Génération des cellules de knock-out primaire et élargi NK humaine à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules NK sur le rôle et la fonction de gènes et de voies spécifiques qui régulent la fonction des cellules effectrices. Le principal avantage de cette technique est son taux de réussite élevé par rapport aux approches dépendantes de l’ADN, facilitant un knock-out très efficace de l’un des gènes les plus pertinents sur le plan clinique dans la thérapie cellulaire NK. Les implications de cette technique s’étendent à l’immunothérapie des tumeurs solides et des tumeurs cérébrales qui expriment le TGF-bêta comme moyen d’échappement immunitaire.

Pour la transduction primaire des cellules NK, incuber trois fois 10 à cinq cellules NK fraîchement isolées par millilitre de milieu RPMI complété par 100 UI par millilitre d’IL2 par fiole T75 pendant quatre jours, en remplaçant le milieu tous les deux jours et la veille de la transduction. Pour la transduction des cellules NK élargie, stimulez les cellules NK primaires au jour zéro avec des cellules nourricières K562 exprimant l’IL21 liée à la membrane rayonnée dans un rapport de un à un remplaçant le milieu tous les deux jours et la veille de la transduction. Le jour de l’électroporation, remplissez un flacon T25 avec huit millilitres de milieu de culture frais complété par 100 UI par millilitre d’IL2 par condition de cellule expérimentale et placez les flacons dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et à 5 % de CO2.

Pendant que le milieu s’équilibre, ajoutez trois à quatre fois 10 à la sixième cellule par condition pour 26 microlitres de mélange de transduction dans un tube conique et granulez les cellules par centrifugation. Ensuite, lavez les cellules trois fois dans 12 millilitres de PBS stérile par lavage pour éliminer tout le FBS des suspensions cellulaires. Pendant que les cellules sont lavées, remettez en suspension chaque ARN CRISPR et ARNtracr à 200 concentrations finales micromolaires.

Mélangez 2,2 microlitres de chaque ARN CRISPR avec un volume de 200 micromolaires d’ARNtracr par échantillon et chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Laissez ensuite les échantillons refroidir à température ambiante et stockez les complexes ARN/ARNtracr CRISPR à moins 20 degrés Celsius jusqu’à leur utilisation. Pour former les complexes ribonucléoprotéiques, ajoutez l’endonucléase Cas9 au complexe ARN/ARNtracr CRISPR correspondant avec un tourbillon pendant 30 à 60 secondes et incubez les complexes ribonucléoprotéiques Cas9 résultants à température ambiante pendant 15 à 20 minutes.

Après le dernier lavage, ajoutez tout le volume de supplément d’électroporation du kit Nucleofector solution P3 et remettez en suspension chaque pastille de cellule dans 20 microlitres de la solution primaire P3 4D-Nucleofector en prenant soin d’éviter les bulles d’air. Ajoutez immédiatement cinq microlitres de chaque complexe ribonucléoprotéique à la suspension cellulaire appropriée et ajoutez un microlitre de 100 micromolaires d’amplificateur d’électroporation Cas9 au mélange cellulaire du complexe ribonucléoprotéique Cas9. Transférez 26 microlitres de la solution cellulaire de ribonucléoprotéine Cas9 dans les puits individuels d’une bande Nucleocuvette et tapotez doucement la bande pour vous assurer que les échantillons couvrent le fond de chaque puits.

Démarrez ensuite le programme du système 4D-Nucleofector EN138. À la fin de la transduction, laissez les cellules se reposer pendant trois minutes. Ajoutez ensuite 80 microlitres de milieu de culture pré-équilibré dans chaque cuvette et transférez doucement les échantillons dans un flacon par condition à 37 degrés Celsius d’incubation.

Après 48 heures de culture, extrayez l’ADN génomique de cinq fois 10 aux cinq cellules transduites pour le dépistage de la délétion de gènes selon les protocoles standard. Ensuite, stimulez le reste des cellules transduites avec des cellules nourricières fraîches exprimant l’IL21 liées à la membrane dans un rapport de un pour un et extrayez l’ARN après cinq jours de co-culture selon les protocoles standard d’analyse de l’expression génique par PCR quantitative. L’analyse par cytométrie en flux révèle que le programme EN138 permet d’obtenir le pourcentage le plus élevé de viabilité cellulaire et d’efficacité de transduction des programmes de système Nucleofector disponibles.

Par exemple, en utilisant les ARN guides fournis commercialement, HPRT1 humain est éliminé avec succès dans les cellules NK humaines expansées. De plus, les ribonucléoprotéines Cas9 contenant l’ARN2 guide, l’ARN1 guide plus l’ARN2 guide et l’ARN3 guident présentent une inactivation réussie du gène de l’ectodomaine du récepteur TGF-bêta, tandis que l’ARN1 guide seul n’induit aucune délétation d’insertion détectable de T7E1. En effet, l’utilisation du programme EN138 pour l’électroporation de la ribonucléoprotéine Cas9 entraîne une réduction de 60 % de l’expression de l’ARNm du récepteur TGF-bêta deux dans les cellules transduites via ce programme.

De plus, la co-culture des cellules transduites avec du TGF-bêta et une lignée cellulaire primaire de médulloblastome humain n’a pas d’impact significatif sur la cytotoxicité des cellules NK par rapport aux cellules témoins non traitées au TGF-bêta, confrontée à un manque correspondant de fonction du récepteur deux du TGF-bêta dans les cellules modifiées par la ribonucléoprotéine Cas9 au niveau de la protéine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de concevoir plusieurs ARN guides différents pour trouver le meilleur résultat d’édition de gènes.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage de l’ADN ou le test de mutation T7E1 peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’efficacité de l’édition de gènes ou sur la façon de déterminer les mutations génétiques potentielles hors cible. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunothérapie du cancer pour explorer le potentiel de l’utilisation de cellules NK génétiquement modifiées dans le traitement du cancer. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’édition de gènes de cellules NK humaines primaires.

Pour plus d’informations sur l’expansion des cellules NK après ce processus, veuillez consulter notre article précédent sur Jove. N’oubliez pas que travailler avec du sang humain peut être extrêmement dangereux et que des précautions universelles en matière de santé et de sécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.