Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

Nous présentons ici les protocoles afin d’identifier les immunomodulateurs 1) virus codé qui favorisent la réplication arbovirus et facteurs de l’hôte 2) eucaryotes que restreignent la réplication des arbovirus. Ces méthodes à base de fluorescence et de luminescence aux chercheurs d’obtenir rapidement des afficheurs quantitatives de réplication arbovirus dans les essais simplistes avec des rapports signal sur bruit faibles.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie virale, telles que les facteurs de l’hôte qui restreignent la réplication des arbovirus et, à leur tour, les protéines d’évasion immunitaire codées par le virus qui surmontent ces mécanismes de restriction de l’hôte. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’utiliser des tests simplistes de luminescence et d’espace fluorescent pour définir les conditions cellulaires qui permettent aux arbovirus de se répliquer dans une infection autrement avortée dans les cellules d’insectes lépidoptères. Étant donné qu’il y a une réplication de fond minimale des arbovirus dans les cellules de lépidoptères, il devient relativement simple pour une personne de détecter les conditions qui permettent la réplication des arbovirus.

Pour commencer, conservez les cellules LD652 dans des boîtes traitées à la culture tissulaire de 10 centimètres et faites passer les cellules lorsqu’elles atteignent 80 % de confluence. Pipetez le milieu sur la monocouche cellulaire à plusieurs reprises pour déloger les cellules, puis diluez l’échantillon dans un milieu de croissance jusqu’à une densité approximative de 100 000 cellules par millilitre. Après cela, transférez un millilitre de la culture diluée dans chaque puits d’une plaque de 24 puits.

Ensuite, laissez les cellules se stabiliser pendant au moins une heure. 30 minutes avant l’infection, décongelez les tiges de la VSV luciférase et du virus de la vaccine sur de la glace. Ensuite, diluer la luciférase VSV avec et sans virus de la vaccine dans la MFS, de sorte qu’un MOI de 10 et 25, respectivement, soit atteint.

Aspirez soigneusement les milieux LD652 matures, pour éviter de perturber la monocouche cellulaire, et inoculez chaque puits avec 0,2 millilitre de virus. Ensuite, ajoutez des SFM stériles à des puits supplémentaires pour servir de témoins négatifs infectés simulés. Incuber les cellules dans l’inoculum pendant deux heures à 27 degrés Celsius.

Ensuite, retirez l’inoculum par aspiration et remplacez-le par un millimètre de milieu de croissance LD652 dans chaque puits. Après cela, laissez l’infection se poursuivre pendant 24 à 72 heures de plus. Tout d’abord, aspirez soigneusement le surnageant et ajoutez un millilitre de DPBS dans chaque puits.

À l’aide d’un piston de seringue, grattez les cellules pour les rendre plus simples. Ensuite, transférez les cellules dans un tube de micro-centrifugation et centrifugez pendant 20 minutes à 400 fois la gravité et quatre degrés Celsius. Pendant ce temps, diluez cinq fois le tampon de lyse du rapporteur dans de l’eau stérile.

Après la centrifugation, aspirez le DPBS sans perturber le granulé. Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 150 microlitres d’une fois RLB. Ensuite, incubez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius, suivi d’une décongélation rapide dans un bain-marie à température ambiante.

Après cela, stockez les lysats à moins 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie. Décongelez les lysats sur de la glace et pipetez 20 microlitres de lysat dans les puits d’une plaque de 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de région de dosage de la luciférase dans chaque puits de la plaque.

Mesurez immédiatement l’intensité lumineuse à l’aide d’un luménomètre. Dans des conditions d’infection unique, les cellules LD652 limitent la réplication de la luciférase VSV. Ainsi, seul un petit signal de luciférase est observé.

La co-infection, cependant, entraîne des signaux de luciférase significativement plus élevés. Dans des conditions d’infection unique, les cellules LD652 limitent également la réplication du VSV dsRED, de sorte que seul un petit nombre de cellules présente un signal dsRED. Cependant, la co-infection par le virus de la vaccine fait que la plupart des cellules affichent des signaux dsRED à la fin de la période.

Environ 2 % des cellules des infections uniques étaient dsRED positives 65 heures après l’infection. En revanche, environ 77 % des cellules co-infectées étaient dsRED positives au même moment. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier d’optimiser les points temporels auxquels les dosages de luciférase ou les points temporels d’imagerie de cellules vivantes seront pris afin de laisser suffisamment de temps au VSV pour se répliquer et produire un signal détectable.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’inhibition des facteurs de l’hôte par interférence ARN, peuvent être menées afin d’identifier les facteurs antiviraux potentiels de l’hôte limitant la réplication des arbovirus. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie virale pour définir le rôle des protéines A51R codées par le virus de la variole dans la promotion de la réplication et de la pathogenèse du virus de la variole. N’oubliez pas que travailler avec des virus eucaryotes peut être extrêmement dangereux et qu’il est important de prendre les précautions appropriées, comme le port d’un équipement de protection individuelle lors de cette procédure.