Tique Microbiome caractérisation par génération 16 s rRNA Amplicon séquençage

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’écologie des maladies à transmission vectorielle, telles que : quel rôle le microbiome vectoriel joue-t-il dans la dynamique des agents pathogènes, et comment les microbiomes vectoriels se forment-ils et varient-ils ? Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle permet une réplication élevée, une résolution et une identification élevées, ce qui permet à l’utilisateur de caractériser avec précision le microbiome vectoriel dans des conditions écologiques et environnementales variables. La démonstration visuelle de cette méthode est importante, car les étapes de configuration du séquençage du microbiome sont difficiles à apprendre, et il existe de nombreux produits et techniques différents, mais peu de ressources disponibles pour apprendre ces étapes.

Commencez cette procédure par la collecte des tiques, comme décrit dans le protocole texte. Pour éliminer les contaminants de surface des tiques, ajoutez 500 microlitres de peroxyde d’hydrogène et faites un vortex pendant 15 secondes. Répétez ce lavage avec 70 % d’éthanol, puis de l’eau distillée deux fois.

Placez les tiques dans un nouveau tube PCR et laissez-les sécher à l’air. Dans ce tube, perturbez mécaniquement les tissus des tiques en écrasant les tiques avec un mortel et un pilon. Purifiez l’ADN de tiques individuelles, en suivant les instructions fournies dans un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce.

Éluer jusqu’à un volume final de 100 microlitres. La création d’un témoin négatif à l’étape de l’extraction est essentielle pour différencier ultérieurement les contaminants suspects des véritables microbes vecteurs. L’utilisation d’une technique stérile pendant l’étape d’extraction et les étapes ultérieures de PCR est également nécessaire pour minimiser l’impact de la contamination courante dans le séquençage 16S.

Configurez la PCR d’amplicon dans une réaction de 27,5 microlitres contenant cinq microlitres de chaque amorce à une micromolaire et 12,5 microlitres de mélange de PCR disponible dans le commerce. Incluez également cinq microlitres d’ADN extrait de tiques individuelles à une concentration de cinq nanogrammes par microlitre. Déplacez les tubes vers un thermocycleur et exécutez le programme répertorié dans le protocole texte.

Une fois la PCR terminée, visualisez le produit de PCR en chargeant quatre à six microlitres par échantillon sur un gel d’agarose à 1,5 %. Recherchez une bande à 460 paires de bases pour confirmer l’amplification. À l’aide d’un nouveau tube PCR pour chaque échantillon, combinez le produit PCR avec de l’eau doublement distillée pour obtenir un total de 60 microlitres.

Pour les échantillons à faible concentration d’ADN, effectuez une PCR d’amplicon en trois exemplaires pour réduire le biais d’amplification et regroupez les échantillons à concentrer. Amenez les billes paramagnétiques à température ambiante et agitez-les bien avant de les utiliser. Ajoutez 48 microlitres de billes paramagnétiques à 60 microlitres de l’échantillon et incubez pendant cinq minutes.

Placez les tubes sur une grille magnétique pendant cinq minutes jusqu’à ce que la solution devienne claire. Ensuite, retirez le surnageant. Avec des tubes sur la grille magnétique, ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 80 % fraîchement préparé.

Immédiatement après avoir ajouté de l’éthanol dans tous les tubes, pipetez le liquide, ne retirez pas les billes. Répétez l’ajout et le retrait de l’éthanol une fois de plus. Faites sécher les échantillons à l’air libre pour éliminer l’excès d’éthanol en laissant les tubes ouverts sur le support magnétique pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que de petites fissures soient visibles dans les billes.

Maintenant, ajoutez 20 microlitres de tampon TE et incubez les échantillons de l’aimant à température ambiante. Après cinq à 10 minutes, remettez les tubes sur l’aimant. Une fois les billes et le liquide séparés, transférez les surnageants dans un tube frais pour obtenir le produit PCR nettoyé.

Attribuez des combinaisons d’amorces uniques à chaque échantillon, en sélectionnant des amorces directes ou inverses ou les deux à partir d’un kit d’index de bibliothèque disponible dans le commerce. Pour fixer les amorces doubles ou les indices aux échantillons, préparez une réaction PCR contenant 2,5 microlitres de chaque amorce, 12,5 microlitres de PCR Master Mix disponible dans le commerce, cinq microlitres d’eau doublement distillée et 2,5 microlitres de produit amplicon nettoyé. Déplacez les tubes vers un thermocycleur programmé comme indiqué dans le protocole texte.

Une fois la PCR terminée, visualisez le produit de PCR en chargeant quatre à six microlitres par échantillon sur un gel d’agarose à 1,5 %. Recherchez une bande à 550 paires de bases pour confirmer l’amplification avant d’effectuer la procédure de nettoyage comme précédemment. Pour effectuer une quantification précise de chaque produit purifié à code-barres, exécutez la qPCR sur chaque échantillon et étalon en trois exemplaires, puis analysez chaque échantillon à trois niveaux de dilution ou plus.

Préparez des réactions qPCR de 10 microlitres contenant six microlitres de qPCR Master Mix, deux microlitres d’eau doublement distillée et deux microlitres de l’échantillon ou de l’étalon. Déplacez la plaque qPCR vers un instrument de PCR en temps réel programmé comme décrit dans le protocole texte et effectuez l’exécution. Après la quantification, créez la bibliothèque combinée en ajoutant des volumes égaux de toutes les bibliothèques individuelles dans un seul tube.

Après avoir dilué et dénaturé la bibliothèque combinée et le contrôle de séquençage, chargez le mélange combiné sur la cellule d’écoulement de séquençage. Nettoyez soigneusement la cellule d’écoulement avant le chargement pour une optique optimale. Ensuite, chargez la cellule d’écoulement sur le séquenceur et effectuez une analyse de séquence d’amplicons.

Les courbes de raréfaction pour la normalisation du nombre de séquences sont illustrées ici. Ces courbes indiquent que la raréfaction à 2000 séquences par échantillon devrait être suffisante pour saisir toute la diversité des unités taxonomiques opérationnelles observées. Après raréfiation et filtrage de qualité des lectures de séquences, la sortie de diversité alpha et bêta est effectuée.

Voici un graphique d’analyse des coordonnées de principe généré automatiquement décrivant comment la composition du microbiome des tiques diffère en fonction du traitement. De plus, la visualisation des microbes présents dans chaque échantillon, montrée ici au niveau de l’embranchement, est automatiquement créée pour tous les échantillons. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir une technique stérile pour minimiser l’effet de la contamination microbienne qui peut avoir un impact critique sur l’interprétation des données de séquence.

Après cette procédure, d’autres méthodes comme la coloration histologique peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que : où se trouvent les microbes observés dans le vecteur ? Après son développement, cette méthode a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’écologie moléculaire pour explorer le rôle des interactions microbiennes au sein du vecteur et étudier comment cela peut affecter la transmission des agents pathogènes.