Name: Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Découvrez une méthode innovante par moule pour créer des tissus cardiaques tridimensionnels sans échafaudage en utilisant des sphéroïdes. Cette technique permet d'obtenir des tissus fonctionnels présentant une intégrité structurelle et un battement synchrone.

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Les auteurs reconnaissent la source de financement suivante : la magie que de questions Fonds recherche cardiovasculaire.

1. préparation des Cardiomyocytes
<ol><li>Plaques 6 puits manteau avec membrane basale matrice et la culture anthropique des cellules souches pluripotentes (hiPSCs) comme décrit plus haut17.</li>
	<li>La différence de hiPSCs en hiPSC-CMs à l’aide des méthodes décrites précédemment,18.</li>
	<li>À différenciation après d 16-18, suspendre les cardiomyocytes en rinçant chaque puits avec 2 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ou magnésium, suivi par incubation avec 1 mL/puits de la trypsine ou cellule réactif de dissociation (voir Table de Matériaux) pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Neutraliser le réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) à l’aide d’un volume égal de milieux cellulaires de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) additionnés de B-27 (milieux de cellules RPMI/B-27). Pipetter en haut et en bas pour décoller les cellules adhérentes.</li>
	<li>Recueillir les cardiomyocytes suspendus avec une pipette sérologique de 10 mL et de les transférer dans un tube conique de 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un culot cellulaire.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 10 mL de milieux cellulaires RPMI/B-27.</li>
	<li>Combinez 20 µL de suspension cellulaire avec une quantité égale de solution de bleu de Trypan 0,4 % et mélanger doucement.</li>
	<li>Utilisez un hémocytomètre manuels pour compter et obtenir la viabilité cellulaire et de la concentration de la suspension cellulaire.</li>
</ol>2. préparation des fibroblastes
<ol><li>Initier une culture d’une lignée de cellules de fibroblaste cardiaque humain (HCF) (type adulte ventriculaire) comme décrit plus haut16.</li>
	<li>Suspendre les CS en incubant eux avec une quantité appropriée de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) pendant 5 min à température ambiante,16. Pour un flacon de T175, 10 mL de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire a été utilisé.</li>
	<li>Neutraliser le réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) à l’aide d’un égal volume de liquide, puis transférer l’échantillon dans un tube conique de 50 mL et centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un Pellet.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de croissance de fibroblaste (voir Table des matières).</li>
	<li>Combinez 20 µL de la suspension cellulaire HCF avec une quantité égale de solution de bleu de trypan 0,4 % et mélanger doucement.</li>
	<li>Utiliser un compteur de cellules automatisé ou manuel hémocytomètre pour compter et obtenir la viabilité cellulaire et de la concentration de la nouvelle suspension cellulaire.</li>
</ol>3. préparation des cellules endothéliales
<ol><li>Initier une culture d’une lignée de cellules endothéliales (HUVEC) de veine ombilicale humaine comme décrit plus haut17. Suspendre les HUVECs en incubant eux avec une quantité appropriée de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) pendant 3 min à température ambiante17. Neutraliser le réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) à l’aide d’un égal volume de liquide, puis transférer dans un tube conique de 50 mL et centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir une boulette. Remarque : Pour un flacon de T175, 10 mL de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire a été utilisé.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture de cellules endothéliales (voir Table des matières).</li>
	<li>Mélanger 20 µL de la suspension HUVEC et souiller avec une quantité égale de solution de bleu de Trypan 0,4 % et mélanger doucement.</li>
	<li>Utiliser un compteur de cellules automatisées ou un hémocytomètre manuels pour compter et obtenir la viabilité cellulaire et de la concentration de la suspension cellulaire.</li>
</ol>4. création de la pendaison des sphéroïdes Drop
<ol><li>Placez la pendaison goutte périphérique qui contient des 850 micropores (chacun avec un diamètre de 350 µm) en plaques de 6 puits stériles.</li>
	<li>Isoler les trois types de cellules comme décrit ci-dessus : hiPSC-CMs, CS et HUVECs. Combiner dans une proportion de 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs dans un tube conique de 50 mL avec les milieux cellulaires RPMI/B-27 à une concentration de 2 475 000 cellules / mL.</li>
	<li>Diluer 4 mL de la suspension cellulaire (2 475 000 cellules / mL) dans chaque puits d’un accessoire ultra faible système goutte (d’un diamètre de micropore de 350 µm) assis dans une plaque 6 puits.</li>
	<li>Sphéroïdes seront forme spontanément dans les 12 h de dispenser la suspension cellulaire dans la pendaison goutte périphérique. Continuer à la culture pour un total de 72 h (3 jours) à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité pendant la maturation des sphéroïdes.</li>
	<li>Après 72 h de culture, récolter les sphéroïdes à travers les pores au bas de la pendaison drop système en plaçant l’appareil dans un plat avec un moyen et en agitant délicatement pour libérer les sphéroïdes de la pendaison goutte périphérique.</li>
</ol>5. création de Patch 3D en utilisant le nouveau moule Net
<ol><li>La base carré plaque de fond, filet de base et 10 côté couches filets sont assemblés pour créer le nouveau moule à l’aide d’une paire de pince stérile. Tout d’abord, empiler et alignez la base, le socle carré et fond net en utilisant les poteaux d’angle. Ensuite, la pile et couche les filets 10 côté en alternant les instructions pour créer un réseau de fines broches en acier inoxydable.</li>
	<li>Rincer le remplissage base avec PBS ou moyen pour réduire la tension superficielle et, ensuite, transférer le moule assemblé sur la base de remplissage.</li>
	<li>Mouiller la cavité du moule net avec PBS ou moyen dans la même méthode. Remplir lentement les sphéroïdes dans la cavité présupposée de la taille désirée (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, ou 6 x 6 x 1 mm). Remarque : Assurez-vous que 120 % du volume prévu des sphéroïdes est introduit dans la cavité, afin que les agrégats de cellules sont en lien étroit et restent statiques.</li>
	<li>Assembler le haut net et le haut de la page plaque carrée sur les poteaux d’angle et sécuriser les bouchons et les tubes d’exploitation afin d’éviter un affaissement des sphéroïdes.</li>
	<li>Transférer le système rempli de moisissure net à une plaque 6 puits 6 ml de milieux cellulaires RPMI/B-27 ou dans un contenant stérile avec assez moyen pour couvrir le moule assemblé ensemble.</li>
	<li>Incuber la plaque 6 puits avec le système de moule rempli sur un agitateur oscillant pendant 7 à 10 jours à 3 000-4 000 x g. Remarque : La durée de l’incubation est décidée par la taille des patchs cardiaques. Avec des taches plus grandes, le temps d’incubation devra être augmentée pour la maturation de patch cardiaque.</li>
</ol>6. suppression du correctif du roman moule Net
<ol><li>Enlever la moisissure des médias et placez-le sur le tapis de manutention stérilisé dans un récipient stérile de 10 cm.</li>
	<li>Enlever le tube de l’exploitation, bouchons, la plaque carrée supérieure et le haut de la page net. Glisser délicatement les filets côté en couches une par une avec une paire de pince stérile. Après décanulation, un patch cardiaque intact est obtenu au sommet du filet de base.</li>
	<li>Transférer le filet de base dans un plat de 35 mm avec 5 mL de RPMI/B27 médias et relever le filet de base avec le correctif à l’aide d’une pince stérile. Desserrer doucement le patch dans le filet de base en agitant doucement le filet dans le plat, ou avec un grattoir de cellules stériles. Après le détachement du fond net, le tissu cardiaque peut être cultivé avec médias RPMI/B27.</li>
	<li>Continuer à incuber le patch cardiaque 3D flottant librement dans le plat de 35 mm. Battement synchrone fonctionnelle peut être observée dès 24h après l’enlèvement du moule.</li>
	<li>Après avoir enlevé le patch du moule net, observer que sa forme est maintenue avec intégrité et de l’intensité de battement synchrone augmente avec le temps. Remarque : Les correctifs cardiaques 3D basé sur moule nets exposé intégration électrique du composant cardiospheres après décanulation. Nous avons observé une fréquence de battement allant de 60 à 80 battements par minute qui perdure depuis plus de 60 jours.</li>
</ol>

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<li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Medicine%2FCardiac+Cell+Therapy%3A+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li>
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<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick%2C+vascularized+myocardial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li>
<li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+number+per+spheroid+and+electrical+conductivity+of+nanowires+influence+the+function+of+silicon+nanowired+human+cardiac+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).</li>
<li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li>
<li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes%3A+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’importance de cette méthode réside dans sa reproductibilité et l’efficacité du tissu cardiaque multicouche qui en résulte. Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire cardiaque, l’un des objectifs actuels est d’identifier une méthode pour construire les patchs cardiaques 3D battant, multicouches et fonctionnelles. Nous rapportons une méthode efficace et reproductible de création de plusieurs couches de tissus cardiaques par semis manuel direct des sphéroïdes composés des cardiomyocytes, cellules endothéliales, fibroblas...

Ingénierie de tissu cardiaque actuelle vise à développer une thérapie pour remplacer ou réparer la structure et la fonction du tissu myocardique lésée1. Méthodes pour créer des modèles 3D de tissu cardiaque présentant les propriétés contractiles et électrophysiologiques importantes du tissu cardiaque indigène ont rapidement étendu2,3. Diverses stratégies ont été exploré et utilisé dans les études4,5. Ces méthodes vont de l’utilisation des hydrogels bioactifs naturels et synthétiques spécifiques, comme la gélatine, le collagène, fibrine et peptides6, à la bio-encre dépôts technologies2 et bioprinting technologies7.
Il a été démontré que méthodes exempte d’échafaudage peuvent produire des tissus comparables comme les méthodes axées sur les biomatériaux, sans les inconvénients de l’incorporation de matière étrangère échafaudage8. Oren Caspi et coll. ont montré que l’incorporation de différents types de cellules active la génération de fortement vascularisé humain tissu cardiaque machiné9. Menton et coll. mis au point une méthode d’impression 3D pour la création de patch cardiaque de sphéroïdes. Correctifs qui en résultent sont composées des cardiomyocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales dans un ratio de 70:15:1510. Sphéroïdes ont démontré être efficaces « building blocks » de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage, comme ils résistent contre l’hypoxie et posséder une intégrité mécanique suffisante pour implantation11,12. Des études antérieures ont démontré plusieurs méthodes de fabrication pour la création de sphéroïde, y compris l’utilisation de la pendaison de glisser méthode, fileur flacons13, de systèmes microfluidiques14et les surfaces de culture non adhérents non couchés ni enduits avec d’agarose micro-moules15. Dans ce protocole, nous utilisons la pendaison goutte périphérique, qui contient des micropores de condensation des centaines des sphéroïdes à un moment donné.
Cette étude présente une nouvelle et efficace méthode sans échafaudage pour la création de tissu cardiaque, qui comprend l’ensemencement manuellement les sphéroïdes dans une cavité de moule carré et en incubant le tissu sur un agitateur pour la maturation. Dans des conditions de culture statique habituel, diffusion de l’oxygène est limitée aux aspects extérieurs de la construction des tissus, entraînant une nécrose centrale. Cependant, avec le moule net, tous les sphéroïdes ensemencées dans le moule sont immergés dans les médias avec un mouvement constant fluidique, permettant la diffusion accrue de nutriments et d’oxygène. En outre, cette méthode axée sur le moule permet la création simultanée de patchs de tissus de différentes tailles avec un minimum d’effort manuel et le tissu qui en résulte peut être facilement retiré du moule. Cette nouvelle méthode permet la création efficace et reproductible des patchs cardiaques sans échafaudage et multicouches.

<table><tbody><tr><td>Fibroblastes cardiaques humains (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 Se compose d’un milieu basal</td><td>Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF</td></tr><tr><td>Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM+Bullet Kit&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>CC5035</td><td>Milieu de culture HUVEC</td></tr><tr><td>E8 media&nbsp ;</td>Milieu de culture <td>Invitrogen</td><td>A1517001</td><td>HiPSC</td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>Trypsine et réactif de dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>Milieu RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>avec supplément B-27 est un milieu de culture hiPSC-CM</td></tr><tr><td>Supplément B-27 (50x)</td><td>Le milieu Thermo Fisher 17504044</td><td></td><td>RPMI avec supplément B-27 est un milieu de culture hiPSC-CM</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Novel moule à filet</td><td>TissueByNet Co.,Ltd</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de chute suspendue</td><td>Kuraray Co.,Ltd</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>6 plaques de puits&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode axée sur le moule net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Ce protocole décrit un procédé nouveau et facile net axée sur le moule pour créer des tissus cardiaques d’en trois dimensions (3d) sans matériel d’échafaudage supplémentaires. Cardiomyocytes de DERIVES de cellules-souches humaines pluripotentes (iPSC-CMs), les fibroblastes cardiaques humaines (CS) et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) sont isolées et utilisés pour générer une suspension de cellules avec 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs. Ils sont conjointement mis en culture dans un système de « goutte suspendue » de fixation ultra faible, qui contient des micropores de condensation des centaines des sphéroïdes à un moment donné. Les cellules agrègent et forment spontanément sphéroïdes de battement après 3 jours de culture mixte. Les sphéroïdes sont récoltés, ensemencées dans une cavité de moule roman et cultivées sur un agitateur dans l’incubateur. Les sphéroïdes devient un tissu fonctionnel mature environ 7 jours après le semis. Les tissus multicouches qui en résulte se composent des sphéroïdes fusionnés avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone. Cette nouvelle méthode a un potentiel prometteur comme une méthode reproductible et rentable de créer des tissus conçus pour le traitement de l’insuffisance cardiaque à l’avenir.

Dans nos expériences, nous avons utilisé une suspension cellulaire de 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs en milieux cellulaires RPMI/B-27 à une concentration de 2 475 000 cellules / mL. Après avoir créé la suspension cellulaire, nous avons distribué 4 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’un accessoire ultra faible chute de système, comme indiqué au point 4.3 du protocole. L’utilisation de la pendaison goutte système conduit à la formation spontanée de centaines de batt...

Ce protocole décrit une méthode axée sur le moule nette pour créer des tissus cardiaques exempte d’échafaudage tridimensionnels avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone.

Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Ce protocole décrit une méthode nouvelle et facile à mouler pour la création de tissus cardiaques tridimensionnels, qui utilise des sphéroïdes comme outil de création de tissus cardiaques sans échafaudage. Dans nos expériences, trois types de cellules, les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines, les fibroblastes cardiaques humains et les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, ont été isolés et utilisés pour générer une suspension cellulaire. Avec 70 % de cardiomyocytes, 15 % de fibroblastes et 15 % de cellules endothéliales, dans un tube conique de 50ML.Nous distribuons ensuite la suspension cellulaire dans chaque puits d’un système de chute suspendue à très faible attachement, ce qui entraînera la formation spontanée de centaines de sphéroïdes battants après trois jours. Les sphéroïdes sont ensuite récoltés et placés dans une nouvelle cavité de moule. Le tissu est ensuite conservé dans un récipient stérile avec du milieu, sur un agitateur dans l’incubateur pendant plusieurs jours.Le moule est ensuite retiré, ce qui permet d’obtenir un patch tissulaire sans échafaudage avec une intégrité mécanique. Le dispositif de chute suspendue est un puits de fixation réutilisable et ultra bas avec 850 micropores, chacun d’un diamètre de 350 microns. La goutte suspendue est compatible avec les plaques standard à six puits.Après avoir fabriqué la suspension cellulaire, nous distribuons quatre millilitres de suspension cellulaire contenant 10 millions de cellules, dans chaque puits du système de goutte suspendue. Les appareils sont cultivés à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité. Après 72 heures, on observe une formation spontanée de sphéroïdes battants, d’un diamètre moyen de 350 microns.Les sphéroïdes sont récoltés en plaçant le dispositif de chute suspendue dans un autre plat avec un milieu, et en tourbillonnant doucement pour libérer les sphéroïdes et leur permettre de dériver à travers les pores au fond du système de goutte suspendue. Il s’agit d’un schéma du nouveau moule pour la création de tissus cardiaques tridimensionnels sans échafaudage. Il comprend le tapis de manipulation, la base de remplissage et le nouveau moule.Le nouveau moule est composé d’une base, d’une plaque carrée inférieure, d’un filet inférieur, de 10 couches de filets latéraux fabriqués avec de fines broches en acier inoxydable. Un filet supérieur, une plaque carrée supérieure, les tubes de retenue et les goupilles d’arrêt. Le système Novel Mold peut créer différentes tailles de tissus, y compris deux par deux millimètres, quatre par quatre millimètres et six par six millimètres.La base, la plaque carrée inférieure et le filet inférieur sont empilés et alignés à l’aide des poteaux d’angle. 10 couches de filets latéraux sont ensuite empilées dans des directions alternées pour créer un filet de fines broches en acier inoxydable, à l’aide d’une paire de pinces stériles. La base de remplissage est ensuite rincée avec une solution tampon de phosphate 1X, ou PBS, pour réduire la tension superficielle avant d’installer les sphéroïdes dans le nouveau moule.Après avoir mouillé la nouvelle cavité du moule dans le même méthane, les sphéroïdes sont placés dans la cavité présupposée de la taille souhaitée. Une fois installé, l’excès de fluide s’écoule à travers le moule en filet, permettant aux sphéroïdes de se remplir et de prendre la forme de la cavité prédéfinie. Le filet supérieur et la plaque carrée supérieure sont ensuite assemblés sur les poteaux d’angle et les goupilles d’arrêt et les tubes de maintien sont fixés, afin d’éviter le lessivage des sphéroïdes.Le nouveau système de moule rempli est transféré sur une plaque à six puits, avec six millimètres de milieu supplémenté en B-27, puis maintenu dans l’incubateur sur un agitateur oscillant pendant sept à dix jours, à 30 à 40 tr/min. La durée de l’incubation peut être modifiée en fonction de la taille du patch cardiaque. Après l’incubation, le système est retiré et le tube de retenue, les bouchons, la plaque carrée supérieure et le filet supérieur sont retirés.Les filets latéraux superposés sont ensuite soigneusement glissés un par un, en prenant soin de ne pas perturber les tissus. Après avoir retiré tous les filets latéraux, une tache cardiaque intacte est obtenue sur le dessus du filet inférieur. Un battement synchrone fonctionnel est observé dans les 24 heures.Cette nouvelle méthode basée sur le moule est une méthode efficace et facile pour créer des tissus cardiaques tridimensionnels sans échafaudage, avec un minimum d’effort manuel. Les tissus multicouches qui en résultent sont constitués de sphéroïdes fusionnés avec une intégrité structurelle satisfaisante et un comportement de battement synchronisé. Cette nouvelle méthode basée sur le moule présente une alternative rentable et évolutive aux méthodes actuelles de biofabrication de tissus modifiés.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Dans ce protocole, nous démontrons la fabrication de substrats de culture de cellules cardiaques biomimétiques fabriqués à partir de deux matériaux polymères distincts à l’aide de la lithographie par force capillaire.  Les méthodes décrites fournissent une technique évolutive et rentable pour concevoir la structure et la fonction des tissus cardiaques macroscopiques pour des applications in vitro et in vivo.

Capillaire de travail lithographie pour l&#39;ingénierie tissulaire cardiaque

La génération de tissu myocardique alignés est une exigence essentielle pour adapter les progrès récents de la biologie des cellules souches à des fins utiles en clinique. Ici nous décrivons une approche impression par microcontact pour le contrôle précis de la forme et la fonction cellulaire. Utilisation populations hautement purifiées de cellules souches embryonnaires dérivées progéniteurs cardiaques, nous avons ensuite générer anisotrope tissu fonctionnel du myocarde.

Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l&#39;impression par microcontact

Dans ces études, nous fournissons une méthodologie pour de nouvelles, échafauds cardiaques néonatales, murins pour une utilisation dans les études de régénération.

Néonatale cardiaque Echafaudages: Matrices nouveaux pour Études régénératives

Ce protocole décrit la bioprinture 3D du tissu cardiaque sans l'utilisation de biomatériaux. Les plaques cardiovasculaires bioprinées 3D présentent une intégration mécanique des sphéroïdes constitutifs et sont très prometteuses dans la régénération des tissus cardiaques et comme modèles 3D de maladies cardiaques.

Création d&#39;un tissu cardiaque exposant l&#39;intégration mécanique des sphéroïdes à l&#39;aide de la bioprinterie 3D

Le protocole actuel génère des tissus cardiaques en forme de maille contenant des cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour permettre l’étude de la thérapie d’implantation cellulaire pour les maladies cardiaques.

Préparation de tissus cardiaques en forme de maille dérivés de cellules iPS humaines pour la réparation myocardique in vivo

Nous décrivons ici une méthodologie facile à utiliser pour générer des réseaux de microtissus cardiaques auto-assemblés en 3D composés de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales prédé différenciés dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Cette technique conviviale et nécessitant des cellules basses pour générer des microtissus cardiaques peut être mise en œuvre pour la modélisation de la maladie et les premiers stades du développement de...

Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain

Les tissus modifiés s’appuient fortement sur des réseaux vasculaires appropriés pour fournir des nutriments et des gaz vitaux et éliminer les déchets métaboliques. Dans ce travail, un protocole d’ensemencement par étapes de cellules endothéliales et de cellules de soutien crée des réseaux vasculaires hautement organisés dans une plate-forme à haut débit pour étudier le développement du comportement des vaisseaux dans un environnement 3D contrôlé.

Ensemencement de cellules par étapes sur des échafaudages tessellés pour étudier les vaisseaux sanguins en germination

Le but de ce protocole est d’expliquer et de démontrer le développement d’un modèle microfluidique tridimensionnel (3D) de tissu cardiaque humain fortement aligné, composé de cardiomyocytes dérivés de cellules souches co-cultivés avec des fibroblastes cardiaques (CFs) dans un hydrogel biomimétique et à base de collagène, pour des applications dans l’ingénierie tissulaire cardiaque, le criblage de drogue, et la modélisation de maladie.

Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique

Les modèles spécifiques au patient améliorent la confiance du chirurgien et des collègues lors de l’élaboration ou de l’apprentissage de plans chirurgicaux. Les imprimantes tridimensionnelles (3D) génèrent suffisamment de détails pour la préparation chirurgicale, mais ne parviennent pas à reproduire la fidélité haptique des tissus. Un protocole est présenté détaillant la création de modèles cardiaques en silicone spécifiques au patient, combinant la précision de l’impression 3D avec un tissu en...

Création de modèles cardiaques en silicone spécifiques au patient avec des applications dans les plans pré-chirurgicaux et la formation pratique

Une méthode reproductible est présentée pour générer des tissus myocardiques 3D combinant l’écriture par électrofilage fondu (MEW), des échafaudages de polycaprolactone (PCL) et des hydrogels de fibrine avec des cardiomyocytes et des fibroblastes dérivés de hiPSC. Cette technique offre un contrôle précis de l’architecture de l’échafaudage et peut être appliquée dans les tests précliniques de médicaments et la modélisation des maladies cardiaques.

Génération 3D de tissu myocardique humain à l’aide de l’écriture électrofilée à l’état fondu d’échafaudages de polycaprolactone et de cellules cardiaques dérivées de hiPSC

Découvrez une méthode innovante par moule pour créer des tissus cardiaques tridimensionnels sans échafaudage en utilisant des sphéroïdes. Cette technique permet d'obtenir des tissus fonctionnels présentant une intégrité structurelle et un battement synchrone.

Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

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