Name: Reconstitution du cycle cellulaire Oscillations Microemulsions des extraits d’oeufs acellulaire Xenopus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Découvrez la reconstitution des oscillations mitotiques in vitro à l'aide d'extraits d'œufs de Xenopus laevis encapsulés dans des microémulsions eau-dans-huile. Cette technique permet une analyse quantitative à haut débit de la dynamique du cycle cellulaire.

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Nous remercions Madeleine Lu pour construire le plasmide securin-mCherry, Lap homme Lee, Kenneth Ho et Allen P Liu pour les discussions sur la génération de la gouttelette, Jeremy B. Chang et James E. Ferrell Jr permettant de que construire des GFP-NLS. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (Early CAREER Grant #1553031), le National Institutes of Health (MIRA #GM119688) et une bourse de recherche de Sloan.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan.
1. préparation des matériaux de Reconstitution du Cycle cellulaire et de détection
<ol><li>
Assemblée de Gibson clonage pour la construction de l’ADN de plasmide et purification d’ADN messagère de securin-mCherry
	<ol>
<li>Préparer trois fragments d’ADN dont une pMTB2 vecteur colonne vertébrale, securin et mCherry par l’intermédiaire de réaction en chaîne par polymérase (PCR) et gel purification21,22.</li>
		<li>Mesurer les concentrations des fragments à l’aide d’un fluorospectromètre. Mélanger 100 ng d’épines dorsales avec inserts securin et mCherry à un 1:1:1 ratio moléculaire et ajouter de l’eau déionisée pour régler le volume total de réaction à 5 µL.</li>
		<li>Préparer 6 mL de 5 x tampon de réaction Assemblée isotherme avec 3 mL de 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 300 µL de 1 M du MgCl2600 µL de dNTP 10 mM, 300 µL de 1 M, TNT, 1,5 g de PEG-8000 et 20 mg de NAD23.</li>
		<li>Ajouter les fragments combinés à un 15 µL de 1 x Assemblée isotherme tampon de réaction aliquote. Incubez la réaction dans un tube de réaction PCR à 50 ° C pendant 15 minutes.</li>
		<li>Faire un gel d’agarose 0,8 % gel et courir avec une tension de 10 V/cm pour vérifier l’efficacité de recuit de ces fragments.</li>
		<li>Purifier le plasmide construit et éluer avec 15 µL d’eau exempte de RNase. Transformer 1 µL de l’ADN de plasmide purifié dans 50 µL de DH5α compétent e. coli cellules24 pour une utilisation future.</li>
		<li>Extraire et purifier l’ADN de securin-mCherry de la DH5α compétentes d' Escherichia coli de plasmide des cellules.</li>
		<li>Transcrire l’ADN de plasmide linéarisé securin-mCherry en ARNm et purifier les ARNm. Un spectrophotomètre permet de vérifier que la concentration de l’ARNm est supérieure à 100 ng/µL et le rapport de l’absorbance à 260 nm et 280 nm est environ 2.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de demembranated Xenopus laevis sperme ADN Remarque : Une adaptation de Murray 19911.<ol>
<li>Euthanasier mâle adulte Xenopus laevis25 et disséquer les testicules du quatre grenouilles mâles26,27.</li>
		<li>Placez les testicules de quatre grenouilles dans la même boîte de Pétri de 100 mL. Rincer les testicules trois fois dans 50 mL de la solution froide de x MMR 1 (0,1 M NaCl, KCl 2 mM, 1 mM de MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA).</li>
		<li>Retirer les testicules dans une boîte de Pétri 100 mL de sang excédentaire et la graisse et puis laver deux fois dans le tampon de préparation nucléaire froide (CNLC) (250 mM saccharose, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8,0, TRIHYDROCHLORURE de la spermidine 0,5 mM, 0,2 mM spermine tétrahydrochlorure).</li>
		<li>Retirer le tampon de préparation nucléaire (CNLC) et couper les testicules en morceaux avec des longueurs inférieures à 0,2 cm à l’aide de ciseaux pointus de dissection dans une boîte de Pétri de 100 mL. Ajoutez 8 mL de NPB froid aux testicules pour davantage de ventilation.</li>
		<li>Utilisation en nylon mesh tissus avec une taille de pore de 70 µm pour filtrer les testicules et recueillir l’échantillon de sperme dans un tube conique de 15 mL. Tournez en bas les spermatozoïdes recueillis à 1 730 x g pendant 10 minutes à 4 ° C et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Fournir les spermatozoïdes avec 1 mL de la CNLC et 50 µL de 10 mg/mL lysolécithine et incuber à température ambiante pendant 5 min pour les spermatozoïdes demembranate.</li>
		<li>Laver le sperme demembranated ADN avec 10 mL de la CNLC froide avec la solution de BSA 3 % trois fois.</li>
		<li>Mesurer la densité du sperme ADN avec un hémocytomètre.</li>
		<li>Congeler le sperme ADN dans 5 µL d’extraits dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C. La concentration optimale de sperme ADN est environ 105 noyaux/µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purification de protéine du Signal de localisation nucléaire GFP (GFP-NLS)
	<ol>
<li>Transformer le plasmide GST-tag GFP-NLS BL21 (DE3) compétentes d' e. coli cellules5.</li>
		<li>Incuber les cellules sans antibiotiques à 37 ° C pendant 1 h et qui se répand sur une plaque de gel d’agarose LB avec de l’ampicilline 100 µg/mL.</li>
		<li>Incuber les plaques à 37 ° C pendant 14 à 18 heures pour devenir les cellules des colonies individuelles. Choisissez et ensemencer les colonies individuelles dans 4 mL de médias LB avec de l’ampicilline 100 µg/mL. Agiter les cellules à 37 ° C pendant 12 heures.</li>
		<li>Préparer les médias YT autoclavés (16 g de Bacto-tryptone, 10 g d’extrait de Bacto-levure, 5 g de NaCl) et chauffer les médias YT à 37 ° C.</li>
		<li>Ensemencer 1 mL des cellules incubés une nuit ou Pluss dans les milieux LB dans 250 mL de médias de YT préchauffés avec de l’ampicilline 100 µg/mL et agiter pendant 2 heures augmenter la densité de la cellule.</li>
		<li>Mesurer la densité optique (do) toutes les 30 minutes, à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm. Ajouter 0,1 mM IPTG en cellules d’induire l’expression de la protéine GFP-NLS lorsque la valeur do atteint 0,1.</li>
		<li>Secouer les cellules à 18 ° C durant la nuit pour réduire les taux de croissance de cellules et permettre la synthèse et la meilleure expression de la protéine.</li>
		<li>Tournez en bas les cellules à 34 524 x g à 4 ° C pendant 5 minutes et enlever le surnageant.</li>
		<li>Remettre en suspension les granules cellulaires dans 40 mL de tampon PBS (fournie avec 800 µL du lysozyme 50 mg/mL, 100 µL de PMSF, 13,2 µL d’un mélange de 10 mg/mL de leupeptine, pepstatine et chymostatine et 8 µL d’EDTA 0,5 M 0,2 M) et incuber à 4 ° C pendant 20 minutes.</li>
		<li>Briser les cellules en utilisant un sonicateur à une fréquence de 20 kHz pour 4 x 30 s, avec des intervalles de 30 s entre chaque sonication, de libérer a exprimé la protéine GFP-NLS.</li>
		<li>Tourner à 20 000 x g pendant 35 minutes pour éliminer les cellules cassées.</li>
		<li>Chromatographie d’affinité permet d’extraire et de purifier la protéine GFP-NLS.</li>
		<li>Laver le lisier de perle de 1,5 mL trois fois avec 15 mL de tampon PBS et incuber 250 mL de lysat de perles pendant 4 heures à 4 ° C, avec une inversion.</li>
		<li>Tournez en bas les perles à 2000 x g pendant 5 min et ajouter 10 mL de solution de lavage (25 mM Tris base, pH 7.5, NaCl, 500 mM et 5 mM DTT) à perles. Incuber les perles dans 700 µL de tampon d’élution (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM réduit glutathion et 5 mM TNT) avec rotation à 4 ° C. Prélever une partie aliquote de l’élution avec un volume de 50 µL.</li>
		<li>Mesurer la concentration de protéines collectées en exécutant un gel bleu de Coomassie28.</li>
		<li>Éluer les protéines à l’aide de PD-10 colonnes avec 3 mL de tampon de conservation (20 mM HEPES, 150 mM de KCl, 10 % de glycérol, pH = 7,7) par l’échange de la mémoire tampon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation du cyclisme Xenopus extraits
Remarque : La procédure globale de préparation des extraits est illustrée dans la Figure 1 a. Adapté de Murray 19911.
<ol><li>Trois femelles matures Xenopus laevis à injecter avec 66 IU gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG) 10 jours avant la ponte.</li>
	<li>Ces grenouilles Xenopus injecter 500 UI de gonadotrophine chorionique humaine (HCG) pour induire la ponte 18 heures avant la préparation des extraits de cyclisme.</li>
	<li>Jeter des œufs du jour au lendemain. Après des expériences (données non présentées), extraits préparés à partir des oeufs fraîchement pressés génèrent des activités plus durables que les extraits préparés à partir des œufs de la grenouille femelle même. Presser les oeufs de chaque femelle grenouille dans 100 mm plats de Pétri contenant 10 mL de tampon de x MMR 0,2 et l’examiner sous un microscope stéréo.</li>
	<li>Jeter les lots de œufs qui n’ont pas claires frontières entre animal et vegetal pôles ou ont des taches blanches irrégulières sur le dessus de pôles de l’animal.</li>
	<li>Choisissez le lot d’oeufs dans une grenouille femelle présentant une population homogène des oeufs avec animal bien différenciée et pôles vegetal et transférer les oeufs dans un bécher de 600 mL.</li>
	<li>Vider l’excès de tampon x MMR 0,2 et ajouter doucement 250 mL de 2 g par 100 mL cystéine (pH = 7,7) 1 x extrait tampon (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, saccharose 50 mM, pH = 7,7) aux œufs.</li>
	<li>Agiter les œufs vigoureusement à la main et retirer les couches de gelée d’oeufs sur trois lavages avec un volume total de 800 mL de cystéine tampon pendant 3 minutes ou jusqu'à ce que d’oeufs ensemble et s’installer au fond du bécher, indiquant que l’enlèvement de couche de gelée est réussie.</li>
	<li>Laver les œufs avec 1 L de 0,2 x MMR solution plus de quatre fois.</li>
	<li>Ramasser et jeter les oeufs qui deviennent blancs à l’aide d’une pipette en verre.</li>
	<li>Videz la mémoire tampon de ROR et approvisionnement oeufs 200 ml de 0.1 ionophore calcique de µg/mL solution A23187 dans 0,2 x MMR tampon pour l’activation.</li>
	<li>Du côté de la grande ouverture de la pipette de verre permet de mélanger les œufs doucement jusqu'à ce que les oeufs sont activés et retirez la solution ionophore calcique.</li>
	<li>Vérifier l’efficacité d’activation après que oeufs s’installent au fond du bécher. Les oeufs bien activés ont environ 25 % du pôle animal et 75 % du pôle végétal.</li>
	<li>Lavez les oeufs activés deux fois avec 50 mL de 1 x tampon extrait additionné d’inhibiteurs de la protéase (10 µg/mL chacune de leupeptine, pepstatine et chymostatine).</li>
	<li>Transvaser avec soin des oeufs à un microtube de 0,4 mL bouchon-pression et ensuite emballer les œufs par centrifugation à 200 x g pendant 60 secondes et puis 600 x g pendant 30 secondes.</li>
	<li>Retirez le tampon supplémentaire sur le dessus des oeufs à l’aide d’une pipette Pasteur en verre afin de réduire la dilution des extraits.</li>
	<li>Écraser les oeufs à 15 000 x g pendant 10 minutes à 4 ° C.</li>
	<li>Couper les tubes avec une lame de rasoir pour séparer les trois couches d’oeufs écrasés et garder le cytoplasme brut dans la couche intermédiaire.</li>
	<li>Transférer le cytoplasme brut dans nouveaux tubes d’ultracentrifugeuse et compléter avec des inhibiteurs de la protéase et la cytochalasine B à 10 µg/mL de chaque.</li>
	<li>Centrifuger le cytoplasme brut à nouveau à 15 000 x g à 4° C pendant 5 minutes pour purifier davantage cytoplasme en enlevant le jaune d’oeuf et les excès de lipides.</li>
	<li>Garder des extraits fraîchement préparés sur la glace.</li>
</ol>3. génération de gouttelette
<ol><li>
Préparation de chambre de verre 2D NOTE : Les tubes de verre rectangle servent de chambres qui confinent les gouttelettes dans un seul plan en 2 dimensions, permettant une observation plus facile et la collecte de données.<ol>
<li>Couper les tubes en verre rectangle dont une dimension intérieure de 2 mm x 100 µm en 4 mm longs morceaux. Utiliser le tranchant d’une pierre à aiguiser, marquer les limites désirées sur la surface extérieure du tube en verre avec lumière gravures, puis exercez une légère pression des deux côtés des gravures à se détacher des morceaux de tubes de verre.</li>
		<li>Préchauffer un incubateur bain sec à 95 ° C. Retirez le bloc chauffant et placez-le dans un dessiccateur à vide en polycarbonate.</li>
		<li>Placer un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 30 µL du trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane dans le bloc de chauffage. Les tubes de verre taillé dans le dessiccateur à vide se situait à environ 5 cm pour le bloc de chauffage.</li>
		<li>Connectez le dessiccateur à une pompe à vide. Mettre en marche la pompe pendant une minute atteindre le niveau de vide souhaité, puis fermez la vanne 3 voies pour sceller le dessiccateur et laisser la vapeur de silane trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) enduire la paroi intérieure des tubes de verre. Cela créera un environnement hydrophobe pour stabiliser les gouttelettes.</li>
		<li>Laisser les tubes de verre à l’intérieur du dessiccateur pour revêtement pendant la nuit. Les tubes seront prêts à l’emploi le lendemain.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagerie et génération de gouttelettes Remarque : Les procédures de génération de gouttelettes et d’imagerie sont illustrées dans les Figures 1 b et 1c.<ol>
<li>Fournir les extraits préparés à l’étape 2 à 10 ng/µL ARNm securin-mCherry pour les expériences de cycle de cellules cytoplasmiques seule simple. Par ailleurs, extraits d’approvisionnement avec la chromatine de sperme demembranated (250 par µL de l’extrait), protéine de GFP-NLS 10 µM et 10 ng/µL ARNm securin-mCherry pour créer des micro-gouttelettes qui présentent une morphologie de noyaux périodique change.</li>
		<li>Dans un tube de microtubes de 1,5 mL, mélange 20 µL de l’extrait fourni avec la protéine recombinante ou ARNm avec 200 µL de 2 % perfluoropolyéthers-polyéthylène glycol (PFPE-PEG) FLUOROTENSIOACTIF en HFE7500 fluorés huile.</li>
		<li>Générer des gouttelettes à l’aide d’un agitateur Vortex. La gamme de tailles de gouttelettes peut être modulée par la durée et la vitesse du vortex. Pour créer des gouttelettes avec rayons allant de 50 à 200 µm, régler la vitesse du vortex à 56 x g (3 200 tr/min avec un rayon de 4,9 mm) et appuyez doucement sur le tube de microcentrifuge contenant l’extrait et le mélange d’agent tensio-actif sur le mélangeur pendant 3,5 secondes. Inspecter visuellement si les gouttelettes sont de taille uniforme.</li>
		<li>Utiliser une pipette de 20 µL pour transférer les gouttelettes flottant sur le dessus et un volume égal de surfactant PFPE-PEG dans un tube PCR. Plonger le tube en verre préparé de l’étape dans la couche gouttelette dans tube microtubes de 1,5 mL et attendre jusqu'à ce que les gouttelettes ont rempli environ 75 % du tube, puis abaissez le tube dans la couche agent tensio-actif jusqu'à ce que le tube est complètement rempli. Ceci baisser la densité de la gouttelette et permettra les gouttelettes former une seule couche à l’intérieur de la chambre sans chevauchement ou forme distorsion causée par le surpeuplement.</li>
		<li>Remplissez un plat de fond de verre d’un diamètre de 40 mm avec huile minérale. Plonger les tubes remplis de gouttelettes dans l’huile en les poussant doucement vers le bas à l’aide d’une pince fine.</li>
		<li>Après le chargement tous les échantillons, utiliser un verre pipette pour enlever toute saleté visible ou ont fui de gouttelettes. Rajouter de l’huile minérale si les tubes ne sont pas ou ne seront pas être complètement immergés dans le processus d’imagerie.</li>
		<li>Conduite d’imagerie des gouttelettes sur un microscope à épifluorescence équipé d’une platine motorisée x-y (voir Table des matières). Utiliser un objectif d’air 4 X pour tous de l’imagerie. Pour l’imagerie de fluorescence, utilisez une 130 lampe à arc court W mercure vapeur comme source de lumière de fluorescence pour l’éclairage et un filtre GFP (excitation 482/35 nm et émission 514/LP nm) et un filtre de mCherry set (excitation 562/40 nm et émission 641/75 nm) pour l’imagerie Signaux de GFP-NLS et securin-mCherry.</li>
		<li>Enregistrer des vidéos time-lapse dans le champ lumineux et plusieurs canaux fluorescence toutes les 6 à 9 minutes jusqu'à ce que les gouttelettes perdent leur activité.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. traitement et analyse des données de l’image
<ol><li>
Segmentation et le suivi des gouttelettes
	<ol>
<li>Importer des données enregistrées dans le format de « .tif » ou « .oif » dans le logiciel d’analyse image (voir la Table des matières).</li>
		<li>Segmenter les gouttelettes unique en utilisant le canal de champ lumineux. L’image du champ lumineux affichera gouttelettes comme des cercles lumineux des bornages sombre. Appliquer seuillage à l’image. Ajouter une surface de suivi à chaque gouttelette en syntonisant le seuil entre les pixels sombres et claires, afin que chaque surface couvre toute la surface de la goutte correspondante.</li>
		<li>Suivre automatiquement les segments entre cadres adjacents en utilisant l’algorithme de motion autorégressif. Régler la distance de déplacement maximale acceptable d’une goutte entre deux images adjacentes plus petit que le rayon de la plupart des gouttelettes pour suivre précisément les petites gouttelettes.</li>
		<li>Vérifier visuellement toutes les pistes à travers toute la vidéo pour détecter les segmentations incorrectes ce segment de l’espace vide entre les gouttelettes au lieu de gouttelettes réelles. Supprimez manuellement les titres incorrects.</li>
		<li>Zone d’arrière-plan du segment et la voie ferrée sans les gouttelettes pour obtenir l’intensité de fluorescence de fond. Pour améliorer le signal-bruit, soustraire intensité du fond de l’intensité de la fluorescence de gouttelettes à chaque laps de temps.</li>
		<li>Exporter des paramètres mesurés pour chaque piste avec le temps, y compris la moyenne et l’écart de l’intensité de la fluorescence et la zone de gouttelettes dans les fichiers « .csv ».</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse des données de la période de taille et oscillation de gouttelettes
	<ol>
<li>Charger les fichiers « .csv » dans R pour créer des parcelles de l’intensité de la fluorescence au fil du temps pour chaque gouttelette. Gouttelette record ID dans un fichier « .csv ».</li>
		<li>Importer les fichiers « .csv » exportés par le logiciel d’analyse et le fichier « .csv » avec une liste d’ID de gouttelettes dans Matlab et d’enregistrer sous forme de fichiers « .mat » pour une analyse ultérieure des données.</li>
		<li>Calculer le volume d’une goutte de comprimé basé sur les informations de zone de gouttelettes exporté après que la segmentation et la hauteur du verre chambre19. Le volume permet de calculer le rayon de la goutte comme une sphère.</li>
		<li>Extraire les points dans le temps des hauts et des bas à l’aide d’algorithme de détection de pics/creux. Effectuer des corrections manuelles sur la position des pics et les creux pour s’assurer qu’ils sont correctement détectés.</li>
		<li>Pour calculer la période du cycle cellulaire, calculer l’intervalle de temps entre deux pics adjacents. Prendre la moyenne de tous les intervalles pour chaque gouttelette sa période du cycle cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

Nous avons présenté une nouvelle méthode pour développer un système de cellule artificielle haut débit cette reconstitution in vitro permet et le suivi à long terme des oscillations auto-entretenue cycle cellulaire au niveau de single-cell. Il y a plusieurs étapes critiques qui font de cette méthode avec succès. Oeufs de Xenopus tout d’abord, fraîchement pressés avec une bonne qualité, comparativement aux œufs, ont tendance à produire des extraits avec activité d’oscillation de plus longue durée. Deuxiè...

Extraits cytoplasmiques, préparés à partir d’oeufs de Xenopus laevis représentent un des modèles plus prédominants pour l’étude biochimique des cycles cellulaires, étant donné le volume important d’ovocytes, la progression du cycle cellulaire rapide et la capacité de reconstitution événements mitotique in vitro1,2. Ce système a permis la découverte initiale et la caractérisation mécaniste des régulateurs de cycle cellulaire essentiel comme facteur favorisant la maturation (MPF) ainsi que des processus mitotiques en aval, y compris la broche Assemblée et chromosome ségrégation1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Les extraits d’oeufs de Xenopus ont également été utilisés pour la dissection détaillée des réseaux de régulation du cycle cellulaire horloge8,12,13,14 et pour les études sur les lésions de l’ADN /Replication checkpoint15 et le fuseau mitotique Assemblée checkpoint16,17,18.
Ces études de cycles cellulaires en utilisant les extraits d’oeufs de Xenopus reposent principalement sur des mesures en vrac. Cependant, tests de réaction classique en vrac ne peuvent pas imiter des comportements de cellule réelle, étant donnés un écart important dans leurs dimensions et la compartimentation spatiale subcellulaire de molécules de réaction. En outre, en vrac les mesures d’activité mitotique sont sujettes à donner un nombre limité de cycles avant amortissement rapidement8. Ces inconvénients de réactions en vrac ont empêché le système extrait pour approfondir la compréhension des fonctions et des propriétés dynamiques complexes horloge. Des études récentes ont encapsulé acellulaire cytostatique (CSF) de facteur-arrêté Xenopus extrait19,20 dans alvéolaire compartiments taille définie, qui ont contribué à élucider comment taille broche est modulée par la volume cytoplasmique. Cependant, ce système in vitro est arrêté à la métaphase de la méiose II par l’action du facteur cytostatique1, et un système capable des oscillations soutenues à long terme au niveau de la cellule unique est nécessaire pour une enquête plus approfondie du cycle cellulaire oscillateur.
Afin d’étudier les oscillations du cycle cellulaire avec une cellule unique résolution, nous avons développé une échelle cellulaire, système de haut-débit pour la reconstitution et la mesure simultanée de plusieurs processus auto-entretenu d’oscillatoires mitotiques en microémulsion individuelle gouttelettes. Dans ce protocole vidéo détaillé, nous démontrons la création du système d’oscillation mitotique artificiel en encapsulant cyclisme cytoplasme d’oeufs de Xenopus laevis dans micro-émulsions de tailles allant de 10 à 300 µm. Dans ce système, les oscillations mitotiques y compris la condensation des chromosomes et dé-condensation, ventilation de l’enveloppe nucléaire et réforme et la dégradation et synthèse des substrats de l’anaphase (p. ex., securin-mCherry dans le présent protocole) ont été reconstitué avec succès.

<table><tbody><tr><td>Xenopus laevis grenouilles</td><td>Xenopus-I Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep</td><td>kit QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3)-T-1 cellule compétente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2935</td><td></td></tr><tr><td>Ionophore de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A23187</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Trichloro</td></tr><tr><td></td><td>toxique Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Toxique</td></tr> <tr><td>(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFPE-PEG tensioactif</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare Glutathion Sepharose 4B billes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Colonne-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Tube miniature en verre creux VitroCom</td><td>VitroCom</td><td>5012</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope Olympus SZ61</td><td>Microscope Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX83 Microscope</td><td></td> confocal Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1200</td><td>Spectrophotomètre NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mL Microtubes à capuchon pression</td><td>E& K Scientific</td><td>485050-B</td><td></td></tr><tr><td>Mini Kit d’ARN PureLink</td><td>ThermoFisher (Ambion)</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Mélangeur Vortex Analogique</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td></td><td>Bitplane Version 7.3</td><td>Logiciel d’analyse d’images</td></tr></tbody></table>

reconstitution du cycle cellulaire oscillations microemulsions des extraits d’oeufs acellulaire xenopus

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Mesure en temps réel des oscillations au niveau unicellulaire est important afin de découvrir les mécanismes de l’horloge biologique. Bien que les extraits en vrac préparés à partir d’oeufs de Xenopus laevis ont été puissantes en disséquant les réseaux biochimiques sous-jacentes de la progression du cycle cellulaire, leur mesure moyenne de l’ensemble mène habituellement à une oscillation amortie, en dépit de chacun chaque oscillateur étant maintenue. C’est en raison de la difficulté d’une synchronisation parfaite entre les oscillateurs individuels dans les systèmes biologiques bruyants. Pour récupérer la dynamique de cellules individuelles de l’oscillateur, nous avons développé un système de cellule artificielle axée sur les gouttelettes qui peut reconstituer les cycles mitotiques dans les compartiments alvéolaire encapsulant cyclisme extraits cytoplasmiques des oeufs de Xenopus laevis . Ces cellules cytoplasmiques seule simples pièce oscillations soutenues pendant plus de 30 cycles. Pour construire des cellules plus complexes avec des noyaux, nous avons ajouté la chromatine de sperme demembranated pour déclencher des noyaux auto-assemblage dans le système. Nous avons observé une évolution périodique du chromosome condensation/décondensation et noyaux enveloppent ventilation/reformation, comme de véritables cellules. Cela indique que l’oscillateur mitotique fonctionne fidèlement pour piloter plusieurs événements mitotiques en aval. En même temps, nous avons suivi la dynamique de l’oscillateur mitotique et des processus en aval dans les gouttelettes individuels à l’aide de la microscopie en fluorescence Time-lapse multicanaux. Le système cell-cycle artificiel fournit un cadre de haut-débit pour manipulation quantitative et l’analyse des oscillations mitotiques résolution unicellulaire, qui probablement fournit des renseignements importants sur les mécanismes réglementaires et les fonctions de l’horloge.

Dans la Figure 2, nous montrent que ce protocole produit des oscillations mitotiques dans les cellules simples, dénucléarisé ainsi que compliqué des cellules avec des noyaux, où l’oscillateur pousse l’alternance cyclique de déformation et de la formation des noyaux. Les gouttelettes de noyaux libres génèrent mitotiques oscillations jusqu'à 30 cycles non amortie pendant la période de 92 heures, comme en témoigne la synthèse périodique et la dégradation d’une f...

Nous présentons une méthode pour la production d’in vitro auto-entretenue oscillations mitotique au niveau unicellulaire en encapsulant les extraits d’oeufs de Xenopus laevis dans eau-dans-huile microémulsions.

Reconstitution du cycle cellulaire Oscillations Microemulsions des extraits d’oeufs acellulaire Xenopus

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie du système, telles que le mécanisme de régulation derrière le réseau mitotique et les propriétés dynamiques et les fonctions de l’horloge cycle cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle générera une grande quantité de gouttelettes avec plusieurs cycles cellulaires dans chacun d’eux, nous fournissant un cadre à haut débit pour la manipulation quantitative et l’analyse. Pour commencer, jetez des lots d’œufs qui ont des limites peu claires entre les pôles animaux et végétaux ou des taches blanches irrégulières sur le dessus des pôles animaux.Ensuite, sélectionnez un lot approprié d’œufs d’une grenouille femelle et transférez les œufs dans un bécher de 600 millilitres. Verser un excès de tampon 0,2 x RRO, et ajouter doucement la cystéine dans 1x tampon extrait pour les œufs. Après cela, secouez vigoureusement le bécher à la main pour enlever les couches de gelée des œufs.Répétez ce lavage trois fois avec un total de 800 millilitres de tampon de cystéine ou jusqu’à ce que les œufs s’agrègent et s’installent au fond du bécher. Après l’enlever la couche de gelée, laver les œufs quatre fois dans un litre de solution 0,2 x RRO. Utilisez une pipette en verre pour ramasser et jeter les œufs qui deviennent blancs.Versez le tampon RRO hors du bécher et ajoutez 200 millilitres de solution d’ionophore de calcium dans les œufs. Utilisez une pipette en verre pour remuer doucement les œufs jusqu’à ce qu’ils soient activés, et retirez la solution d’ionophore de calcium. Laisser les oeufs dans la solution d’ionophore de calcium pendant trop longtemps initiera l’apoptose.Nous remuer les œufs pendant 1,5 minutes et vérifier l’efficacité de l’activation. S’ils ne sont pas activés, reprendre en remuant, et vérifier plus fréquemment jusqu’à ce que 90% d’activation est atteint. Une fois que les œufs se déposent au fond du bécher, vérifiez l’efficacité de l’activation.Les œufs bien activés ont environ 25% du pôle animal et 75% du pôle végétal. Ensuite, lavez les œufs deux fois avec un volume total de 50 millilitres de tampon d’extrait complété par des inhibiteurs de la protéase. Ensuite, transférez soigneusement les œufs sur un microtube snap-cap de 0,4 millilitre.Centrifuger le microtube pendant 60 secondes à 200 g, puis à 600 g pendant 30 secondes pour emballer les œufs. Ensuite, utilisez une pipette pasteur en verre pour enlever l’excès de tampon sur les œufs après chaque étape. Après ça, écraser les oeufs à 15 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Utilisez une lame de rasoir pour couper les tubes pour séparer les trois couches d’œufs écrasés et garder le cytoplasme brut dans la couche moyenne. Ensuite, transférez le cytoplasme brut pour nettoyer les tubes d’ultracentrifugeuse. Compléter le cytoplasme avec des inhibiteurs de la protéase et de la cytochalasine B à 10 microgrammes par millilitre chacun.Centrifugeuse le cytoplasme brut à 15 000 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour couper le tube et garder le cytoplasme dans la couche moyenne. Déposer les extraits fraîchement préparés sur la glace.Tout d’abord, ajouter l’ARNm securin-mCherry aux extraits préparés. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de fluorosurfactant FPPE-PEG à 2 % au mélange extrait d’ARNm. Utilisez un mélangeur vortex pour générer des gouttelettes, en ajustant la vitesse et la durée du vortex au besoin.Ensuite, inspectez visuellement les gouttelettes pour vous assurer qu’elles sont de taille uniforme. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, transférer les gouttelettes flottant sur le dessus et un volume égal de surfactant dans un tube PCR. Tremper un tube de verre dans la couche de gouttelettes et attendre que les gouttelettes remplissent environ 75 % du tube.Ensuite, poussez le tube dans la couche de surfactant, et remplissez le tube complètement. Ensuite, remplissez un plat à fond de verre d’huile minérale. Ensuite, utilisez de fines pinces à épiler pour plonger le tube rempli de gouttelettes dans l’huile.Utilisez une pipette en verre pour enlever les débris visibles ou les gouttelettes qui fuient. Pour éviter le mouvement et les fuites de gouttelettes, le tube de verre rempli de gouttelettes doit être immergé sous l’huile minérale avec soin. Nous pouvons soit pousser le tube sur les deux extrémités avec l’équilibre ou ajouter quelques gouttes d’huile minérale sur les extrémités du tube simultanément en premier.Après cela, utilisez un microscope à épifluorescence équipé d’un stade xy motorisé pour imager les gouttelettes. Enregistrez des vidéos en accéléré dans le champ lumineux et de multiples canaux de fluorescence toutes les six à neuf minutes jusqu’à ce que les gouttelettes perdent leur activité. En utilisant ce protocole, l’oscillation mitotic dans les cellules simples et nucléaires-libres et les cellules compliquées avec des noyaux ont été produites.Les gouttelettes sans noyaux ont généré une oscillation mitotique jusqu’à 30 cycles non amortis en 92 heures. La capacité de l’oscillateur mitotic de conduire des événements mitotiques en aval a également été examinée. L’oscillateur mitotique auto-soutenu a conduit les changements de morphologie nucléaire observés par l’altération autonome des phases distinctes de cycle cellulaire.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler à l’esprit le moment où faire l’extrait, car il est sensible au temps, et toujours garder les oeufs et l’extrait sur la glace. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie du système pour explorer les principes fondamentaux des propriétés complexes de l’horloge, comme la tunabilité et la stochasticité à Xenopus laevis.

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Découvrez la reconstitution des oscillations mitotiques in vitro à l'aide d'extraits d'œufs de Xenopus laevis encapsulés dans des microémulsions eau-dans-huile. Cette technique permet une analyse quantitative à haut débit de la dynamique du cycle cellulaire.

Reconstitution du cycle cellulaire Oscillations Microemulsions des extraits d’oeufs acellulaire Xenopus

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