Name: Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a engenhar tecido de epitélio pigmentar da retina usando células estaminais pluripotentes humanas cultivadas em membranas amnióticas. Este método padronizado facilita estudos de terapias regenerativas para doenças oculares.

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Os autores gostaria de agradecer Jérôme Larghero e Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, França) para a sua entrada durante a instauração do método descrito aqui.
Este trabalho foi apoiado por concessões do ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], o Fondation pour la Recherche Médicale [programa de Bio-Engenharia - DBS20140930777] e do LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau e Christelle Monville. Era apoiado por NeurATRIS, uma infra-estrutura de pesquisa translacional (Investissements d'Avenir) para biotherapies em Neurociências [ANR-11-INBS-0011] e INGESTEM, a infra-estrutura nacional (Investissements d'Avenir) engenharia para pluripotentes e células-tronco diferenciadas [ANR-11-INBS-000] para Christelle Monville. Karim Ben M'Barek foi apoiado por bolsas de Stempole DIM e LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73]. -Tronco faz parte do Instituto de doenças raras, apoiada pela Association Française contre les miopatias (AFM) Biotherapies-Téléton.

Todos os materiais humanos utilizados neste protocolo foram utilizados em conformidade com os regulamentos da União Europeia. A linha de celular humana ES utilizada neste estudo foi derivada de um único embrião. O casal que tinha doado o embrião estava plenamente informado e deu seu consentimento para uma doação anônima. Uma linha celular do ES humana grau clínico foi derivada este embrião, bancada, qualificada e devidamente documentada por Roslin células (Reino Unido). Presuntos foram adquiridos em condições estéreis durante uma cesariana em mães que assinaram um consentimento para a doação de placenta de acordo com diretrizes do hospital (PHP, Hôpital Saint Louis).
1. preparação de reagentes e meios de cultura
<ol><li>
Preparação do meio de cultura de células RPE
	<ol>
<li>Para preparar o meio de cultura de células RPE, adicionar substituto 4% de soro (20 mL para um volume final de 500 mL), 1.000 x diluído 2-mercaptoetanol (500 µ l para um volume final de 500 mL) e solução de não aminoácidos essenciais em meio essencial mínimo (MEM) 1% Eagle′s (5 mL para um final volume de 500 mL) com glicose alta do médio (DMEM) da águia modificados de Dulbecco (475 mL para um volume final de 500 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do meio de transporte/conservação
	<ol>
<li>Para preparar o meio de transporte/conservação, adicione 1% de penicilina-estreptomicina (5 mL para um volume final de 500 mL) para CO2-médio independente (495 mL para um volume final de 500 mL) e mantê-lo em 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ressuspensão da enzima thermolysin
	<ol>
<li>Preparação de uma solução stock de thermolysin<ol>
<li>Para preparar uma solução stock de thermolysin, descongele o pó de thermolysin, que foi armazenado a-20 ° C, à temperatura ambiente.</li>
			<li>Como a atividade enzimática pode ser variável de lote para lote, calcule essa atividade com base no certificado de análise fornecida com o pó de thermolysin do lote a ser usado. Dividir a "atividade Protease neutro calculado = ANPC" (indicado no certificado de análise) por 181 (que é o peso molecular da tirosina). O resultado obtido corresponde a atividade enzimática total do thermolysin fornecido em pó (U/frasco).</li>
			<li>Prepare uma solução stock de 200 U/mL, adicionando o volume de água correspondente à atividade enzimática total (U/frasco) dividido por 200 (U/mL).</li>
			<li>Dissolva a enzima pipetando água que foi adicionada para cima e para baixo. Vórtice da solução por 30 s e verificar se o pó completamente foi suspenso. Pipetagem mais pode ser exigido para uma dissolução completa.</li>
			<li>Alíquota da solução estoque e armazená-lo a-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparação de uma solução de trabalho de thermolysin Nota: A solução de thermolysin deve ser preparada no dia do tratamento presunto.<ol>
<li>Descongelar as alíquotas estoque de thermolysin a 200 U/mL armazenado a-20 ° C. Dilua a solução-mãe de 200x em tampão fosfato salino (PBS) a fim de obter uma final atividade enzimática de 1 U/mL. Prepare-se 40 mL para tratar manchas de presunto 1 – 4.</li>
			<li>Filtre a solução de thermolysin através de um antes do filtro de 0,2 µm de usar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ressuspensão de gelatina
	<ol>
<li>Preparação da solução de gelatina de 20% e bloco Nota: A solução de gelatina de 20% e o bloco podem ser preparados até 1 semana antes da utilização.<ol>
<li>Aquecer o CO2-médio independente a 42 ° C em banho-maria por 30 min (até 1 h). Em um tubo de 50 mL, adicionar 10 g de gelatina para 40 mL de aquecido CO2-médio independente e vortex a solução.</li>
			<li>Dissolver a gelatina por 30 a 60 min a 42 ° C. Vórtice cada 10min para homogeneizar a solução.</li>
			<li>Uma vez que a solução é homogênea, adicione 4 mL de solução a 20% de gelatina para quatro pratos de cultura de 6 cm. Evite bolhas. Adicionar um filme plástico de parafina para proteger os pratos e permitir que a solução solidificar a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparação da solução de gelatina de 8% Nota: A solução de gelatina de 8% pode ser preparada no dia antes do uso e armazenada a 4 ° C.<ol>
<li>Aquecer o CO2-médio independente a 42 ° C por 30 min (até 1 h). Em um tubo de 50 mL, adicionar 4 g de gelatina para 46 mL de aquecido CO2-médio independente e vortex a solução.</li>
			<li>Dissolver a gelatina por 30 a 60 min a 42 ° C. Adicionar um filme plástico de parafina para proteger o tubo e mantê-lo em banho-maria a 37 ° C, se é para ser usado no mesmo dia, ou armazená-lo em 4 ° C, se é para ser usado mais tarde.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Thermolysin tratamento de membrana amniótica humana
<ol><li>
Lavagem de membrana amniótica
	<ol>
<li>Tenho presuntos fornecidos como pedaços pequenos (aproximadamente 30 x 30 mm) fixo em um andaime de nylon, ou já a 4 ° C, em PBS ou congelados. Se fornecido congelado, descongelar as membranas a 37 ° C numa incubadora por 30 min.</li>
		<li>Lave as membranas:<ol>
<li>Coloque 1 – 4 membranas em uma garrafa de 250 mL contendo 80 mL de PBS. Use tantas garrafas conforme necessário.</li>
			<li>Agite cada garrafa em um agitador de placa em alta velocidade por 5 min, em seguida, descartar a PBS. Adicione 80 mL de PBS e repetição.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tratamento Thermolysin
	<ol>
<li>Adicionar 40 mL da solução de trabalho de thermolysin (1 U/mL) por garrafa que contém as membranas (1 – 4 membranas por garrafas; até 3 garrafas de cada vez).</li>
		<li>Agitar os frascos durante 5 min à 450 rpm e, em seguida, vórtice por 30 s. Repita 1 x.</li>
		<li>Descartar a solução de thermolysin e adicionar 80 mL de PBS.</li>
		<li>Agite os frascos por 5 min a 450 rpm. Descartar a PBS e adicionar 80 mL de PBS. Repita 3x.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fixação de membrana amniótica humana por uma inserção de cultura
<ol><li>Use pinça longa estéril (que pode atingir o fundo da garrafa) para remover os presuntos, um por um e transferir cada presunto para um prato de cultura 10 cm contendo 10 mL de PBS.</li>
	<li>Uma placa de cultura nova 10 cm contendo 10 mL de PBS, lugar de membranas com o nylon voltado para baixo. Separe dois dos quatro clips que são usados para fixar a membrana de nylon.</li>
	<li>Introduza o anel menor da inserção da cultura entre o nylon e a membrana.</li>
	<li>Certifique-se que a membrana cobre completamente o anel menor. Clip-a segunda parte da inserção da cultura em cima da membrana. A membrana basal do presunto é enfrentar a inserção da cultura interna. Separe os dois últimos clipes.</li>
	<li>Corte, com tesoura estéril, o excesso de membrana exterior a inserção de cultura, se necessário. Usando fórceps, transferir a membrana fixa na inserção da cultura para uma placa de 12, adicionar PBS e armazenar a placa em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Repita estas operações (da etapa 3.2 a 3.5) com as outras membranas.</li>
</ol>4. descongelar e propagação das células do epitélio Retinal do pigmento na membrana amniótica humana
<ol><li>
Descongelamento das células do epitélio retinal do pigmento
	<ol>
<li>O banco de células RPE é congelado a 1 milhão de células por frasco criogênico em nitrogênio líquido. Descongelar como muitos frascos criogênicos como necessário (350.000 células são semeadas por membrana).</li>
		<li>Prepare um tubo de 15 mL contendo 3 mL do meio RPE por frasco criogênico. Uma vez que o frasco é descongelado, transferi as células para cada tubo. Repita esta operação para os outros frascos.</li>
		<li>Homogeneizar (pipeta para cima e para baixo algumas vezes para Ressuspender as células em meio de RPE) e levar 10 µ l da solução celular e transferi-lo para um tubo de 1,5 mL. Adicione 10 µ l de trypan azul. Lugar de 15 µ l desta solução em uma câmara de contagem, então contar o número de células viáveis (não coloridos em azul) sob um microscópio com um objetivo X 4. Repita esta operação para os outros frascos.</li>
		<li>Entretanto, centrifugar os tubos de 15 mL em 110 x g durante 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 700.000 células/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Semeadura de células do epitélio retinal do pigmento em membrana amniótica humana
	<ol>
<li>Remova a placa de 12 poços contendo as membranas da incubadora.</li>
		<li>Aspire a PBS. Adicione 500 µ l de suspensão de célula preparada na etapa 4.1.4 no centro da inserção da cultura. Adicione 1 mL de meio RPE fora a inserção de cultura (no interior do poço). Repita para as outras membranas.</li>
		<li>Coloque a placa de 12 poços contendo as membranas na incubadora.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. manutenção de culturas de células de epitélio Retinal do pigmento na membrana amniótica humana
<ol><li>Renovar o meio 2 x por semana, geralmente às segundas e sextas, até pelo menos dia 30 da cultura.</li>
	<li>Aspire o meio dentro e fora da inserção da cultura de cada poço e renová-lo com meio fresco (1ml fora a inserção da cultura e 500 µ l de dentro). Coloque a placa na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
</ol>6. preparação do Patch do epitélio Retinal do pigmento para transplante
Nota: A partir de dia 30, da cultura, o tecido está pronto para transplante.
<ol><li>Quente a solução de 8% de gelatina em banho-maria a 37 ° C por 30 min. Encha a câmara interna da vibratome com frio CO2-médio independente (a 4 ° C).</li>
	<li>
Coloque o bloco de 20% de gelatina para o vibratome.
	<ol>
<li>Leve o prato de cultura de 6cm que contém o bloco de 20% de gelatina na geladeira. Usando um bisturi, corte um bloco de 5 cm x 5 cm. Cole a parte superior do bloco para o apoio com cola de cianoacrilato ou seu equivalente.</li>
		<li>Coloque uma lâmina nova no vibratome.</li>
		<li>Ajuste o nível do bloco até que esteja no mesmo nível da lâmina de barbear.</li>
		<li>Encher a banheira em torno do apoio com frescos de CO2-médio independente a 4 ° C. Corte o bloco com a vibratome usando uma velocidade média até que o bloco é cortado uniformemente, levando a uma superfície lisa. Defina a posição 0.</li>
		<li>Aspire o meio em torno do bloco de gelatina até que esteja completamente seco e depois levar o prato de 12-poços de cultura contendo os tecidos da incubadora a 37 ° C.</li>
		<li>Usando a pinça, abra cuidadosamente a inserção da cultura em cima do bloco de gelatina. Corte, com a tesoura, todas as partes das membranas que não contêm células (fora do ringue onde células não foram cultivadas). Aspire o inteiro médio residual.</li>
		<li>Adicione 1 mL da solução de 8% de gelatina líquida a 37 ° C, a fim de cobrir as membranas. Remova cuidadosamente o excesso. Espere 5 – 8 min para permitir que a gelatina solidificar.</li>
		<li>Adicionar novo CO2-médio independente (a 4 ° C) para o banho até que a membrana é coberta.</li>
		<li>Corte, com o vibratome em uma posição de-100 µm, com uma velocidade média, permanecendo ciente de como o bloco se comporta. No final da seção, tenha cuidado para manter a orientação do tecido.</li>
		<li>Com um bisturi, corte um canto para identificar a orientação da seção.</li>
		<li>Recolher a membrana incorporada em gelatina com uma espátula e coloque-o em uma placa de 6 preenchida com o meio de conservação a 4 ° C, até enxertia aos olhos do destinatário.</li>
		<li>Na época do transplante, ajuste o tamanho do implante para o tamanho do olho destinatário sob um microscópio cirúrgico (1-3 para ratos, 10 a 15 mm2 para primatas não-humanos).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+the+RPE+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of the RPE in AMD.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).</li>
<li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19%2C+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li>
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</ol>

Olivier Goureau é o inventor na pendente patentes relacionadas com a geração de células da retina a partir células-tronco pluripotentes humanas. Os outros autores não têm nada a divulgar.

Nós descrevemos um método para a cultura de células RPE sobre um andaime biológico e sua preparação para implantação em modelos animais. Uma das etapas críticas do protocolo é a manutenção da orientação do presunto por todo o procedimento até sua inclusão em gelatina. Com efeito, é removido o epitélio nativo da membrana e sua membrana basal torna-se exposto9. As células RPE possuem ser semeado em cima desta membrana basal. Após a preparação para a incorporação de gelatina, é crucial trabalhar com ...

RPE é crucial para a sobrevivência e a homeostase dos FOTORRECEPTORES com o qual é fortemente associado1. Diversas condições patológicas alteram a sua funcionalidade e/ou sobrevivência, incluindo RP e AMD.
RP é um grupo de mutações herdadas de monogénicas que afetam as funções de fotorreceptores, células RPE ou ambos os2,3. Estima-se que as mutações que afetam especificamente o RPE células conta para 5% da RP2. AMD é outra condição onde a camada RPE é alterada, perda de visão, em última análise, a central principal. AMD é causada pelas complexas interações de fatores genéticos e ambientais e afeta os idosos4,5,6. De acordo com projeções, a AMD vai ser uma preocupação para os pacientes 196 milhões em todo o mundo por 20207. Para estes distúrbios, não existe nenhuma cura eficaz e uma das estratégias propostas é o transplante de células RPE novos para compensar mortos/não-funcionais preexistente RPE células8.
O modo de formulação do produto final a ser enxertado é essencial para garantir os melhores resultados funcionais. As células RPE injetadas como uma suspensão de células, apesar de ser um método fácil e simples de entrega, aumentar as preocupações em relação a sua sobrevivência, integração e funcionalidade9,10,11,12 , 13. cientistas desenvolvem-se mais complexas formulações para entregar engenharia tecido retinal9,13,14,15,16. Neste contexto, desenvolvemos um método original para gerar em vitro tecido RPE que poderia ser usado para transplante9.
Os bancos de células RPE derivados de células-tronco embrionárias humanas (ES) são usados no presente protocolo. No entanto, a alternativa RPE celular bancos de fontes diferentes células (células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, as células RPE primárias, etc.) e diferenciados com um método diferente também são adequados para este protocolo. Diferenciação dirigida inclui protocolos usando citocinas e/ou pequenas moléculas17,18,19,20,21,22.
Para ser transplantado, o tecido projetado deve ser preparado em um andaime. Nos últimos anos, andaimes diferentes foram desenvolvidos com base em um polímero ou em uma matriz de origem biológica13,23,24. Aqui, o substrato biológico utilizado é o presunto, mas outros substratos, como membranas de Bruch desnudas, poderiam ser implementados. O método aqui descrito tem a vantagem de usar um andaime biológico que é mais relevante para o ambiente nativo de RPE.
ES derivado de células RPE as células humanas são cultivadas pelo menos 4 semanas para ser totalmente organizado como uma monocamada de paralelepípedos. Nessa fase, o epitélio obtido é funcional e polarizada9. Finalmente, como este tecido enruga facilmente, ele é incorporado em uma camada fina de uma operadora de hidrogel para dar mais rigidez e elasticidade e para protegê-lo durante o procedimento de injeção. Este produto é então armazenado em 4 ° C até enxertia.

<table><tbody><tr><td>Armário de biossegurança estéril</td><td>TechGen International</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de eliminação de resíduos líquidos para aspiração</td><td>Vacuubrand</td><td>BVC 21</td><td></td></tr><tr><td>CO2-controlado +37&nbsp; &deg; Incubadora de células C</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>BVC 21 NT</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &micro; L pipeta: P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; mL pipeta: P1000</td><td>Gilson</td><td>F144566</td><td></td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Drummond</td><td>75001</td><td></td></tr><tr><td>+4&nbsp; &deg; C geladeira</td><td>Liebherr</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina</td><td>WPI</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps (x2)</td> <td>WPI</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Grant subaqua pro</td><td>SUB6</td><td></td></tr><tr><td>Balança de precisão</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorff</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>SC30</td><td></td></tr><tr><td>Agitador Horizontal Rocking</td><td>IKA-WERKE</td><td>IKA MTS 214D</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>LAB DANCER S40</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Descartável</td><td>WPI</td><td>500351</td><td></td></tr><tr><td>filme plástico</td><td>parafina VWR</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>0.200 &micro; m filtro de seringa descartável</td><td>SARTORIUS</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>Seringa sem agulha 50 mL</td><td>Dutscher</td><td>50012</td><td></td></tr><tr><td>Frascos 250 mL</td><td>Dutscher</td><td>28024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubos Falcon estéreis</td><td>Dutscher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubos Falcon estéreis</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>inserção de cultura</td><td>Scaffdex</td><td>C00001N</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm distribuidores de cultura de células: B6</td><td>Dutscher</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de células de 12 poços Placas</td> de cultura <td>de</td> 6 poços Corning <td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de</td> barbear <td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato</td><td>Castorama</td><td>3178040670105</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x (500&nbsp; mL)</td> <td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysine</td><td>Roche</td><td>5339880001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)</td> <td>Invitrogen</td><td>12618-013</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td> <td>Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoetanol (50&nbsp; mM)</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>meio independente de CO2</td><td>GIBCO</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>MERCK</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>membrana amniótica humana</td><td>Banco de tecidos Hospital St Louis (Paris, França)</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr></tbody></table>

engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Diversas condições patológicas do olho afetam a funcionalidade e/ou a sobrevivência do epithelium retinal do pigment (RPE). Estes incluem algumas formas de retinite pigmentosa (RP) e degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Terapia celular é uma das estratégias mais promissoras terapêuticas propostas para curar estas doenças, com já incentivando os resultados preliminares em seres humanos. No entanto, o método de preparação do enxerto tem um impacto significativo em seus resultados funcionais em vivo. Com efeito, as células RPE enxertadas como uma suspensão de células são menos funcionais do que as mesmas células transplantadas como um tecido da retina. Aqui, descrevemos um método simples e reprodutível para engenheiro RPE tecido e sua preparação para a implantação na vivo . As células RPE derivadas de células-tronco pluripotentes humanas são semeadas sobre um suporte biológico, a membrana amniótica humana (presunto). Comparado aos andaimes artificiais, este apoio tem a vantagem de ter uma membrana basal que é perto da membrana de Bruch, onde as células RPE endógenas estão conectadas. No entanto, sua manipulação não é fácil, e desenvolvemos várias estratégias para seu cultivo adequado e preparação para enxertia em vivo.

Presuntos contêm uma camada epitelial que deve ser removida antes da semeadura de células RPE. Um tratamento enzimático da membrana é executado com o thermolysin sob agitação. Em ordem para não perder a polaridade da membrana (o epitélio é de um lado), é fixado num suporte de composição que pode ser diferente dependendo do provedor (figura 1A). Verificar a aderência da membrana de seu apoio a este passo e adicionar clips, se necessário. Aquando da fixação na ...

Nós descrevemos um método para engenheiro um retina tecido composto de células epiteliais de pigmento retinal derivadas de células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em cima de membrana amniótica humana e sua preparação para enxertia em modelos animais.

Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a autoterapia do olho, como qual é a eficácia de um tecido de bioengenharia especificamente projetado in vivo. Com esta técnica, fornecemos um método de produção e contorno do tecido retiniano, bem como uma estratégia para processar o tecido para implantação ocular em um modelo animal. Comece lavando de um a quatro pedaços de membrana amniótica humana de 30 por 30 mm, ou hAM.Fixe um andaime de nylon duas vezes em 80ml de PBS por lavagem em uma garrafa de 250ml em uma coqueteleira, em alta velocidade por cinco minutos. Após a segunda lavagem, adicione 40ml de solução de termolisina funcional a cada frasco e agite os frascos duas vezes por cinco minutos a 450 rpm, seguidos de 30 segundos de vórtice. Após a segunda rodada de tratamento com Thermolisin, lave as peças mais duas vezes com 80ml de PBS por lavagem, conforme demonstrado.Em seguida, use uma pinça longa e estéril para transferir os hAMs individualmente, para uma placa de cultura de 10 cm, contendo 10 ml de PBS. Em seguida, coloque uma membrana com o náilon voltado para baixo em uma segunda placa de cultura de 10 cm de PBS e retire dois dos quatro clipes que prendem a

engineering-transplantation-suitable-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

As células do epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células-tronco podem ser usadas para várias aplicações, incluindo terapias baseadas em células para degeneração da retina, modelagem de doenças e estudos de medicamentos. Aqui apresentamos um protocolo simples para derivar RPE de forma reprodutível de células-tronco.

Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

Aqui apresentamos um protocolo aceito pela comunidade em formato multimídia para injeção sub-retina de um bolus de células RPE em ratos e camundongos. Essa abordagem pode ser usada para determinar potenciais de resgate, perfis de segurança e capacidades de sobrevivência de células RPE enxertadas após implantação em modelos animais de degeneração retiniana.

Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

O objetivo deste relato é descrever os protocolos para derivar o epitélio retinal pigmento (RPE) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células usando diferentes tamanhos de corpos embrióides.

Derivando Retinal Pigment Epithelium (RPE) de pluripotentes induzidas (iPS) Stem Cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides

Subretinal injeção tem sido amplamente aplicada em estudos pré-clínicos de terapia de reposição de células-tronco para degeneration macular age-related. Neste artigo visualizado, descrevemos uma técnica de injeção subretinal menos arriscado, reproduzíveis e precisamente modificados através da abordagem trans-escleral para entregar as células nos olhos de rato.

Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

Este protocolo descreve como produzir células epiteliais de pigmento retinal (RPE) de células-tronco pluripotentes. O método usa uma combinação de fatores de crescimento e de pequenas moléculas para direcionar a diferenciação de células-tronco em RPE imaturo em catorze dias e RPE maduro e funcional, depois de três meses.

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

Células epiteliais de pigmento retinal podem servir como uma terapia de reposição celular para a forma avançada de degeneration macular age-related seco. Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica e o subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal embrionárias humanas células-tronco derivadas para este modelo de doença.

Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Apresentamos aqui uma técnica cirúrgica para transplante de tecido retiniano derivado de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) no espaço sub-retiniano de um modelo animal de grande porte.

Transplante Sub-Retiniano de Tecido Retiniano Derivado de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Modelo Animal de Grande Porte Felino

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e transfetar células epiteliais de íris primária e pigmento da retina de vários mamíferos (ratos, ratos, coelhos, suínos e bovinos). O método é ideal para estudar abordagens de terapia genética ocular em várias configurações para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos.

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

O primata não humano (NHP) é um modelo ideal para estudar a terapêutica celular da retina humana devido às semelhanças anatômicas e genéticas. Este manuscrito descreve um método de transplante submacular de células epiteliais de pigmento retiniano no olho nHP e estratégias para prevenir complicações intraoperatórias associadas à manipulação macular.

Transplante de Epitélio de Pigmento De Retina em um modelo de primata não humano para doenças degenerativas da retina

Este protocolo apresenta uma abordagem trans-escleral guiada por visão transpupilar para entregar com segurança e precisão enxertos celulares sub-retinianos, com baixa taxa de complicações cirúrgicas, em receptores de camundongos com ou sem degeneração retiniana.

Transplante transpupilar-guiado trans-escleral de enxertos sub-retinianos em modelo de camundongo com degeneração retiniana

Descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC pós-criopreservadas e a liberação sub-retiniana dessas células em camundongos rd10 .

Liberação Sub-Retiniana de Progenitores de Fotorreceptores Derivados de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Camundongos rd10

Aprenda a engenhar tecido de epitélio pigmentar da retina usando células estaminais pluripotentes humanas cultivadas em membranas amnióticas. Este método padronizado facilita estudos de terapias regenerativas para doenças oculares.

Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas (Vídeo) | JoVE Journal

Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas

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