Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

Ce protocole décrit une méthode nouvelle et facile à mouler pour la création de tissus cardiaques tridimensionnels, qui utilise des sphéroïdes comme outil de création de tissus cardiaques sans échafaudage. Dans nos expériences, trois types de cellules, les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines, les fibroblastes cardiaques humains et les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, ont été isolés et utilisés pour générer une suspension cellulaire. Avec 70 % de cardiomyocytes, 15 % de fibroblastes et 15 % de cellules endothéliales, dans un tube conique de 50ML.

Nous distribuons ensuite la suspension cellulaire dans chaque puits d’un système de chute suspendue à très faible attachement, ce qui entraînera la formation spontanée de centaines de sphéroïdes battants après trois jours. Les sphéroïdes sont ensuite récoltés et placés dans une nouvelle cavité de moule. Le tissu est ensuite conservé dans un récipient stérile avec du milieu, sur un agitateur dans l’incubateur pendant plusieurs jours.

Le moule est ensuite retiré, ce qui permet d’obtenir un patch tissulaire sans échafaudage avec une intégrité mécanique. Le dispositif de chute suspendue est un puits de fixation réutilisable et ultra bas avec 850 micropores, chacun d’un diamètre de 350 microns. La goutte suspendue est compatible avec les plaques standard à six puits.

Après avoir fabriqué la suspension cellulaire, nous distribuons quatre millilitres de suspension cellulaire contenant 10 millions de cellules, dans chaque puits du système de goutte suspendue. Les appareils sont cultivés à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité. Après 72 heures, on observe une formation spontanée de sphéroïdes battants, d’un diamètre moyen de 350 microns.

Les sphéroïdes sont récoltés en plaçant le dispositif de chute suspendue dans un autre plat avec un milieu, et en tourbillonnant doucement pour libérer les sphéroïdes et leur permettre de dériver à travers les pores au fond du système de goutte suspendue. Il s’agit d’un schéma du nouveau moule pour la création de tissus cardiaques tridimensionnels sans échafaudage. Il comprend le tapis de manipulation, la base de remplissage et le nouveau moule.

Le nouveau moule est composé d’une base, d’une plaque carrée inférieure, d’un filet inférieur, de 10 couches de filets latéraux fabriqués avec de fines broches en acier inoxydable. Un filet supérieur, une plaque carrée supérieure, les tubes de retenue et les goupilles d’arrêt. Le système Novel Mold peut créer différentes tailles de tissus, y compris deux par deux millimètres, quatre par quatre millimètres et six par six millimètres.

La base, la plaque carrée inférieure et le filet inférieur sont empilés et alignés à l’aide des poteaux d’angle. 10 couches de filets latéraux sont ensuite empilées dans des directions alternées pour créer un filet de fines broches en acier inoxydable, à l’aide d’une paire de pinces stériles. La base de remplissage est ensuite rincée avec une solution tampon de phosphate 1X, ou PBS, pour réduire la tension superficielle avant d’installer les sphéroïdes dans le nouveau moule.

Après avoir mouillé la nouvelle cavité du moule dans le même méthane, les sphéroïdes sont placés dans la cavité présupposée de la taille souhaitée. Une fois installé, l’excès de fluide s’écoule à travers le moule en filet, permettant aux sphéroïdes de se remplir et de prendre la forme de la cavité prédéfinie. Le filet supérieur et la plaque carrée supérieure sont ensuite assemblés sur les poteaux d’angle et les goupilles d’arrêt et les tubes de maintien sont fixés, afin d’éviter le lessivage des sphéroïdes.

Le nouveau système de moule rempli est transféré sur une plaque à six puits, avec six millimètres de milieu supplémenté en B-27, puis maintenu dans l’incubateur sur un agitateur oscillant pendant sept à dix jours, à 30 à 40 tr/min. La durée de l’incubation peut être modifiée en fonction de la taille du patch cardiaque. Après l’incubation, le système est retiré et le tube de retenue, les bouchons, la plaque carrée supérieure et le filet supérieur sont retirés.

Les filets latéraux superposés sont ensuite soigneusement glissés un par un, en prenant soin de ne pas perturber les tissus. Après avoir retiré tous les filets latéraux, une tache cardiaque intacte est obtenue sur le dessus du filet inférieur. Un battement synchrone fonctionnel est observé dans les 24 heures.

Cette nouvelle méthode basée sur le moule est une méthode efficace et facile pour créer des tissus cardiaques tridimensionnels sans échafaudage, avec un minimum d’effort manuel. Les tissus multicouches qui en résultent sont constitués de sphéroïdes fusionnés avec une intégrité structurelle satisfaisante et un comportement de battement synchronisé. Cette nouvelle méthode basée sur le moule présente une alternative rentable et évolutive aux méthodes actuelles de biofabrication de tissus modifiés.