas significativement avec la physiologie de la GC dans la culture pourrait être créée. Cette technique permet d’améliorer l’Organisation des travaux de culture de cellules et d’optimiser la densité placage préféré.

<table><tbody><tr><td>PBS Instamed sans Ca2+, Mg2+</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 182-05</td><td>acheté à l’origine chez Biochrom AG qui fait maintenant partie de la société Merck-Millipore ; le N° cat.-de Biochrom existe toujours</td></tr><tr><td>pénicilline / streptomycine (10 000 UI / 10 000 &micro ; g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2213</td><td>acheté à l’origine chez Biochrom AG qui fait maintenant partie de la société Merck-Millipore ; le N° cat. de Biochrom existe toujours</td></tr><tr><td>amphotéricine (250 &micro ; g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2612</td><td>acheté à l’origine chez Biochrom AG qui fait maintenant partie de la société Merck-Millipore ; le N° cat. de Biochrom existe toujours</td></tr><tr><td>Seringue de 3 mL (Omnifix Luer)</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 18 G</td><td>Roth</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal</td><td>Merck-Millipore</td><td>S 0115</td><td>acheté à l’origine chez Biochrom AG qui fait maintenant partie de la société Merck-Millipore ; le N° cat.-de Biochrom existe encore</td></tr><tr><td>flacons de cryoconservation (2 mL)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 89020</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX récipient de congélation de cellules</td><td>Corning</td><td>432004</td><td></td></tr><tr><td>plat de culture, 24 puits, fond plat</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 92424</td><td></td></tr><tr><td>collagène R (0,2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-MEM</td><td>Merck-Millipore</td><td>F 0915</td><td>acheté à l’origine chez Biochrom AG qui fait maintenant partie de la société Merck-Millipore ; le N° cat. de Biochrom existe toujours</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0282</td><td>acheté à l’origine chez Biochrom AG qui fait maintenant partie de la société Merck-Millipore ; le n° cat.-de Biochrom existe toujours</td></tr><tr><td>bicarbonate de sodium</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1713</td><td>acheté à l’origine chez Biochrom AG qui fait maintenant partie de la société Merck-Millipore ; le n° cat. de Biochrom existe toujours</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1603</td><td>acheté à l’origine chez Biochrom AG qui fait maintenant partie de la société Merck-Millipore ; le N° cat. de Biochrom existe toujours</td></tr><tr><td>sélénite de sodium</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>dissous dans de l’eau stérile</td></tr><tr><td>transfert de sigline</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td>dissous dans de l’eau stérile</td></tr><tr><td>insuline (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>dissous dans 1x PBS</td></tr><tr><td>NEA</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0293</td><td>acheté à l’origine chez Biochrom AG qui fait maintenant partie de la société Merck-Millipore ; le N° cat. de Biochrom existe toujours</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma</td><td>F4021</td><td>nous préférons utiliser une solution mère de 2 &micro ; g/mL, dilué dans 0,9 % de NaCl</td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Sigma</td><td>I1146</td>, <td>nous utilisons une solution mère de 2 & micro ; g/mL, dissous dans 10 mM HCl et 1x PBS avec 1 mg/mL</td></tr><tr><td>d’androstènedione</td><td>Sigma</td><td>46033</td> BSA<td>, nous utilisons une solution mère de 10 mM, diluée dans de l’éthanol à 100 %</td></tr></tbody></table>

un modèle de culture tissulaire d’oestrogène-production primaire bovine granulosa cellules

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Cellules de la granulosa ovarienne (GC) sont la principale source de la synthèse de l’estradiol. Induite par l’augmentation pré-ovulatoire l’hormone lutéinisante (LH), les cellules de la thèque et, en particulier, de la couche de cellules de la granulosa profondément modifier leurs caractéristiques morphologiques, physiologiques et moléculaires et forment le corpus de la production de progestérone jaune qui est responsable du maintien de la grossesse. Modèles de culture de cellules sont des outils indispensables pour étudier les mécanismes de régulation sous-jacents impliqués dans la transformation folliculo-lutéale. Le protocole présenté met l’accent sur la méthode d’isolement et la cryoconservation des bovin GC de follicules de taille petite à moyenne (< 6 mm). Avec cette technique, on trouvera une population presque pure de GC. La procédure de cryoconservation facilite grandement le temps de gestion de la culture cellulaire fonctionner indépendamment de la fourniture de tissus (ovaires) direct primaire. Ce protocole décrit un modèle de culture sans sérum cellulaire qui imite le statut d’estradiol active de GC bovine. Des conditions importantes qui sont essentielles pour une culture réussie stéroïde-actif cellulaire sont discutées dans tout le protocole. Il est démontré qu’augmentant la densité de placage des cellules induit une réponse spécifique comme indiqué par une production de profil et de l’hormone d’expression gène altéré. En outre, ce modèle offre une base pour poursuivre ses études sur la différenciation des GC et autres applications.

GC plaqué à 1 x 105 cellules/puits Visualisez une apparence typique de fibroblastes car elles constituent un prolongement cellulaire comparable aux fibroblastes et ont tendance à construire des clusters (Figure 1 a et 1C). Augmente la densité bordé par un facteur 10 à 1 x 106 cellules/puits n’a pas changé la morphologie mais on peuvent observer plusieurs agrégats cellulaires (Figure 1 b et 1D, flèches). Comme déjà indiqué dans une publication précédente, la couche de collagène de la vaisselle de la culture a largement amélioré l’attachement des cellules13.
Cryoconservation initiale n’a pas considérablement changé les caractéristiques physiologiques des cellules en culture par rapport à celles cultivées directement des échantillons fraîchement isolées. Cela est montré dans la Figure 2 que l’abondance de transcription (mesuré par qPCR) du marqueur plusieurs gènes ne différaient pas quand en comparant des cellules dérivées de piscines soit congelés soit fraîchement isolées.
La figure 3 montre des résultats représentatifs de l’analyse de l’hormone stéroïde (mesuré par RIA) en GC bovine cultivée à normal vs haute densité. La concentration d’estradiol est significativement diminuée dans la culture haute densitée par rapport à la culture de densité normale, alors que la production de progestérone ont tendance à être plus élevé.
Une analyse comparative de plusieurs gènes (mesuré par qPCR) en haute - vs densité normale cultures révèle un effet significatif (Figure 4). CYP19A1, codant l’enzyme clé de l’aromatase biosynthèse d’estradiol, ainsi que le récepteur de gonadotrophine FSHR, étaient significativement diminuées. En revanche, les gènes RGS2 et VNN2 ont montré une régulation significative. Ces résultats indiquent clairement que les procédés spécifiques de la différenciation cellulaire sont induits en augmentant la cellule densité de placage.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Figure 1 : cultivé des cellules de la granulosa bovin normal (panneaux de gauche) et haute densité cellulaire (panneaux de droite). (a et c) cellules cultivées à une densité de 1 x 105 cellules/puits affichent un phénotype typique de fibroblastes-like. (b et d) GC cultivé à une densité de placage haut (1 x 106 cellules/puits) tendance à former des grappes de grandes cellules (flèches) plus fréquemment par rapport à des cellules dans une densité normale (panneau de gauche). Barreaux de l’échelle = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Figure 2 : comparaison des cellules cultivées directement après l’isolement et après cryoconservation. Les cellules sont cultivées à une densité de 1 x 105 cellules par puits. L’expression des gènes de plusieurs transcriptions de marqueur a été évaluée et a révélé aucune différence entre les cellules cultivées avec ou sans une cryoconservation initiale. La boxplot montre la médiane de n = 3. De l’étudiant à deux t-test, les p-valeurs sont incluses. Cette figure est reproduite de Baufeld et Véronique16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Figure 3 : concentration d’hormones stéroïdes dans les cellules de la granulosa cultivées à placage à différentes densités. La concentration d’oestradiol (E2) diminue significativement quand GC ont été cultivées à une densité cellulaire élevée, alors que la concentration de progestérone (P4) seulement tendance à être plus élevé. La concentration de l’hormone a été corrigée pour le contenu en ADN normaliser pour nombre de cellules différentes. La moyenne et la SEM de n = 3 sont indiquées. p &gt; 0,05, à deux points de l’étudiant t-test. Cette figure est reproduite de Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Figure 4 : Abondance de fonctionnels clés transcrits dans les cellules de la granulosa cultivées à une normale par rapport à une densité placage haut. Bovine GC cultivée dans des conditions sans sérum pendant 8 jours ont révélé un règlement spécifique de plusieurs gènes sélectionnés. La boxplot affiche la valeur médiane de n = 3 répétitions individuelles. p &lt; 0,05, à deux points de l’étudiant t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

On décrit un modèle de culture à long terme des cellules de la granulosa bovine dans des conditions sans sérum. Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier les effets de divers facteurs et conditions comme placage à différentes densités sur les caractéristiques de la production d’oestrogène les cellules granuleuses bovine.

Un modèle de Culture tissulaire d’oestrogène-production primaire Bovine Granulosa cellules

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Ce modèle de culture cellulaire nous permet d’étudier in vitro les caractéristiques des cellules bovines de la granulosa productrice d’œstradiol, telles que les facteurs ou les affections thyroïdiennes. Le principal avantage de ce protocole est la technique de cryoconservation qui permet à la culture cellulaire de fonctionner indépendamment de l’approvisionnement direct en tissus. La procédure sera démontrée par Veronica Schreiter, une technicienne de mon laboratoire.Avant de commencer la procédure d’isolement cellulaire, lavez les ovaires bovins avec un antibiotique complété par 1X PBS dans un bécher pour éliminer le sang de la surface. Jetez le PBS et répétez le lavage trois à quatre fois jusqu’à ce que les ovaires soient propres de tout sang restant. Utilisez une lingette de laboratoire imbibée d’éthanol à 70 % pour essuyer un ovaire.Utilisez une seringue de trois millilitres avec une aiguille de calibre 18 pour percer les follicules de petite à moyenne taille. Et puis aspirer le liquide folliculaire qui contient les cellules de la granulosa. Transférez le liquide folliculaire dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.Après avoir perforé plusieurs follicules, utilisez un 1X PBS pour rincer la seringue et l’aiguille pour un nettoyage intermédiaire afin d’éviter que l’aiguille ne se bloque avec des cellules. Répétez l’opération en perforant et en aspirant les follicules pour obtenir le plus de cellules possible avec le liquide folliculaire. Pour réserver un nombre approprié de GC fraîchement isolés comme échantillons de référence pour les analyses d’ARN, d’ADN et de protéines, placez plusieurs aliquotes des cellules de référence dans des tubes frais de 1,5 millilitre.Centrifuger pendant une minute à 12 000 fois G à température ambiante. Jetez le surnageant et sans choc les granulés dans de l’azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer la cryoconservation, granulez doucement les GC en les centrifugeant à 500 fois G à température ambiante pendant trois minutes.Retirez soigneusement le surnageant et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans du sérum de veau fœtal à 100 %, ou FCS, pour éliminer tous les amas visibles. Ajoutez ensuite un volume du fluide de congélation préalablement préparé, mélangez doucement et transférez le mélange dans un flacon cryogénique. Placez le flacon dans un récipient de congélation spécialisé qui empêche la congélation rapide, de sorte que la vitesse de refroidissement ne dépasse pas moins un degré Celsius par minute.Congelez ensuite le récipient à moins 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Décongelez rapidement les cellules du flacon cryogénique dans un bain-marie à 37 degrés pendant trois à quatre minutes et transférez la suspension cellulaire dans de l’Alpha MEM préchauffé à 37 degrés sans supplément hormonal pour atteindre un volume final de 10 millilitres. Centrifugez les cellules à 500 fois G à température ambiante pendant trois minutes.Jetez le surnageant et ajoutez l’Alpha MEM supplémenté préchauffé à la pastille cellulaire et remettez-le en suspension avec précaution. Ensemencez les GC dans une plaque de 24 puits dans un volume final de 500 microlitres par puits, en veillant à inclure des répétitions d’au moins trois puits par condition. Enfin, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et avec 5 % de CO2 pendant huit jours, puis procédez à l’analyse des cellules.Après avoir cultivé des GC à une densité normale d’un fois 10 à la cinquième cellule par puits, les cellules ont présenté un phénotype semblable à celui des fibroblastes typique des GC. Les cellules cultivées à une densité de placage élevée d’un fois 10 à la sixième n’ont pas changé leur morphologie, mais ont formé de grands amas de cellules plus fréquemment. Après avoir cultivé les cellules à une densité de un fois 10 puissance cinquième, l’expression génique de plusieurs transcrits marqueurs évalués n’a révélé aucune différence entre les cellules cultivées avec ou sans cryoconservation initiale.Lorsque les GC ont été cultivés à haute densité cellulaire, la concentration d’œstradiol a diminué de manière significative, tandis que la concentration de progestérone a augmenté par rapport aux cellules cultivées à une densité normale. Des GC bovins cultivés dans des conditions exemptes de sérum pendant huit jours ont révélé une différence significative dans la régulation de plusieurs gènes marqueurs sélectionnés dans les cultures à haute densité par rapport aux cultures à densité normale, mesurée avec QPCR. Lors de l’utilisation de ce modèle de culture cellulaire de cellules bovines de granulosa productrices d’œstradiol, il est important de se rappeler les facteurs qui ont influencé la physiologie cellulaire, tels que la densité cellulaire.À la suite de cette procédure, d’autres protocoles de traitement peuvent être mis en œuvre afin de répondre à des questions telles que les molécules ou les voies de signalisation impliquées dans la différenciation des cellules de la granulosa bovine. La technique de cryoconservation a ouvert la voie à un travail de culture cellulaire plus structuré et organisé et pourrait être facilement transférée à d’autres espèces.

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