Générant des Homo - et xénogreffe entre la pastèque et la gourde pour l’étude des microARN froid-sensible

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la réponse miRNA à la capacité de stress dans les greffes de plantes telles que la façon dont miRNA sont réglementés sous le stress froid dans les greffes de gourde bouteille pastèque. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est une méthode très efficace et reproductible pour fabriquer de l’homo et des hétérogreffes. Il ne nécessite pas d’équipement spécifique, il est très facile à effectuer, et se traduit généralement par un taux de survie très élevé de la greffe.

Grâce à cette méthode, peut fournir un aperçu de la réponse miRNA au stress dû au froid dans le système de greffe de gourde de bouteille de pastèque. Il peut également être appliqué à d’autres organismes modernes pour révéler les mécanismes du transport local et à longue distance miRNA. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car les étapes de greffe sont difficiles à apprendre.

Cette étape exigeait des compétences avancées et est essentielle à la survie des plantes greffées. Pour commencer, tremper les graines de gourde dans un bécher de 500 millilitres de 58 degrés Celsius d’eau. Remuer les graines de temps en temps jusqu’à ce que la température de l’eau descende à 40 degrés Celsius.

Pendant que l’eau refroidit, mettez trois kilogrammes de terre tourbe dans un sac en nylon et autoclavez-la. Une fois que l’eau atteint la température ambiante, rincer les graines deux à trois fois dans de l’eau distillée et égoutter l’excès d’eau. Laissez les graines germer dans un sac de gaze à 28 degrés Celsius dans la chambre de croissance sombre.

Après la germination, semer les graines dans des pots en plastique remplis du sol tourbeux stérilisé. Lorsque les semis de gourde de bouteille développent deux cotyléons aplatis, répétez ce processus avec des graines de pastèque. Faire pousser la gourde de bouteille et les semis de pastèque dans une chambre de croissance.

Ajouter de l’eau aux semis une fois par jour l’après-midi. Ensuite, couper les hypocotyls des semis de pastèque de deux à trois centimètres sous les cotyléons. Couper le dessus des semis de gourde de bouteille sur le côté, immédiatement au-dessus des cotyléons.

Ensuite, utilisez un cure-dent pour faire un trou dans le haut des semis de gourde de bouteille taillés. Insérez les plants de pastèque taillés dans le trou pour faire des hétérogreffes. Après cela, préparer des homogreffes en utilisant la méthode précédemment décrite.

Tout d’abord, envelopper les semis greffés dans des sacs transparents en polyéthylène pour maintenir une humidité relativement élevée. Ensuite, maintenez les semis enveloppés dans une chambre de croissance pendant sept jours. Après le septième jour, retirer les sacs et laisser pousser les plantes dans les mêmes conditions pendant sept à dix jours.

Divisez les semis en deux groupes, l’un pour les traitements contre le rhume et l’autre pour le contrôle. Remettre les semis de contrôle dans les mêmes conditions environnementales. Placez les semis traités à froid dans une chambre de croissance réglée à six degrés Celsius avec les mêmes conditions sombres et légères que le groupe témoin.

Après 48 heures, laissez les échantillons du scion et des porte-greffes des greffes. Congelez immédiatement les échantillons dans de l’azote liquide et conservez-les à moins 70 degrés Celsius. Transférer l’échantillon congelé dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres dans de l’azote liquide.

Ajouter une perle en acier inoxydable à chaque tube d’échantillon et homogénéiser les tissus à une poudre fine. Pour chaque combinaison de greffage, prenez des quantités égales d’échantillon moulu à partir de 10 semis et mélangez-les dans un tube de centrifugeuse de 10 millilitres. Ajouter une quantité appropriée de reagent d’hydrochlorure de guanidium.

Ensuite, ajoutez un à 150 unités par millilitre à 37 degrés Celsius sans ARN pendant une heure. Déterminez ensuite la quantité totale d’ARN sur un système d’électrophorésie microcapillaire. Après cela, décongelez les réaccateurs et adaptateurs de normalisation de la bibliothèque.

Puis ligate petit RNase avec les cinq adaptateurs premier et trois premiers, et elute et les purifier. Reverse transcrire les cinq premier et trois premier ligated petite RNase suivant les directives du fabricant. Ensuite, effectuez l’amplification PCR suivant le protocole du fabricant.

Ensuite, utilisez le système d’électrophoresis microcaillary pour s’assurer que le nombre d’intégrité de l’ARN est supérieur à sept. Chargez un microlitre d’une bibliothèque d’ARN sur le système d’électrophoresis microcapillllaire pour s’assurer que le numéro d’intégrité de l’ARN est supérieur à sept. Enfin, séquencez les petites bibliothèques d’ARN sur un instrument de séquençage à haut débit.

En utilisant ce protocole, un taux de survie de 98% pour la greffe et les phénotypes pour la température ambiante et les conditions de stress froid ont été obtenus. les ARN de 24 nucléotides ont composé la plus grande classe d’ARN dans toutes les combinaisons de greffage, indépendamment du traitement de température. Après 48 heures de traitement à froid, 30 et 268 microARN ont été régulés de haut en bas, respectivement.

Dans les feuilles de la scion dans les hétérogreffes, inversement, dans les feuilles du porte-greffe, 31 et 12 microARN étaient de haut en bas-réglés, respectivement. Dans les homogreffes de pastèque-pastèque, 64 et 83 microARN ont été vers le haut et vers le bas-réglés, respectivement. Ceci a démontré que l’hétérogreffe a causé la reprogrammation profonde des expressions de microARN.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler la taille relative et l’âge de la tige de fille et le scion est essentiel pour faire une greffe réussie. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le séquençage de lncRNA, le profilage protéomique peuvent être effectuées afin d’étudier la régulation de l’ARNl et des protéines et le système de codage dans le système de greffage. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine de la tolérance abiotique des plantes pour explorer le mécanisme de l’avantage de greffe de plantes à Cucurbitaceae et au-delà.

N’oubliez pas que le travail avec l’hydrochlorure de guanidine peut être extrêmement dangereux et des précautions appropriées doivent toujours être prises avec l’exécution de cette procédure.