Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’auto-thérapie de l’œil, telles que l’efficacité d’un tissu bio-conçu spécifiquement conçu in vivo. Avec cette technique, nous fournissons une méthode de production et de contournement du tissu rétinien ainsi qu’une stratégie de traitement du tissu pour l’implantation oculaire dans un modèle animal. Commencez par laver un à quatre morceaux de membrane amniotique humaine de 30 x 30 mm.

Fixez deux fois un échafaudage en nylon dans 80ml de PBS par lavage dans une bouteille de 250ml sur un shaker, à grande vitesse pendant cinq minutes. Après le deuxième lavage, ajoutez 40 ml de solution de Thermolysine dans chaque bouteille et secouez les bouteilles deux fois pendant cinq minutes à 450 tr/min, suivies de 30 secondes de vortex. Après la deuxième série de traitement Thermolysin, lavez les pièces deux fois de plus avec 80 ml de PBS par lavage, comme démontré.

Ensuite, à l’aide d’une longue pince stérile, transférez les hAM individuellement dans une boîte de culture de 10 cm, contenant 10 ml de PBS. Ensuite, placez une membrane avec le nylon vers le bas dans une deuxième boîte de culture de 10 cm de PBS, et détachez deux des quatre clips qui maintiennent la membrane sur du nylon. Insérez le plus petit anneau de l’insert de culture entre le nylon et la membrane, en vous assurant que la membrane recouvre complètement le plus petit anneau.

Fixez la deuxième partie de l’insert de culture sur le dessus de la membrane de sorte que la membrane basale du hAM soit orientée vers le côté droit vers le haut dans l’insert de culture et détachez les deux derniers clips. Ensuite, utilisez des ciseaux stériles pour couper toute membrane à l’extérieur de l’insert de culture si nécessaire. Et utilisez des pinces pour transférer la membrane dans un puits d’une plaque de 12 puits, contenant du PBS pour un stockage à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Avant l’ensemencement, des flacons cryogéniques chauds contenant une fois 10 à six cellules EPR dans 3 ml de milieu EPR dans un tube conique de 15 ml par flacon. Lorsque les cellules sont décongelées, pipeter pour obtenir des suspensions unicellulaires dans chacun des tubes, et compter le nombre de cellules viables par exclusion tri pan blue. Recueillir les cellules par centrifugation et remettre les granulés en suspension à sept fois 10 à la concentration de cinq cellules par millilitre dans un milieu RPE frais.

Ensuite, aspirez le PBS de chaque puits de la plaque de 12 puits préparée, et ajoutez 500 microlitres de cellules au centre de chaque insert de culture, et 1 ml de milieu RPE au fond de chaque puits. Ensuite, retournez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 jours, en changeant le milieu deux fois par semaine jusqu’à la fin de la culture. Le 30e jour de culture, réchauffez une solution de gélatine à 8 % dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, pendant 30 minutes.

Et remplissez la chambre interne d’un vibratome avec un milieu indépendant de quatre degrés Celsius CO2. À l’aide d’un scalpel, découpez un bloc de 5 cm sur 5 cm dans un bloc de gélatine à 20 % stocké à quatre degrés Celsius. Fixez la partie supérieure du bloc au support à l’aide d’un adhésif approprié.

Et placez une nouvelle lame dans le vibratome. Ajustez le bloc jusqu’à ce qu’il soit au même niveau que la lame du rasoir et remplissez le bain autour du support avec un fluide frais indépendant du CO2 à quatre degrés Celsius. Coupez le bloc à une vitesse moyenne jusqu’à ce qu’il soit coupé uniformément avec une surface d’attaque lisse et réglez la position à zéro.

Aspirez ensuite le milieu autour de la gélatine jusqu’à ce que la gélatine soit complètement sèche. Et utilisez une pince pour ouvrir soigneusement un insert de culture ensemencé d’EPR sur le dessus du bloc. À l’aide de ciseaux, retirez toute la membrane à l’extérieur de la bague d’insertion et aspirez tout le volume de fluide résiduel.

Ajoutez jusqu’à 1 ml de solution de gélatine liquide à 8 % sur la membrane jusqu’à ce qu’elle soit recouverte. Et retirez soigneusement tout excès de gélatine. Après cinq à huit minutes, ajoutez au bain un fluide frais indépendant du CO2 à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que la membrane solidifiée soit recouverte.

Et avec le vibratome en position 100 microns, coupez une section de la membrane à une vitesse moyenne, en prenant soin de maintenir l’orientation du tissu. Découpez un coin de la section avec un scalpel pour permettre l’identification de l’orientation de la section. Et utilisez une spatule pour transférer la membrane incrustée de gélatine dans l’une des plaques à six puits, remplie d’un milieu de conservation à quatre degrés Celsius.

L’orientation de la tranche pourrait être inversée en raison du mouvement libéré avant que le coin ne soit coupé. Prenez donc soin de sécuriser la position de la tranche juste après la section. La taille de l’implant peut ensuite être ajustée à la taille de l’œil du receveur sous un microscope chirurgical, avant la transplantation.

Généralement, quelques cellules mortes restent à la surface de la membrane, après fixation sur l’insert de culture, mais ces cellules sont éliminées lorsque le milieu de culture est changé. Les fibres de la membrane basale sont visibles à un grossissement plus élevé lorsqu’il ne reste plus de cellules, ce qui indique que la période de traitement à la Thermolysine a été optimisée. L’épithélium rétinien devient plus facile à voir au microscope, à mesure qu’il mûrit, formant une monocouche complète semblable à des pavés à trois semaines.

À quatre semaines, l’épithélium est suffisamment mature pour être préparé à l’implantation. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que l’état de la gélatine dépend de la température. Prenez donc soin de suivre scrupuleusement les températures recommandées.

Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie par cellules souches, pour explorer le potentiel thérapeutique d’un tissu bio-modifié dans un modèle animal de rétinite pigmentaire. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour préparer un tissu au sommet d’un échafaudage, pour sa transplantation ultérieure, elle peut également être appliquée à des systèmes plus complexes contenant des couches photoréceptrices. En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal à cause de la difficulté à manipuler les membranes amniotiques humaines, qui sont très minces et ont tendance à se plier facilement.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de fixation de la membrane amniotique humaine et d’intégration de la gélatine sont difficiles à apprendre et nécessitent une approche de manipulation particulière.