Évaluation globale de l’efficacité et l’innocuité de la délivrance de médicaments ciblés Placenta en utilisant trois méthodes complémentaires

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nanomédecine sur l’efficacité et l’innocuité d’un médicament chargé sur des nanoparticules administrées à la mère et au fœtus. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite une mesure biochimique précise de la quantité de médicament délivrée dans le placenta. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des complications de la grossesse médiées par le placenta, car il est important d’assurer un ciblage précis de l’administration du médicament au placenta.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l’évaluation par ultrasons à haute fréquence du développement embryonnaire nécessite de la patience et de l’expérience pour être maîtrisée. Pour l’injection intraveineuse de nanoparticules, transférez une souris enceinte embryonnaire Day 14.5 avec des veines de la queue dilatées par la chaleur dans un dispositif de contention et nettoyez la queue avec un tampon d’alcool. Insérez ensuite l’extrémité de l’aiguille d’une seringue à insuline de calibre 28 dans une veine de queue dilatée, et appuyez lentement sur le piston pendant cinq à 10 secondes avec une pression uniforme pour libérer les nanoparticules dans la veine de la queue.

30 minutes après l’injection, placez la souris enceinte anesthésiée dans la chambre d’imagerie d’un système d’imagerie par fluorescence in vivo en position couchée. Sélectionnez la fluorescence 2D et les paramètres photographiques appropriés pour l’imagerie des signaux de fluorescence vert d’indocyanine, et réglez l’exposition à l’auto et les longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 710 et 820 nanomètres, respectivement. Ensuite, imaginez l’animal et remettez la souris enceinte dans sa cage.

48 heures après l’injection, utilisez la pince Graefe, la pince à tissus Graefe et des ciseaux de dissection pour prélever les fœtus et les placentas, et imagez les tissus prélevés comme cela vient d’être démontré pour l’ensemble de l’animal. Pour l’évaluation échographique à haute fréquence du développement embryonnaire, 24 heures après l’injection de nanoparticules, fixez la mère enceinte anesthésiée sur une plate-forme d’imagerie par ultrasons préchauffée à 37 à 42 degrés Celsius en position couchée, et placez le transducteur de 40 mégahertz dans le bras mécanique. Ajustez ensuite la position du transducteur pour obtenir des images longitudinales du fœtus et du placenta avec la région d’intérêt dans la zone focale.

Pour l’imagerie et l’analyse en mode B, sélectionnez le mode B et abaissez le transducteur sur l’abdomen jusqu’à ce que le fœtus et le placenta soient visibles. Cliquez sur Scan/Freeze pour lancer et arrêter l’imagerie, Cine Store pour stocker la boucle ciné et Frame Store pour stocker les images de l’image. Cliquez ensuite sur Mesurer pour analyser la longueur du sac gestationnel, la longueur de la couronne fœtale, la longueur de la croupe, le diamètre bipariétal, la circonférence abdominale, le diamètre placentaire et l’épaisseur placentaire.

Pour l’imagerie et l’analyse Doppler à ondes de pouls, à l’aide de la même projection de balayage, cliquez d’abord sur Couleur, puis sélectionnez Onde de pouls et placez la boîte de volume d’échantillonnage au centre de l’artère ombilicale. Cliquez sur Scan/Freeze pour lancer l’imagerie et sur Cine Store pour collecter les images de l’artère ombilicale. Cliquez ensuite sur Mesurer pour calculer la vitesse de crête de l’artère ombilicale.

Pour l’imagerie et l’analyse en mode Doppler couleur, à l’aide de la même projection de balayage, cliquez sur Couleur et ajustez la position de la sonde pour obtenir des images du cœur fœtal comme illustré. Cliquez ensuite sur Mesurer pour calculer la fréquence cardiaque fœtale de la boucle d’image ciné enregistrée. Pour l’analyse par chromatographie liquide à haute pression, ou HPLC, injectez d’abord une dose unique de nanoparticules à une souris enceinte Embryonic Day 14.5

Après 24 heures, perfuser le cœur de l’animal gravide avec 50 millilitres de solution saline glacée à 0,9 % pendant 10 minutes pour éliminer toutes les nanoparticules non liées, et recueillir les fœtus et les placentas pour les stocker à moins 80 degrés Celsius. Le jour de l’analyse, ajoutez 500 microlitres de solution d’homogénéisation fraîchement préparée à chaque échantillon de tissu de 200 milligrammes, et homogénéisez les échantillons deux fois à pleine vitesse pendant 30 secondes par dissociation. Après la deuxième homogénéisation, centrifugez les échantillons et filtrez les surnageants à travers un filtre à seringue de 0,45 micromètre dans un flacon HPLC.

Placez les flacons d’échantillon dans un plateau d’échantillonnage automatique pour l’injection, puis allumez le dégazeur HPLC pour évacuer l’air du système. Ensuite, activez le flux pour équilibrer la colonne avec la phase mobile pendant 30 minutes afin de réduire le bruit de base, et réglez la température de la colonne à 25 degrés Celsius. Injectez ensuite des volumes d’échantillon de 20 microlitres à un débit d’un millilitre par minute dans les 30 minutes, puis cliquez sur Exécuter la méthode pour commencer l’analyse.

Une fois les cycles terminés, remplacez manuellement la phase mobile par de l’acétonitrile de qualité HPLC et faites fonctionner l’acétonitrile pendant environ 15 minutes pour protéger le système. L’imagerie in vivo révèle de forts signaux verts d’indocyanine dans le tissu utérin 30 minutes après l’injection placentaire de nanoparticules conjuguées à la fluorescence liée au sulfate de chondroïtine, tandis que les nanoparticules non liées se localisent principalement dans les régions hépatique et splénique. 48 heures après l’injection, un signal fluorescent est observé dans le placenta d’animaux injectés de nanoparticules liées au sulfate de chondroïtine placentaire, sans qu’aucun signal ne soit détecté chez le fœtus.

La surveillance par ultrasons à haute fréquence d’animaux injectés de nanoparticules conjuguées à la fluorescence liée au sulfate de chondroïtine placentaire révèle une diminution significative des principaux jalons de développement fœtaux et placentaire. Il est intéressant de noter que le traitement avec des nanoparticules liées au méthotrexate altère également légèrement le développement fœtal et placentaire, ce qui indique que les nanoparticules peuvent améliorer l’administration du méthotrexate au placenta via l’effet de perméabilité et de rétention accru. La mesure des concentrations de méthotrexate par HPLC indique un temps de rétention de sept minutes dans le placenta de souris injectées de nanoparticules liées au méthotrexate.

24 heures après l’injection, les taux placentaires de méthotrexate dans le groupe injecté de nanoparticules liées au méthotrexate sont significativement inférieurs à ceux mesurés dans le groupe placentaire de sulfate de chondroïtine et de nanoparticules liées au méthotrexate, sans qu’aucun méthotrexate n’ait été détecté chez les fœtus de ce dernier. Le méthotrexate peut encore être détecté dans le placenta 48 heures après l’injection de sulfate de chondroïtine placentaire et de nanoparticules liées au méthotrexate, démontrant que le sulfate de chondroïtine placentaire et les nanoparticules liées au méthotrexate ne peuvent pas traverser le placenta, minimisant ainsi les effets indésirables potentiels sur le fœtus. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le placenta commence à se former vers le jour embryonnaire 9 1/2, et donc l’expérience d’imagerie in vivo est mieux réalisée le jour embryonnaire 10 1/2 ou plus tard.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la coloration et l’analyse par immunofluorescence peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la localisation des nanoparticules dans le placenta. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine de la reproduction pour explorer la possibilité d’un traitement ciblant le placenta dans les complications de la grossesse.