Name: Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Découvrez un dosage d'adhérence dynamique pour analyser l'effet des anticorps anti-intégrines sur l'adhésion cellulaire humaine en conditions de flux. Cette méthode avance la recherche en immunobiologie et maladies inflammatoires.

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La recherche du CN, IA, traitement NPF et SZ a été appuyée par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) et le programme ELAN de l’université Erlangen-Nuremberg, l’autre Kröner-Fresenius-Stiftung, la Fritz-Bender-Stiftung, la maladie de Crohn allemand et Colitis Foundation (DCCV), la clinique recherche groupe CEDER du Conseil allemand de la recherche (DFG), le programme de rubrique DFG microbiote, l’Initiative de champ émergeant et le DFG Collaborative Research Centers 643, 796 et 1181.

Les études décrites dans les sections suivantes ont été réalisées d’après approbation du Comité d’éthique de l’Université Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg.
1. préparation des capillaires
<ol><li>Connecter les capillaires rectangulaires au tuyau en caoutchouc en étirant le tube sur un côté avec des petits ciseaux et en insérant doucement le tube capillaire (environ 0,5 cm) dans le tube. Rendre étanche la liaison entre le tube avec le film plastique paraffine et des capillaires.</li>
	<li>Enduire le capillaire avec 20 µL de loopbackDans (recombinant Fc chimère ; 5 µg/mL, loopbackDans, p. ex. MAdCAM-1, dans un tampon enduit (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES)) ou la solution de contrôle d’isotype approprié à l’aide d’une pipette p20 (fluide va se tremper dans le capillaire). Puis, scellez le côté non connecté au tuyau avec le film plastique paraffine et incuber pendant au moins 1 heure à 37 ° C. Utilisez un capillaire rempli uniquement avec le tampon de revêtement ou avec le contrôle de l’isotype approprié comme contrôle négatif.</li>
	<li>Retirer le film plastique paraffine de l’extrémité du capillaire, vider le revêtement en laissant le liquide de trempage hors du capillaire sur un capillaires de serviette et bloc de papier pendant au moins 1 h 20 µl de bloquant la solution (solution de 1 PBS x avec 5 % de BSA) à 37 ° C. Sceller le côté ouvert du capillaire avec film plastique paraffine. Ne pas enlever la solution de blocage avant de procéder à la microscopie.</li>
</ol>2. cellule d’isolement, de traitement et de préparation pour la microscopie
Remarque : Ces étapes peuvent être effectuées au cours de l’incubation périodes nécessaires à la préparation capillaire.
<ol><li>Recueillir les 18 mL de sang anticoagulé complet avec une collection de sang aseptique de la veine cubitale du bénévolat des personnes (p. ex., IBD patients et/ou témoins sains) après consentement éclairé conformément aux règlements de la section locale Comité d’éthique. Remarque : Cette étape doit être effectuée uniquement par le personnel médical qualifié et expérimenté selon les règlements nationaux et/ou régionaux.</li>
	<li>Verser le sang dans un tube de 50 mL et diluer jusqu'à un volume de 35 mL avec du PBS 1 x. Puis sous-couche le mélange de sang-PBS avec 10 mL de milieu de gradient de densité.</li>
	<li>Effectuer centrifugation en gradient de densité à 15 min à 800 x g et 24 ° C sans frein pour séparer les cellules.</li>
	<li>Recueillir les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) en aspirant la couche leucocytaire juste au-dessus de la couche de moyen gradient de densité (couche claire intermédiaire). Transfert de PBMC en un tube frais 50 mL, compléter à 50 mL avec 1 x PBS et centrifuger pendant 10 min à 300 x g et 10 ° C.</li>
	<li>Jeter le surnageant, resuspendre le culot dans 10 mL de solution 1 PBS x et ensuite compter le nombre de cellules, par exemple, en utilisant une cellule Neubauer chambre de comptage.</li>
	<li>Facultatif : Pour étudier l’adhérence des granulocytes effectuez la procédure suivante. Sinon, passez à l’étape 2.7 ou 2.8.
	<ol>
<li>Recueillir la couche de granulocytes (calque inférieur après centrifugation en gradient de densité contenant également les érythrocytes). Remettre en suspension les cellules dans 40 mL de PBS 1 x. Puis ajoutez 8 mL de 6 % Dextran dans du PBS 1 x, mélanger doucement et laisser les sédiments de cellules pendant 30 min à température ambiante. Remarque : Les érythrocytes vont couler au fond du tube, alors que les granulocytes restera en suspension.</li>
		<li>Après 30 min, recueillir le surnageant, transvaser dans un tube frais 50 mL et centrifuger pendant 6 min à 300 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant et lyse des érythrocytes restants en ajoutant 5 mL de 0,2 % NaCl dans ddH2O. Incuber pendant 1 min.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de 1,4 % NaCl dans ddH2O et incuber pendant encore une minute. Arrêtez la lyse hypotonique en ajoutant 20 mL de solution 1 PBS x et centrifuger pendant 6 min à 300 x g et 4 ° C.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 10 mL de solution 1 PBS x. Ensuite, compter nombre de cellules à l’aide d’une cellule Neubauer chambre de comptage.</li>
	</ol></li>
	<li>Facultatif : Pour étudier l’adhérence des sous-ensembles PBMC, purifier les différents types de cellules ou des sous-ensembles (p. ex., CD4+ et CD8+ T cellules ou CD19+ B cellules) à l’aide de microbilles selon le protocole du fabricant ou par fluorescence-activé cellule triant (FACS). Sinon, passez à l’étape 2.8.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 300 x g et 10 ° C. Jeter le surnageant et tacher les cellules avec cellule de suivi des colorants (p. ex., CFSE) selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Par la suite, centrifuger les cellules pendant 10 min à 300 x get jeter le surnageant. Remettre en suspension dans 1 x PBS, déterminer le nombre de cellules et centrifuger à nouveau pendant 10 min à 300 x g.</li>
	<li>Jeter le surnageant et Resuspendre le culot de cellules colorées dans la quantité appropriée de tampon d’adhérence (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) pour obtenir une suspension de 1. 5 x 106 cellules/mL. Ensuite, ajouter la quantité appropriée de 100 mM MnCl2 pour obtenir une concentration finale de 1 mM. NOTE : Ces cellules sont maintenant prêts pour la microscopie.</li>
	<li>Facultatif : Traiter les cellules avec des cytokines, neutraliser les anticorps ou autres composés. Sinon, passez à l’étape 3.
	<ol>
<li>Omettez l’étape 2.10 et Resuspendre le culot de cellules colorées de l’étape 2,9 dans un milieu RPMI (avec 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine) pour obtenir une concentration de 1. 5 x 106 cellules/mL.</li>
		<li>Pipette 1 mL de cette suspension cellulaire en plus grand nombre de puits d’une plaque de 48 puits qu’il sont a des conditions pour être analysés. Préparez toujours un puits avec des cellules non traitées pour être perfusée par un capillaire non couché comme contrôle négatif et un puits avec des cellules non traitées pour être perfusée par un enduit de loopbackDans capillaire comme contrôle positif.</li>
		<li>Pour le traitement avec des anticorps anti-intégrine, ajouter la quantité appropriée d’anticorps (par exemple, 10 µg/mL vedolizumab) à la suspension cellulaire. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Pour un traitement par les cytokines, ajouter la quantité appropriée de cytokines recombinantes (p. ex., 10 ng/mL CXCL10) à la suspension cellulaire. Incuber 5 min à 37 ° C.</li>
		<li>Après incubation, récolter les cellules de resuspendant cellules plusieurs fois en utilisant une pipette p1000. Transfert de cellules dans un tube de 2 mL, rincer bien à nouveau à 1 mL de PBS 1 x et ajouter dans le tube 2 mL. Déterminer le nombre de cellules. Remarque : L’Incubation des populations de cellules adhérentes (p. ex., monocytes) peut nécessiter des mesures supplémentaires (p. ex.., traitement par la trypsine) pour détacher les cellules de la plaque.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellules de centrifugation pendant 10 min à 300 x g à 10 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans la quantité appropriée de tampon d’adhérence pour obtenir une suspension de 1. 5 x 106 cellules/mL. Ensuite, ajouter la quantité appropriée de 100 mM MnCl2 pour obtenir une concentration finale de 1 mM. Quand un pré-traitement avec chimiokines n’ajoutez pas de MnCl2 à la suspension cellulaire. Ces cellules sont maintenant prêts pour la microscopie. Remarque : Le volume minimal utilisé pour le dosage est tributaire de la pompe et le tuyau utilisé. Dans cette étude, à l’aide de la pompe péristaltique et le tube spécifié dans la Table des matières, il fallait un volume minimal de 400 µL. Si souhaité et il y a lieu (selon le type de cellule et rendement), la concentration de cellules dans la suspension peut être augmentée pour mesurer l’adhérence supérieure dans une courte période de temps.</li>
	<li>Modification potentielle : essai d’adhérence dynamique concurrentielle
	<ol>
<li>Effectuez les étapes mentionnées ci-dessus avec différentes populations cellulaires à comparer les uns aux autres (p. ex., réglementation et cellules effectrices T isolés par l’isolement de billes magnétiques suivant les instructions du fabricant comme par l’Etape 2.7).</li>
		<li>Tache de chaque population avec un colorant différent (par exemple, CFSE et Ousmane) comme décrit aux étapes 2,8 à 2,9 pour pouvoir différencier les populations cellulaires au cours de la microscopie.</li>
		<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension les granules cellulaires colorées dans la quantité appropriée de tampon d’adhérence (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) pour obtenir une suspension de 1. 5 x 106 cellules/mL.</li>
		<li>Mélanger des quantités égales des suspensions de cellules (par exemple, 500 µL de cellules T régulatrices) et 500 µL de cellules effectrices T pour obtenir une finale mélangé la concentration cellulaire de 1,5 x 106 cellules/mL. Ensuite, ajouter la quantité appropriée de 100 mM MnCl2 pour obtenir une concentration finale de 1 mM. Ces suspensions utilisable par la suite pour l’analyse de la concurrence du processus d’adhésion en perfusant les différentes populations cellulaires à travers le capillaire même.</li>
	</ol></li>
</ol>3. vivre d’imagerie cellulaire de l’adhérence dynamique
<ol><li>Allumez le microscope et sélectionnez le filtre approprié ou laser pour exciter la cellule dye(s) (p. ex., 488 nm laser CFSE), un objectif approprié (par exemple, 40 X) et une imagerie déchéance en temps propice acquisition mode de suivi.</li>
	<li>Retirer le film plastique paraffine de l’extrémité du capillaire et connecter le tube capillaire avec un morceau de tube (environ 5 cm de longueur) en étirant le tube sur un côté avec des petits ciseaux et en insérant doucement le tube capillaire (environ 0,5 cm) dans le tube. Rendre étanche la liaison entre le capillaire et le tube avec le film plastique paraffine.</li>
	<li>Monter le capillaire sur une plaque de fixation (par exemple, le couvercle d’une plaque de 6 puits avec une découpe rectangulaire légèrement plus courte que la longueur du capillaire) et placer le capillaire fixe sur le support du microscope, de sorte que le tube capillaire est en discussion et prêt pour la microscopie.</li>
	<li>Insérez le tube de caoutchouc dans l’encoche correspondante de la pompe péristaltique et placer l’extrémité ne pas attachée au capillaire dans le tube d’échantillon selon contenant la suspension cellulaire. Insérez le tube court de l’autre côté du capillaire dans un tube de 15 mL pour recueillir des intermédiaires.</li>
	<li>Laissez le remplissage de tubes avec un débit de 500 µL / min jusqu'à ce que la suspension cellulaire atteint presque le capillaire. Alors laissez le remplissage capillaire avec un débit de 100 µL/min. Remarque : Un remplissage rapide du capillaire assure une répartition régulière de la suspension cellulaire à l’intérieur du capillaire.</li>
	<li>Quand le tube capillaire est rempli de la suspension cellulaire, régler le débit à 10 µL/min. Remarque : Ces débits peuvent varier, lorsqu’on utilise des capillaires de dimensions différentes ou des différentes pompes péristaltiques. Dans cette étude, le taux d’écoulement de 10 µL/min a été optimisé pour la pompe et les capillaires pour reproduire in vivo la circulation sanguine.</li>
	<li>Capturer des images de Time-lapse des cellules se déplaçant lentement à travers le capillaire le long de la rence revêtu à l’intérieur du mur toutes les 2 s pour un total de 3 min. NOTE : Intervalles et temps total peuvent varier selon le type de cellule et question à aborder.</li>
	<li>Avant de jeter le tube capillaire, l’écran entier capillaire à travers l’oculaire du microscope pour s’assurer que la section montrée sur la vidéo est représentatif. Si nécessaire, faire un deuxième enregistrement.</li>
	<li>Sans le tuyau de la pompe et laisser le liquide restant courir vers dans le tube 2 mL, puis débranchez le capillaire et le tube de la barre de fixation et continuer avec le prochain capillaire.</li>
</ol>4. l’évaluation et le comptage des cellules
<ol><li>Ouvrez la séquence Time-lapse avec logiciel approprié et exporter les trois premières images (« début ») et les trois dernières images (« End ») sous forme de fichiers Tiff.</li>
	<li>Ouvert les trois images « Commence » à ImageJ, convertir en 32 bits («Image | Type | 32 bit') et fusionner des images (' Image | Couleur | Fusionner des canaux; assigner les couleurs rouges, verts et bleus pour les différentes images). Convertir image composite RVB (' Image | Type-RGB') et l’enregistrer en tant que fichier Tiff. Répéter l’opération avec les images de « Fin ». Remarque : Dans les essais d’adhérence dynamique concurrentielle avec cellules colorées avec des couleurs différentes, tout d’abord diviser les canaux des images pour analyser l’adhésion des populations cellulaires différentes séparément.</li>
	<li>Compter les cellules blanches visibles dans le « Début » et « End » composite et soustraire le nombre de globules blancs dans le « début » de globules blancs dans la « fin ». Remarque : La différence représente le nombre de nouveaux adhérant cellules dans l’intervalle de temps de 3 min. Dans l’image composite, les cellules qui se déplaçait sont visibles dans la couleur spécifique qui a été attribuée à l’armature respectif puisqu’ils localiser dans un autre endroit dans l’image précédente et la suivante. Pour les cellules qui sont adhérentes, les signaux rouges, verts et bleus dans le chevauchement même spot au blanc.</li>
	<li>Pour mieux visualiser les résultats, compilez une vidéo des séquences Time-lapse, par exemple, à l’aide de ImageJ.</li>
</ol>

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<li>House, S. D., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diameter+and+blood+flow+of+skeletal+muscle+venules+during+local+flow+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation.</a> The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).</li>
<li>Zundler, S., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+T+cell+subsets+in+allergic+and+chronic+inflammatory+bowel+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders.</a> Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).</li>
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</ol>

Toutefois a été un conseiller pour Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda et Boehringer. Toutefois et S.Z. a reçu le soutien à la recherche de Takeda et Roche.

Le protocole ci-dessus décrit une technique utile pour étudier la dynamique adhérence de cellules immunitaires humaines aux ligands endothéliales. Par variation de ligands enduits types cellulaires perfusé ou sous-ensembles, incubation avec des stimuli additionnels ou différents anticorps neutralisants, il a presque illimité d’applications potentielles. Par conséquent, ces tests d’adhérence dynamique peuvent être utiles de répondre à deux questions fondamentales de recherche fondamentale et translationnelles requêtes qui...

Motion de la cellule est un processus fortement réglementé indispensable pour le développement et le fonctionnement des organismes multicellulaires, mais est également impliquée dans la pathogénie d’une multitude de maladies1. Récemment, le processus de retour des cellules immunitaires dans la circulation sanguine vers les tissus périphériques a gagné une attention croissante, car il contribue à la reconstitution et l’expansion des cellules pathogènes dans les tissus enflammés dans les maladies à médiation immunologique par2 ,3. En particulier, homing s’est avéré ont intérêt translationnelle dans les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). La thérapeutique anti-α4β7 intégrine anticorps vedolizumab interférant avec homing gut a montré une efficacité dans des essais cliniques à grande échelle4,5 et a été utilisé avec succès dans la pratique clinique réelle6,7 , 8. autres composés sont susceptibles de suivre9,10. De même, l’anticorps de l’intégrine thérapeutique anti-α4, natalizumab, est utilisé pour le traitement de la sclérose en plaques (MS)11.
Toutefois, notre compréhension fonctionnelle du processus contrechamp en général et le mécanisme d’action de ces anticorps thérapeutiques en particulier est encore limitée. Il est bien établi que homing consiste en plusieurs étapes, y compris la cellule attachant et roulant avec adhérence de cellules suivantes conduisant à l’arrestation ferme suivie de trans migration endothéliales12,13. Les anticorps susmentionnés neutralisent des intégrines à la surface cellulaire empêchant l’interaction avec les addressins sur l’endothélium de la paroi des vaisseaux. Ceci est pensé pour empêcher la cellule ferme adhésion14,15. Pourtant, nous commençons seulement à comprendre la pertinence différentielle des intégrines spécifiques pour la domiciliation de cellule de sous-ensembles distincts de cellules. En outre, les effets des anticorps anti-intégrine sur différents sous-ensembles de cellules et les associations de dose-réponse sont largement méconnues, menant à beaucoup de questions en suspens dans le domaine des thérapies de radioralliement et contre les adhérences intestinale dans les MICI.
Par conséquent, des outils pratiques pour répondre à ces questions sont absolument nécessaires. L’effet des anticorps anti-intégrine sur l’interaction de l’intégrine-rence a jusqu’ici surtout été évalué en évaluant l’inhibition de l’efficacité/liaison liaison avec écoulement cytometry ou par adhérence statique dosages16,17 ,19,18,20, donc avec la simplification apparente et l’écart par rapport à la situation physiologique. Nous avons récemment mis en place un test d’adhérence dynamiques pour étudier l’adhésion intégrine-dépendante des cellules humaines à addressins et les effets des anticorps anti-intégrine sous la contrainte de cisaillement2. Le principe de la technique a été montré plus haut avec la souris les cellules21,22. Ici, il a été adapté et développé pour répondre aux questions mentionnées ci-dessus translationnelles, ouverture nouvelles avenues afin de mieux comprennent les mécanismes du traitement avec des anticorps anti-intégrine in vivo.

<table><tbody><tr><td>Plaque 48 puits</td><td>Sarstedt</td><td>833,923</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’adhérence : 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution bloquante : 1x PBS dans ddH2O + 5 % BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Applichem</td><td>A1391,0100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires : Tube Boro Rectangle 0,20 mm x 2,00 mm ID, longueur 50 mm</td><td>CM Scientific</td><td>3520-050</td><td></td></tr><tr><td>CCL-2,</td><td>immuno-outils</td> humains <td>11343384</td><td></td></tr><tr><td>microbilles CD4, humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade ; Kit de prolifération cellulaire CFSE</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse (Rotixa 50 RS)</td><td>Hettrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de revêtement : 150 mM NaCl + 1 mM Microscope confocal HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(TCS SP8)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CXCL-10, human</td><td>Immunotools</td><td>11343884</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 500</td><td>Roth</td><td>9219.3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA KE/9 mL Monovette</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcons (50 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,004</td><td></td></tr><tr><td>Fc chimère contrôle d’isotype</td><td>R& D Systems</td><td>110-HG</td><td></td></tr><tr><td>Débits Pompe péristaltique (LabV1)</td><td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle de l’isotype IgG humain</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31154</td><td></td></tr><tr><td>Molécule d’adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) Fc chimère</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>LS-Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>contrôle de l’isotype IgG</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-545</td><td></td></tr><tr><td>Adresse vasculaire muqueuse Molécule d’adhésion cellulaire 1 (MAdCAM-1) Fc chimère</td><td>R& D Systems</td><td>6056-MC</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Natalizumab</td><td>Biogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Chambre de comptage</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, humain</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-601000</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)&nbsp ;</td><td>Biochrom</td><td>L 182-10</td><td>sans Mg et Ca</td></tr><tr><td>Film de paraffine plastique : Parafilm (PM-996)</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>purifié anti-humain CD18</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Tube en caoutchouc : SC0059T Tube LMT-55 à 3 arrêts, diamètre intérieur de 1,02 mm, longueur de 406,4 mm</td><td>Ismatec</td><td>SC0059</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques</td><td>Sarstedt</td><td>861,254,025</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>Molécule d’adhésion des cellules vasculaires 1 (VCAM-1) Fc chimera</td><td>Biolegend</td><td>553706</td><td></td></tr><tr><td>Vedolizumab (Entyvio)</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Tube digestif homing des cellules immunitaires est important pour la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Adhérence cellulaire intégrine dépendant d’addressins est une étape cruciale dans ce processus et stratégies thérapeutiques interférant avec l’adhérence ont été établis avec succès. L’anticorps de l’intégrine anti-α4β7, vedolizumab, est utilisé pour le traitement clinique de la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (Cu) et autres composés sont susceptibles de suivre.
Les détails de la procédure d’adhésion et les mécanismes d’action des anticorps anti-intégrine sont encore peu clairs à bien des égards en raison des techniques limitées disponibles pour la recherche fonctionnelle dans ce domaine.
Nous présentons ici un essai d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle de l’adhérence de cellules humaines dans des conditions de circulation et de l’impact des thérapies anti-intégrine dans le contexte des MICI. Il repose sur la perfusion des cellules humaines primaires par l’intermédiaire de capillaires en verre ultrafin rence-enduit avec analyse microscopique en temps réel. Le test offre une variété de possibilités d’améliorations et modifications et détient le potentiel de découvertes mécanistes et applications translationnelles.

La méthode présentée dans ce manuscrit a pour but de simuler le processus in vivo de l’adhérence de cellules humaines à la paroi endothéliale aussi étroitement que possible à fonctionnellement évaluer adhésion cellulaire et le rôle des anticorps interférentes. Par conséquent, ultraminces capillaires sont recouverts d’addressins et perfusés avec des cellules humaines fluorescent étiquetés d’intérêt à l’aide d’une pompe à perfusion. L’adhérence des cellules humaines à l’addressins ...

Dynamique adhérence de cellules immunitaires vers la paroi du vaisseau est une condition préalable pour la domiciliation de l’intestin. Nous présentons ici un protocole pour une analyse fonctionnelle in vitro pour l’analyse de l’impact des anticorps anti-intégrine, chimiokines ou d’autres facteurs sur l’adhérence cellulaire dynamique de cellules humaines à l’aide d’enduit de loopbackDans capillaires.

Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de l’immunobiologie de base et de la recherche inflammatoire sur les maladies intestinales concernant la cascade d’adhérence des cellules immunitaires nécessaires pour l’homing aux organes périphériques. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une approche pratique et simple pour répondre à des questions fonctionnelles dans le contexte de l’adhérence cellulaire dans des conditions d’écoulement. Bien que cette méthode ait été développée pour explorer le mécanisme des anticorps anti-intégrine poietic de cellules dans les maladies intestinales inflammatoires, elle peut être modifiée pour analyser des issues semblables dans d’autres arrangements inflammatoires de maladie.Commencez par étirer un morceau de tube en caoutchouc d’un côté avec de petits ciseaux pour permettre l’insertion d’un capillaire rectangulaire d’environ 0,5 centimètre dans le tube. Puis sceller la connexion avec le film de paraffine. Enduire le capillaire de 20 microlitres de l’adresse d’intérêt et sceller le côté non relié au tube avec du film de paraffine en plastique pendant au moins une heure d’incubation à 37 degrés Celsius.À la fin de l’

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Un test de fréquence pour mesurer la cinétique de l'adhérence d'interaction récepteur-ligand, lorsque les deux molécules sont ancrées sur les surfaces des cellules en interaction est décrite. Ce test mécanique à base est illustrée à l'aide d'une micropipette pressurisés cellules rouges du sang humain en tant que capteur d'adhérence et de l'intégrine αLβ2 et de la molécule d'adhésion intercellulaire-1 que l'interaction des récepteurs et des ligands.

Essai Fréquence d&#39;adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l&#39;interface cellule-cellule

Des modèles expérimentaux de maladies inflammatoires de l'intestin nous ont permis d'examiner le complexe innée et adaptative des réponses immunitaires associées à la pathogenèse. Utiliser score histologique, la quantification des cytokines pro-inflammatoires et de l'activité myéloperoxydase, on peut commencer à évaluer ces réponses observée dans la maladie intestinale inflammatoire.

Enquêter inflammation intestinale induite par DSS modèle des MICI

Un procédé de quantification de l'adhésion des neutrophiles est rapporté. Cette méthode permet de créer un environnement dynamique d'écoulement semblable à celle rencontrée dans un vaisseau sanguin. Il permet à l'enquête de l'adhésion des neutrophiles soit à des molécules purifiées d'adhésion (ligand) ou substrat de cellules endothéliales (HUVEC) dans un contexte similaire à l'environnement in vivo avec contrainte de cisaillement.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Analyse de l'adhérence statique est un outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser les interactions entre les lymphocytes T et d'autres types cellulaires. Les interactions sont générées par l'injection de cellules T marquées dans des puits revêtus de molécules d'adhérence, tandis que un lecteur de plaque est utilisée pour quantifier le nombre de cellules adhérentes suivant lavages en série.

Statique Essai d&#39;adhésion pour l&#39;étude de l&#39;intégrine activation dans les lymphocytes T

Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour caractériser les propriétés adhésives intrinsèques des molécules d’adhésion cellulaire présumées.  L’ectodomaine sécrété, marqué par un épitope, d’une molécule d’adhésion cellulaire est capturé à partir du milieu de culture sur de petites billes fonctionnalisées uniformes.  Ces billes peuvent ensuite être utilisées immédiatement dans des tests simples d’agrégation de billes.

Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d&#39;adhésion cellulaire putatif

Ce test d'adhésion de flux fournit un modèle d'impact simple, élevé d'interactions cellulaires de cellules épithéliales T. Une pompe à seringue est utilisée pour générer une contrainte de cisaillement, et la microscopie confocale capture des images pour la quantification. Le but de ces études est de quantifier efficacement l'adhérence des cellules T en utilisant des conditions d'écoulement.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Les traitements actuels des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) visent à soulager les symptômes de la maladie, mais peuvent entraîner des effets secondaires graves. Ainsi, les stratégies alternatives sont à l'étude dans les modèles de colite animales. Ici, nous expliquons comment les effets bénéfiques de compléments alimentaires sur les signes cliniques MII sont analysés dans un tel modèle de colite.

Analyse Effets bénéfiques des suppléments nutritionnels sur les fonctions épithéliales intestinales barrière Pendant Experimental Colite

La notation systématique de l’inflammation intestinale utilisant un système informatique-aidé libre est un outil puissant pour comparer quantitativement des changements histopathologiques dans des modèles de colite caractérisés par la présence des ulcères et des changements inflammatoires. L’évaluation histologique de score de colite renforce des observations cliniques et facilite l’interprétation de données.

Analyse systématique de notation pour l’inflammation intestinale dans un modèle de colite induite par le sulfate de sodium murine dextran

Dans la présente étude, le dextrane marqué à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) est administré à des souris par gavage oral pour évaluer la perméabilité intestinale à la fois in vivo et dans des échantillons plasmatiques et fécaux. Comme la fonction de barrière intestinale est affectée dans de nombreux processus pathologiques, ce test direct et quantitatif peut être utilisé dans divers domaines de recherche.

Évaluation de l’intégrité de la barrière intestinale chez la souris à l’aide de dextrane marqué à la fluorescéine-isothiocyanate

Un protocole détaillé pour l’imagerie de plaquettes migrantes uniques à l’aide de sattaches avidine-biotine fonctionnalisées par RGD avec une densité ajustable est fourni, révélant que les plaquettes génèrent suffisamment de force pour rompre la liaison avidine-biotine.

Un test in vitro pour étudier la migration plaquettaire à l’aide de câbles avidine-biotine fonctionnalisés par RGD

Ce protocole démontre comment le modèle murin déficient en 5'-inositol phosphatase (5'-inositol phosphatase) de l’inflammation iléale et de la fibrose de type maladie de Crohn (MC) peut être utilisé pour tester de nouvelles thérapies pour la MC.

Évaluation des interventions thérapeutiques dans le modèle murin déficient en SHIP de l’iléite et de la fibrose semblables à la maladie de Crohn

Découvrez un dosage d'adhérence dynamique pour analyser l'effet des anticorps anti-intégrines sur l'adhésion cellulaire humaine en conditions de flux. Cette méthode avance la recherche en immunobiologie et maladies inflammatoires.

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Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire

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