Utilisation de Autometallography pour localiser et semi-quantifier argent dans les tissus de cétacés

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la toxicologie environnementale sur les distributions de sous-organes et la concentration de métaux lourds dans les systèmes biologiques. Le principal avantage de cette technique est que l’AMG est une méthodologie facile à utiliser et peu coûteuse, qui est un adjuvant précieux pour étudier les métaux lourds dans les tissus. Nous utilisons les tissus des dauphins et des baleines pour démontrer le protocole.

Cependant, nous croyons que le protocole pourrait être utilisé dans une variété d’espèces animales. Shun Theng, clinicien de notre institut, démontrera l’intervention avec Wen-Ta Li. Commencez par recueillir des tissus hépatiques et rénaux appariés pour l’analyse AMG à partir d’un cétacé échoué, et la fixation du tissu en 10 fois le volume de formaline tamponnée neutre de 10% pendant 24 à 48 heures.

Ensuite, utilisez des lames de microtomées jetables en acier inoxydable pour couper les tissus hépatiques et rénaux fixés à la formaline en sections de deux centimètres par un centimètre, trois millimètres, et placez les sections hépatiques et rénales du même individu dans les mêmes cassettes étiquetées. Déshydrater les sections d’un transformateur tissulaire au moyen d’une série d’immersions d’éthanol et de xylène classées, suivies d’immersions d’une heure et de deux heures paraffine. Après l’immersion de deux heures paraffine, transférer les tissus au fond des moules d’histologie en acier et intégrer les échantillons de tissus déshydratés avec de la paraffine fraîchement fondue.

Réfrigérer les blocs de tissu s’incrustés de formaline et de paraffine sur une plaque froide, jusqu’à ce que la paraffine se solidifie et coupe chaque bloc au microtome jusqu’à ce que la surface du tissu soit exposée. Réfrigérer les échantillons à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes et obtenir des sections de tissu de cinq micromètres sur la microtome. À l’aide de pinces à épiler et de brosses, soulevez les rubans de la section tissulaire au fur et à mesure qu’ils sont acquis et faites-les flotter à la surface d’un bain d’eau à double distillation de 45 degrés Celsius, jusqu’à ce qu’ils puissent être séparés, et placez-les sur des toboggans individuels au microscope.

Ensuite, placez les glissières sur un chauffe-glissière pendant une heure, à 60 degrés Celsius. Ensuite, placez les glissières dans des grilles à glissières et dé-paraffinisez les sections dans trois plats de coloration différents contenant de 200 à 250 millilitres de pur non-xylène pendant huit incubations de cinq et trois minutes. Hydratez les échantillons dé-parrafinisés dans différents plats de coloration de solutions d’éthanol classées, suivis du rinçage dans de l’eau doublement distillée.

Rincez les sections une fois en PBS complétées par 5% Triton X 100, plusieurs fois dans PBS seul, et une fois dans de l’eau fraîche double-distillée pendant 30 secondes par lavage. Après le dernier lavage, étiquetez chaque échantillon de 300 microlitres de solution mixte de kit d’amélioration de l’argent, pendant au plus 15 minutes dans l’obscurité à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les glissières avec de l’eau doublement distillée et contre-tacher les sections en 300 microlitres d’hématoxyline par toboggan, pendant 10 secondes.

Lavez les glissières avec de l’eau courante du robinet. Séchez-les et montez les sections avec un support de montage. Ensuite, capturez 10 images histologiques aléatoires de chaque section de tissu, sous l’objectif 40X d’un microscope léger.

Pour analyser l’autométallographie, ou AMG, la positivité des échantillons, ouvrez les images dans un logiciel d’analyse d’image approprié, et sélectionnez l’image, le type et la pile RGB, pour diviser la première image en canaux de couleur rouge, bleu et vert. Dans le canal bleu, sélectionnez l’image, ajustez et seuilz, pour mesurer le pourcentage de la zone avec des signaux positifs à l’AMG dans chaque image, en ajustant manuellement la valeur de coupure pour le seuil de chaque image en fonction de la présence de zones faussement positives dans les noyaux, ou globules rouges. Cliquez sur analyser, définir les mesures, et vérifier la fraction de zone, pour spécifier que la fraction de zone est enregistrée.

Cliquez sur analyser et mesurer pour afficher la zone de pourcentage positif de chaque colonne de zone de pourcentage d’image histologique de la fenêtre de résultat. Pour évaluer la corrélation entre les résultats de la spectroscopie de masse plasmatique couplée inductivement et les valeurs amg-positives, ouvrez le logiciel de graphique approprié. Créez un nouveau fichier de projet et sélectionnez XY et corrélation.

Saisir les résultats de la spectroscopie de masse plasmatique couplée inductivement et des analyses AMG, et sélectionner l’analyse, et la corrélation, pour analyser la force d’association entre les résultats de l’analyse par l’analyse de corrélation Pearson. Dans les paramètres, fenêtre de régression non linéaire, sélectionnez un modèle de régression différent sur la page d’ajustement et sélectionnez les méthodes de comparaison sur la page de comparaison. Incluez la somme supplémentaire du test F carrés et le critère d’information d’Akaike.

Selon les résultats des méthodes de comparaison, choisissez un modèle de régression relativement approprié dans l’analyse histologique d’argent des cétacés, et utilisez le test pour estimer les concentrations d’argent du foie des cétacés et des tissus rénaux, avec des concentrations inconnues d’argent. Les signaux positifs à l’AMG comprennent des granules bruns à noirs de taille variable dans le cytoplasme des hépatocytes et des cellules Kupffer, ainsi que des signaux amorphes occasionnels, jaune doré à brun AMG positif dans le lumen et la membrane du sous-sol de certains tubules rénaux proximaux. Il existe une corrélation positive entre les résultats de la spectroscopie de masse plasmatique couplée inductivement et les valeurs de positivité AMG dans les tissus hépatiques et rénaux analysés, avec une régression linéaire préférée par l’origine, selon la somme supplémentaire du test F carrés, et le critère d’information d’Akaike.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que la méthode AMG est une méthode adjuvant, et doit être utilisé avec d’autres méthodes spécifiques, telles que ICPMS, pour surveiller la composition réelle des métaux lourds dans les tissus.