Name: (Hu-NSG) souris humanisée NOD/SCID/IL2rγnull modèle d’études de latence et de réplication du VIH (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Découvrez comment établir des souris humanisées hu-NSG par injection intra-hépatique de cellules souches CD34+ chez des nouveau-nés irradiés. Ce modèle permet d'étudier la latence et la réplication du VIH.

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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health [subvention numéros R01AI29329, R01AI42552 et R01HL07470 à J.J.R.] et le National Cancer Institute de la National Institutes of Health [numéro de licence P30CA033572 pour soutenir la ville de Hope génomique intégrative Pharmacologie analytique et des noyaux de cytométrie analytique]. Le réactif suivant a été obtenu par le biais de la NIH recherche sur le sida et le programme des réactifs de référence, Division of AIDS, NIAID, NIH : virus HIV BaL.

Tous les soins des animaux et des procédures ont été réalisées selon les protocoles revus et approuvés par la ville de Hope institutionnels Animal Care et utilisation Comité (IACUC) détenu par le chercheur principal de cette étude (Dr John Rossi, 12034 # IACUC). Tissu du foie foetal humain provient d’Advanced Bioscience ressources (Alameda, CA), un organisme sans but lucratif, conformément à la réglementation fédérale et d’état. Le vendeur a son propre Institutional Review Board (IRB) et est conforme aux exigences de protection des sujets humains. PBMC humaines est isolées à partir des échantillons de sang périphérique mis au rebut de donneurs sains anonymes de la ville de centre de donneur de sang de Hope (Duarte, CA), avec aucune identification concernant l’âge, la race, sexe ou l’origine ethnique. LA CISR #/ REF #: 97071/075546
1. Généralités pratiques aseptiques
<ol><li>Réaliser des expériences de culture de tissus en désigné à flux laminaire.</li>
	<li>Garder le milieu de culture tissulaire et de suppléments dans des conditions stériles et filtrer à l’aide d’un avant d’unité de filtration 0,22 µm à utiliser.</li>
	<li>Préserver préparés autorenouveler humaine dans des tubes stériles et rester sur la glace jusqu'à l’injection.</li>
	<li>En raison d’un déficit immunitaire sévère, gérer la souris NSG aseptiquement. Porter une robe de chirurgie jetables, cap de cheveux, masque facial, couvre-chaussures et des gants pour éviter la contamination. Désinfecter la surface de banc, titulaire de l’irradiation et chambre d’induction de l’anesthésie avec agent de stérilisation chlore dioxyde de base (p. ex., Clidox) avant et après expériences.</li>
	<li>Après rétro-orbitaire hémorragie pour éviter la sécheresse des yeux, appliquer la pommade ophtalmique à base de pétrole.</li>
	<li>Changer d’antibiotique contenant alimentation pour prévenir l’infection en raison de saignements de rétro-orbitaire.</li>
</ol>2. infectés par le Virus de manipulation de VIH, rongeurs et les échantillons de sang et les tissus contenant des Virus
Attention : Le VIH est un pathogène humain classe 3 ; les règles de manutention doivent être suivies à la lettre.
<ol><li>Gérer les échantillons contenant le virus VIH a désigné BSL2 + / espace laboratoire 3. Verrouiller les réactifs contenant des virus solidement dans un conteneur secondaire pendant le transport. Désinfecter la surface extérieure de tous les conteneurs en l’essuyant approfondie avec 10 % eau de Javel et l’isopropanol avant le transport.</li>
	<li>Garder tous les déchets contenant des virus dans des conteneurs de déchets désignés avec 2 ou 3 couches de sacs de déchets biologiques. Avant l’élimination des déchets, désinfecter en pulvérisant généreusement les déchets avec iode/éthoxylés nonylphénol solution (par exemple, Wescodyne) et stériliser.</li>
	<li>Porter des équipements de protection individuelle : bouchon de cheveux, couvercle frontal, écran facial anti-éclaboussure, couvre-chaussures, robe de chirurgie jetables et gants de double-couche.</li>
	<li>Gérer des rongeurs infectés avec une extrême prudence. Procéder à des injections et des collections de sang tandis que les souris sont sous anesthésie (étapes 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3 et 8.1-8,2).</li>
</ol>3. isolement de cellules souches hématopoïétiques
<ol><li>Préparer la solution de collagénase/a pour la digestion du tissu.<ol>
<li>Dissoudre la poudre de collagénase/a pour faire la solution-mère à une concentration de 100 mg/mL et stocker la solution mère de collagénase/a dans 150 µL d’extraits à-20 ° C.</li>
		<li>Pour utiliser la solution de collagènase, diluer 150 µL de stock de collagénase/a avec 15 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de FCS et 1 % la pénicilline/streptomycine. Remarque : La concentration finale de collagénase/a pour la digestion du tissu est de 1 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avec une lame de rasoir stérile, couper le tissu hépatique foetal (16 à 24 semaines de gestation) en petits morceaux (environ 2-3 mm3 en taille) suivi par digestion avec solution de collagénase/a (1 mg/mL) pendant 30 minutes à température ambiante. Ajuster le volume de solution de digestion afin que tous les morceaux de tissus sont complètement submergées. Utilisez l’extrémité arrière du piston de la seringue pour meuler doucement l’échantillon de tissu pour faciliter la digestion.</li>
	<li>Passer le mélange de digestion à travers un filtre de maille de nylon stérile de 70 µm pour acquérir une suspension de cellules du même.</li>
	<li>Enrichir pour CD34 + CSS en utilisant un système de MACS par les instructions du fabricant.</li>
	<li>Compter le pourcentage viable d’enrichi CD34 + CSS à l’aide d’un hémacytomètre28 et procéder à l’injection intrahépatique dans souris néonatales de soins infirmiers.</li>
	<li>Congeler le restant enrichi CD34 + GPX en gelant les médias (p. ex., CryoStor CS2) et préserver les cellules dans un réservoir d’azote liquide. Lors de l’utilisation future, racontent le pourcentage viable de décongelé CD34 + autorenouveler avant l’injection. Avec l’utilisation de médias de gel, dégel après viabilité est entre 80 et 90 %.</li>
</ol>4. intrahépatique Injection de csh humaines CD34 + souris néonatales NSG
NOTE : Souris néonatales NSG 2-3 jours après la naissance sont plus appropriés pour cette procédure, car ils sont assez forts pour supporter l’irradiation à dose létale moitié, tandis que de jeunes suffisamment pour avoir totalement vicié le système immunitaire. Aucune anesthésie n’est nécessaire pour l’injection de HSC.
<ol><li>Placez la litière entière de souris néonatales de NSG (généralement de 5 à 10 souris, les deux sexes) dans une cage de l’irradiation en forme de camembert stérile et exposer à une dose totale de 200-250 cGy rayons gamma rayonnement d’une source de rayonnement de césium-137. S’assurer que cette dose de rayonnement se situe dans la plage, comme la perte de poids significative ou même la mort peut être observée lorsque les souris NSG sont exposés à de fortes doses d’irradiation. 12 Remarque : Le rayonnement est un danger pour la santé, protection des personnes contre les rayonnements doit être prise.</li>
	<li>Après irradiation, injecter chaque souris NSG néonatale avec 5 x 105 viable humaine CD34 + CSS en utilisant une aiguille de seringue/configuration (Figure 1). Injecter directement des cellules au niveau du foie.</li>
</ol>5. prise de greffe Validation par le biais de rétro-orbitaire hémorragie et analyse en cytométrie en flux
<ol><li>L’injection de 10-12 semaines post-HSC, anesthésier la souris à l’aide d’un appareil d’inhalation isoflurane/oxygène. Régler le débit d’oxygène afin de maintenir le pourcentage d’isoflurane à 4-5 %. L’anesthésie prend 3-5 minutes, en fonction des souris. La souris correctement anesthésiée montrent une lente et profonde respiration et aucune réaction à la stimulation d’orteil-pincement.</li>
	<li>Collecter 50-100 µL de sang périphérique de chaque souris par le biais d’échantillonnage rétro-orbitaire28. Stocker les échantillons de sang dans les K2EDTA ou les tubes de prélèvement de sang hépariné pour éviter la coagulation. NOTE : Les tubes de prélèvement sanguin sont tenus d’avoir revêtement anticoagulant afin que les souris PBMC peut être isolé du sang pour analyse en cytométrie en flux. EDTA est connu pour inhiber les réactions enzymatiques comme la PCR et qRT-PCR ; ainsi, si les réactions enzymatiques en aval sont nécessaires, utiliser un appareil de collecte de sang hépariné.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons de sang à 2 000 x g pendant 20 minutes à 4 ° C pour granuler globules.<ol>
<li>Transférer les surnageants de plasma dans de nouveaux tubes de microcentrifuge après centrifugation et conserver à-80 ° C si l’analyse de cytokine est nécessaire.</li>
		<li>Lyse des globules rouges (hématies) dans le culot de cellules sanguines à température ambiante pendant 10 minutes à l’aide du tampon de lyse des globules rouges (Table des matières). Remarque : Si les échantillons de plasma ne sont pas nécessaires, lyse directement le sang total avec solution de lyse sans centrifugation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet globules restantes après la lyse de la RBC à 300 x g pendant 5 minutes à 4 ° C ; aspirer le surnageant. Laver les granules cellulaires avec 0,01 % de BSA contenant du SPD, centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à 4 ° C et aspirer le surnageant. Répétez l’étape de lavage une fois de plus.</li>
	<li>Bloquer des cellules avec 100 µL de 1 x blocage cocktail (tableau 3 pour la recette) pendant 20 minutes à 4 ° C.</li>
	<li>Après le blocage, directement ajouter chaque solution d’anticorps dans la suspension de cellules à une concentration de 2 µL/106 cellules et incuber à 4 ° C pendant 30 minutes. Anticorps pour la validation de la prise de greffe sont : anti-humain CD45 (leucocytes, IDRM : AB_2732068), anti-humain CD3 (T-cells, IDRM : AB_396896), anti-humain CD4 (les cellules T helper, IDRM : AB_397037), anti-human CD8 (lymphocytes T cytotoxiques, IDRM : AB_2722501), anti-humain CD14 (monocytes, IDRM : AB_10373536) et anti-humain CD19 (lymphocytes B, IDRM : AB_10373382). Pour panneau de débit suggéré, veuillez consulter le tableau 4 et Table des matières pour les numéros de catalogue, les RRIDs et les numéros de lot. NOTE : Souillure d’anticorps en bloquant la solution élimine la liaison non spécifique des anticorps anti-humaines vers des marqueurs de surface de souris, comme plusieurs marqueurs de surface partager homologie entre l’humain et de souris.</li>
	<li>Isoler les PBMC humains provenant de donneurs sains et préparer les colorés à simple flux cytometry compensation contrôles à l’aide de PBMC humaines purifiées. alternativement, utilisez des microsphères marquées fluorescence comme compensation contrôle29.</li>
	<li>Analyse des échantillons de sang périphérique à l’aide d’un cytomètre de flux et de quantifier le pourcentage de cellules humaines CD45 +, CD3 + des cellules humaines, humains cellules CD14 + et CD19 + cellules humaines de cellules du sang périphérique totales.<ol>
<li>Pour l’infection à VIH en aval et des études de latence, calculer le pourcentage de lymphocytes T CD4 + et CD8 + T-cellules au sein des cellules CD3 +. Remarque : En règle générale, un ratio de CD4:CD8 entre 1,5 et 2,5 est observé avant le VIH infection30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. analyse de l’infection par le VIH de hu-NSG souris et de la charge virale plasmatique par qRT-PCR
<ol><li>Propager le stock viral VIH BaL dans les PBMC humains provenant de donneurs sains, récolter à post-infection jour 10 et titrer à l’aide de p24 ELISA kit31.</li>
	<li>Humaine CD45 + souris sélectionnez hu-NSG avec plus de 20 % des cellules dans le sang périphérique d’infection à VIH.</li>
	<li>Anesthésier souris hu-NSG à l’aide d’un appareil d’inhalation isoflurane/oxygène (étape 5.1).</li>
	<li>Après avoir confirmé l’animal est anesthésié, injecter le virus VIH BaL à une dose de 200 ng de p24 par souris par voie intrapéritonéale. NOTE : Soyez très prudent avec l’aiguille, ne pas réutiliser les aiguilles et jeter immédiatement après utilisation dans le récipient de sharp désigné. Désinfectez la zone d’injection après administration de virus.</li>
	<li>Après l’infection trois semaines, d’offrir une souris hu-NSG et recueillir le sang périphérique par le biais de rétro-orbitaire hémorragie en utilisant hépariné tubes capillaires et les tubes de prélèvement.</li>
	<li>Séparé plasma et cellules sanguines par centrifugation à 2 000 x g pendant 20 minutes.</li>
	<li>Lyse des globules rouges Block et tacher les autres globules avec anticorps pour analyse en cytométrie en flux (Section 5.3-5.8). Remarque : Analyse en cytométrie en flux devrait se concentrer sur la comparaison CD4:CD8 ratio avant et après l’infection. Une diminution significative de la numération des cellules CD4 + est prévue, comme le CD4 antigène sert un corécepteur pour entrée virale.</li>
	<li>Utilisation des échantillons de plasma pour analyser le VIH viral chargement par qRT-PCR. Isoler l’ARN viral des échantillons de plasma à l’aide d’un kit de mini ARN viral. Effectuer qRT-PCR avec des amorces spécifiques LTR du VIH-1 et sonde fixe (détails de la séquence dans le tableau 5), en utilisant le protocole du fabricant.</li>
</ol>7. orale du panier et la Validation de la Suppression virale (facultatif)
Remarque : Cette étape est facultative pour les enquêtes concernant le pronostic de VIH, virologie ou physiopathologie liée à l’infection au cours de la phase aiguë de l’infection. Panier traitement HIV-infected hu-NSG sert à récapituler la latence du VIH chez les patients humains recevant cART. Les souris infectées avec succès hu-NSG sont donnés panier pendant 4 semaines. Le régime de panier compose de fumarate de ténofovir disoproxil (TDF, 300 mg/capsule), emtricitabine (FTC ; 200 mg/capsule) et le raltégravir (RAL ; 400 mg/capsule). La dose de chariot pour le traitement de souris infectées par le VIH hu-NSG est ajustée selon corps superficie (tableau 1, l’équation 1, tableau 2)32.
<ol><li>Calculer la quantité de chaque médicament requis pour chaque cage durant une semaine de traitement, prenant en considération le volume de la bouteille d’eau, le nombre de souris dans chaque cage et un apport quotidien en eau moyenne de 4 mL par souris. Remarque : Le point essentiel dans cette étape est d’assurer que chaque souris acquiert sa dose quotidienne dans 4 mL de l’eau potable.</li>
	<li>Broyer tous les trois médicaments par doses ajustées en poudre fine et dissoudre le mélange de poudre dans l’eau sucrée (par exemple, Medidrop Suralose). Changer la bouteille d’eau chaque semaine au cocktail fraîchement dissous panier fourni dans l’eau sucrée. Remarque : La poudre de drogue ne peut-être pas dissoudre immédiatement, agiter vigoureusement pour obtenir une suspension homogène avant de retourner la bouteille à la cage de rétention.</li>
	<li>Prélever des échantillons de sang périphérique via rétro-orbitaire hémorragie toutes les deux semaines et d’analyser tous les deux le ratio de CD4:CD8 à l’aide de la cytométrie en flux (Section 5.3-5.8) et la charge virale plasmatique par qRT-PCR (Section 6.6). Remarque : Généralement après 4 semaines de traitement, la charge virale plasmatique diminue au dessous de la limite de détection et un ratio de CD4:CD8 typique est rétabli.</li>
</ol>8. validation du rebond Viral sur chariot retrait (facultatif)
Remarque : Cette étape est essentielle à la validation du modèle de latence, comme rebond viral après le retrait de chariot fournit une preuve directe d’un réservoir de latence. Il est également recommandé pour servir comme une expérience de contrôle pour les études thérapeutiques sur le VIH rebond abat.
<ol><li>Plan de retrait du panier après une charge virale plasmatique d’échantillons de sang périphérique est inférieures à la limite de détection et le ratio de CD4:CD8 est restauré sur une plage comprise entre 1.5 et 2.5.</li>
	<li>Prélever des échantillons de sang périphérique par le biais de rétro-orbitaire hémorragie toutes les 2 semaines après le retrait de la charrette. Surveiller étroitement la variation de la charge virale plasmatique (Section 6.6) ainsi que le ratio de CD4:CD8 (Section 5.3-5.8).</li>
</ol>

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Les auteurs ne divulguer aucun conflit d’intérêt.

Des souris immunodéprimées greffés avec cellules/tissus humains présentent des caractéristiques physiologiques humanoïde et sont une valeur énorme pour les études de pathologie et physiopathologie, immunologie concernant les maladies spécifiques à l’homme. Parmi les nombreuses souches de souris immunodéficientes, le clin de œil. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji modèle (NSG) est la plus immunodéprimés en raison de son manque d’immunité innée et adaptative, ainsi que roussis cytokines de souris spéc...

Parce que l’établissement approprié des modèles animaux de maladies humaines est essentielle pour trouver un remède, modèles animaux appropriés ont été longtemps poursuivis et améliorés au fil du temps. Plusieurs souches de modèles murins immunodéprimés ont été développés qui permettent la prise de la greffe de tissus et/ou de cellules humaines et de l’exécution ultérieure des fonctions humanisé1,2. Ces modèles de souris humanisée sont critiques pour les enquêtes sur les maladies humaines spécifiques3,4,5.
Syndrome d’immunodéficience acquise (sida) résultant de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est un exemple. Avant la création de modèles murins humanisés, des limites éthiques et techniques confinée études animales précliniques de VIH/sida aux primates non humains3. Toutefois, les dépenses élevées et les exigences pour des soins spécialisés pour tel animal gênent études de VIH/sida dans les milieux universitaires typiques. Principalement, le VIH infecte les cellules humaines CD4 + T et impact sur le développement et les réactions immunitaires des autres cellules immunitaires humaines telles que les lymphocytes B, les macrophages et les cellules dendritiques6; C’est pourquoi, petits modèles animaux transplantés ayant un système immunitaire humain fonctionnel sont en forte demande.
Une percée est venue en 1988, quand CB17 -scid souris présentant une mutation Prkdcscid ont été conçus et ont montré une greffe réussie du système immunitaire humain1. Les résultats de mutation Prkdcscid dans les fonctions de cellules B et T défectueux et une ablation du système immunitaire adaptatif chez la souris, permettant ainsi la prise de greffe des périphériques humains de sang cellules mononucléaires (PBMC), les cellules souches hématopoïétiques (CSH), et les tissus hématopoïétiques foetaux7,8. Néanmoins, les faibles niveaux de prise de greffe sont fréquemment observées dans ce modèle ; les causes possibles sont 1) résiduelle activité du système immunitaire innée modulée par l’intermédiaire de tueuses naturelles (NK)-cellules et 2) le dernier stade de développement des souris (perméabilité) de lymphocytes T et B5. Le développement ultérieur de la non obèses diabétiques (Adi)-modèle de sourisscid atteint la régulation à la baisse spectaculaire de l’activité des cellules NK ; ainsi, il est capable de soutenir un niveau plus élevé et plus greffe durable du système immunitaire humain composants9. En plus d’autres suppriment ou entravent le développement de l’immunité innée, portant le total opercule de l’interleukine-2 récepteurs-chaîne γ (Il2rg) ou de troncature dans la (NOD) des modèles de souris -scid arrière-plan ont été établis. Il2rg, également connu sous le nom commun cytokine-receptor γ-chaîne, est un élément indispensable de diverses cytokines récepteurs10,11,12,13. Souches comme clin de œil. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) et NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) présentent des perturbations robuste de signalisation des cytokines de souris et une ablation complète du développement des cellules NK, dans Ajout d’une insuffisance sévère de l’immunité adaptative14,15,16.
Trois modèles de souris humanisée portant un scid , mutation et Il2rg knock-out sont fréquemment employés dans la recherche sur le VIH/sida : le modèle de BLT (moelle osseuse/foie/Thymus), le modèle PBL (leucocytes périphériques de sang) et le modèle SRC (cellule de repeuplement de SCID) 3. modèle le BLT est créé via transplantation chirurgicale du foie foetal humain et le thymus sous la capsule rénale de souris accompagné d’une injection intraveineuse de foetus foie autorenouveler3,17,18. Le modèle de souris BLT offre une efficacité élevée de greffe, développement de cellules hématopoïétiques humaines dans toutes les lignées et mise en place d’un système immunitaire fort ; en outre, les lymphocytes T sont instruits dans un thymus autologue humain et pièce restriction HLA des réponses immunitaires4,5,17,19. Toutefois, l’obligation pour les procédures chirurgicales reste l’inconvénient majeur du modèle BLT. Le modèle de souris PBL est établi par une injection intraveineuse avec des cellules lymphoïdes périphériques humaines. Le modèle PBL offre commodité et rendements greffe réussie de lymphocytes, mais son application est limitée en raison insuffisante de B-cellule et greffe de cellules myéloïdes, greffe faible niveaux globales et l’apparition de sévère greffon - versus - host disease (GVHD)3 ,,20. Le modèle de souris SRC s’établit par l’injection de csh humaine dans nouveau-né ou un jeunes adultes souris SCID. Il montre efficacité greffe moyen supérieur à 25 % (évalué comme sang périphérique CD45 pourcentage) et prend en charge le développement de multiple-lignée de csh injectée et l’élaboration d’un système immunitaire inné. Toutefois, la limitation du modèle SRC est que la réponse des lymphocytes est souris H2 restreints au lieu de restriction HLA humain14,21.
Le modèle de souris SRC est considéré comme un modèle fiable et facile pour le VIH/sida petits animaux des études précliniques, illustrée par la prise de greffe cohérente d’un système immunitaire et hématopoïétique mise au point. Précédemment, nous avons signalé la mise en place d’un modèle de souris de NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) et décrit son application dans la réplication du VIH et de la latence des études22,23,24. Ce modèle de souris de hu-NSG présente des niveaux élevés de domiciliation de la moelle osseuse, la susceptibilité à l’infection par le VIH et la récapitulation de l’infection par le VIH et la pathogenèse. En outre, le modèle de souris de hu-NSG réagit de façon appropriée à une thérapie antirétrovirale combinatoire (charrette) et récapitule le rebond viral plasmatique après le retrait de chariot, confirmant la mise en place d’un VIH latence réservoir25,26 ,,27. Ce réservoir de latence du VIH est étayé par la production d’aptes à la réplication du VIH virus ex vivo induite par l’homme au repos CD4 + T-cellules isolées de souris infectés et traités panier hu-NSG.
Ici, les auteurs décrivent le protocole détaillé pour la mise en place du modèle souris hu-NSG de souris néonatales de soins infirmiers, y compris les procédures relies au traitement du VIH infection et panier pour le développement de la latence. Nous espérons que ce protocole d’offrir un nouvel ensemble d’approches dans les études sur des animaux concernant le VIH virologie, latence et traitement du VIH.

<table><tbody><tr><td>CD34 MicroBead Kit, humain</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-046-703</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS2</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07932</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji </td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>Commander des reproducteurs au lieu de souris expérimentales</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-806-3204</td><td>Commander par l’intermédiaire d’une animalerie, article restreint</td></tr><tr><td>Désinfectant Clidox</td><td>Fisher Sicentific</td><td>NC9189926</td><td></td></tr><tr><td>Wescodyne</td><td>Fisher Sicentific</td><td>19-818-419</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 80508 seringue/aiguille</td><td>Hamilton</td><td>80508</td><td></td></tr><tr><td>Tube de prélèvement sanguin sur mesure (K2EDTA)</td><td>BD Bioscience</td><td>367843</td><td></td></tr><tr><td>Tube de prélèvement sanguin (héparine)</td><td>BD Bioscience</td><td>365965</td><td></td></tr><tr><td>Tube capillaire (héparinisé)</td><td>Fisher Sicentific</td><td>22-362574</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Mini kit d’ARN viral</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix</td><td>Thermofisher</td><td>4444434</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>IgG du sérum humain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506-100MG</td><td></td></tr><tr><td>IgG du sérum de souris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5381-10MG</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Souris anti-humaine CD45 (clone HI30)</td><td>BD Biosciences</td><td>564586</td><td>RRID : AB_2732068, LOT 6347696</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Souris anti-humaine CD3 (clone SK7)</td><td>BD Biosciences</td><td>557851</td><td>RRID : AB_396896, LOT 6021877</td></tr><tr><td>Souris bleu Pacifique anti-humaine CD4 (Clone RPA-T4)</td><td>BD Biosciences</td><td>558116</td><td>RRID : AB_397037, LOT</td></tr><tr><td>6224744 BUV395 Souris CD8 (clone RPA-T8)</td><td>BD Biosciences</td><td>563795</td><td>RRID : AB_2722501, LOT 6210668</td></tr><tr><td>Souris APC-Alexa Fluor 750 Anti-Human CD14 (TuK4)</td><td>ThermoFisher</td><td>MHCD1427</td><td>RRID : AB_10373536, LOT 1684947A</td></tr><tr><td>PE Souris Anti-Human CD19 (SJ25-C1)</td><td>ThermoFisher</td><td>MHCD1904</td><td>RRID : AB_10373382, LOT 1725304B</td></tr></tbody></table>

(hu-nsg) souris humanisée nod/scid/il2rγnull modèle d’études de latence et de réplication du vih

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Règlements éthiques et les défis techniques de recherche en pathologie humaine, immunologie et développement thérapeutique ont mis des petits modèles animaux en forte demande. Avec une étroite ressemblance génétique et comportementale pour les humains, petits animaux tels que la souris sont de bons candidats pour les modèles de maladies humaines, à travers lequel les réponses et l’homme-comme des symptômes peuvent être récapitulées. En outre, le bagage génétique de la souris peut être modifié pour tenir compte des demandes diverses. La sourisnull (NSG) de NOD/SCID/IL2rγ est une des souches de souris immunodéprimées plus largement utilisé ; Il permet la greffe avec des cellules souches hématopoïétiques humaines et/ou des tissus humains et le développement ultérieur du système immunitaire humain fonctionnel. Il s’agit d’un jalon essentiel dans la compréhension le pronostic et la physiopathologie des maladies humaines spécifiques telles que le VIH/sida et d’aider à la recherche d’un remède. Ici, nous présentons un protocole détaillé permettant de générer un modèle de souris humanisé NSG (hu-NSG) par transplantation de cellules souches hématopoïétiques dans une souris NSG néonatale conditionné par rayonnement. Le modèle murin de hu-NSG montre le développement de lignées multiples des cellules souches humaines transplantées et de susceptibilité à l’infection virale du VIH-1. Il récapitule aussi des caractéristiques biologiques clés en réponse à un traitement antirétroviral combinatoire (cART).

Analyse en cytométrie en flux est souvent effectué pour valider la pureté du CSH isolé, évaluer les niveaux de prise de greffe, le profil des réponses immunitaires aux infections virales et efficacité de chariot de l’enquête. Un panel d’anticorps typique contient des anticorps fluorescent étiquetés individuelles 4-6 ; ainsi, un cytomètre en flux avec plusieurs lasers et un large choix de filtres est crucial pour parvenir à des résultats précis.
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Ce protocole fournit une méthode pour établir des souris humanisées (hu-NSG) via intrahépatique injection de cellules souches hématopoïétiques humaines à des souris NSG néonatales conditionné par rayonnement. La souris de l’hu-NSG est sensible à l’infection par le VIH et combinatoire antirétrovirales (cART) et sert de modèle physiopathologique adapté pour les enquêtes de réplication et latence du VIH.

(Hu-NSG) souris humanisée NOD/SCID/IL2rγnull modèle d’études de latence et de réplication du VIH

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Ces questions peuvent aider à répondre aux questions clés de la recherche sur le VIH/sida, telles que le mécanisme moléculaire et le pronostic de l’infection par le VIH, et comment et où le réservoir de latence est établi. L’avantage de cette technique est qu’elle n’est pas invasive et qu’elle a établi une souris hu-NSG qui doit traiter un développement multi-lignée sur les cellules souches humaines transplantées qui sont sensibles à l’infection par le VIH et qui sont réceptives à la multithérapie. Commencez par filtrer un échantillon digéré, humain, fœtal, hépatique, slurry à travers un stérile, 70 micromètres, nylon, passoire à mailles pour obtenir une suspension à cellule unique, et enrichir pour CD34 + HSCs par tri cellulaire magnétique activé selon les instructions du fabricant.Après dépouillement, suspendre à nouveau le HSC à une concentration de deux fois dix à sept cellules viables par millilitre de concentration en DPBS frais sur la glace. Placez ensuite un NOD humain néonatal entier/SCID/gamma ou une litière de souris NSG dans une cage stérile, en forme de tarte, irradiation, et traitez les animaux avec 200 à 250 centigrades de rayons gamma provenant d’une source de rayonnement césium-137. Chargez ensuite les cellules dans une seringue Hamilton 80508 de 50 microlitres sur mesure, munie d’une aiguille de calibre 30, et injectez chaque animal néonatal directement dans le foie avec cinq fois dix à cinq CD34+HSC humains viables et 25 microlitres de DPBS.Dix à douze semaines après l’infection, faites tourner des échantillons de sang rétroorbitaux, périphériques et sanguins de chaque souris par centrifugation, et transférez les supernés plasmatiques dans des tubes de microcentrifugeuse pour un stockage négatif de 80 degrés Celsius, le cas à titre expérimental. Pour la validation de l’engraftment HSC, suspendez les granulés avec 200 microlitres de tampon de lyse de globule rouge, et tirez les suspensions cellulaires dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millimètre pour une incubation de dix minutes à température ambiante. Puis recueillir les globules blancs restants par centrifugation pour deux lavages dans 0,5 millilitres de frais, 0,01 pour cent albumine de sérum bovin, ou BSA, en DPBS par lavage.Après le deuxième lavage, bloquer les cellules avec 100 microlitres de cocktail bloquant pendant vingt minutes à 4 degrés Celsius suivie de l’étiquetage avec le cocktail anticorps approprié d’intérêt à un 2 microlitres d’anticorps par concentration de cellules une fois une à la sixième. Après 30 minutes à 4 degrés Celsius, lavez les cellules deux fois dans le DPBS frais plus BSA, et évaluez les échantillons périphériques de sang par cytométrie de flux selon les protocoles standard pour quantifier le pourcentage de CD45+CD3+CD14+ou CD19+cellules humaines par échantillon. Calculez ensuite le rapport entre les cellules CD4+/CD8+T, et évaluez la charge virale avec dans les échantillons de plasma selon les protocoles standard, quantitatif, reverse transcriptase, PCR.Pour évaluer les effets de l’infection par le VIH, livrer le virus des balles de VIH aux souris anesthésiées, humaines, NSG ayant une population humaine de plus de 20 % de cellules CD45+cell dans leur sang périphérique, à un taux de 200 nanogrammes de P24 par souris par administration intraperitoneal, recueillant des échantillons de sang par saignement rétroorbital toutes les deux semaines, et analysant à la fois le rapport CD4-CD8 et la charge virale plasmatique , comme démontré. Pour la validation de suppression virale fournir aux animaux infectés, humains NSG avec frais, combinatoire, thérapie antirétrovirale, ou cART, dans l’eau sucrée chaque semaine pendant 4 semaines, la collecte d’échantillons de sang via des saignements rétro-orbitaux toutes les deux semaines et d’analyser à la fois le rapport CD4-/CD8 et la charge virale plasmatique comme démontré. Pour évaluer le rebond viral lorsque les charges virales plasmatiques sont inférieures à la limite de détection et le rapport CD4-CD8 est restauré entre 1,5 et 2,5 recueillir des échantillons de sang périphériques par le biais de saignements rétro-orbitaux toutes les 2 semaines après le retrait cART et d’évaluer les échantillons tels qu’ils ont été démontrés.Au cours de la validation initiale de l’engraftment, le nombre humain de cellules CD45+devrait varier de 20 à 80 pour cent, et les sous-ensembles de leucocytes humains devraient apparaître comme des populations discrètes par analyse cytométrique de flux. Le rapport entre cd4+/CD8+cells reste entre 1,5 et 2,5 chez les personnes en bonne santé tandis que l’épuisement significatif des cellules CD4+T est généralement observé lors de l’infection virale. Notamment, le rapport sain est rétabli en réponse au traitement cART.La détection des charges virales plasmatiques par RT PCR quantitatif tout au long de l’infection et du régime cART peut être tracée et utilisée pour évaluer l’efficacité de la livraison virale et le traitement antiviral, respectivement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des études de virologie du VIH/sida et du développement thérapeutique, elle peut également être appliquée à d’autres études liées aux maladies humaines, telles que le cancer, le diabète et les maladies auto-immunes. Le développement du modèle de souris hu-NSG a ouvert la voie à des chercheurs en immunologie et en oncologie pour explorer un nouveau dysfonctionnement et pathologie chez l’homme, en particulier des études mécanistes et thérapeutiques ciblant l’infection chronique par le VIH et le réservoir de latence.

humanized-nodscidil2rnull-hu-nsg-mouse-model-for-hiv-replication

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

La génération et la caractérisation des tumeurs des cellules T spécifiques en utilisant des souris humanisés est décrit ici. Human tissu thymique et génétiquement modifiés cellules souches hématopoïétiques humaines sont transplantées dans des souris immunodéprimées. Cela se traduit par la reconstitution d'un système immunitaire humain ingénierie permettant l'examen in vivo des réponses anti-tumorales immunitaires.

Utilisation de la souris BLT humanisé comme une tumeur de cellules souches Gene Therapy modèle basé sur

La vidéo présente une technique permettant de générer un modèle de souris humanisée avec une immunité artificielle à base de cellules souches contre le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Du tissu thymus fœtal humain et des cellules souches hématopoïétiques (CSH) modifiées sont implantés dans la capsule rénale d’une souris gravement immunodéprimée. Les CSH, qui expriment des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) contre le VIH, sont mélangées dans un mélange de protéines gélatineuses...

Construire un modèle de souris humanisé avec une immunité artificielle contre le VIH

Ce protocole décrit les méthodes de construction d’un modèle murin humanisé de moelle osseuse, de foie et de thymus avec une immunité artificielle à base de cellules souches contre l’infection par le VIH.

De cellules souches Basé Immunité Engineered contre l&#39;infection à VIH dans le modèle humanisé Souris

Ce protocole fournit une méthode fiable pour établir des souris humanisées avec le système immunitaire humain et les cellules hépatiques. Les souris immunodéficientes doublement reconstituées réalisées par injection intrasplégique d'hépatocytes humains et de CD34- cellules souches hématopoïétiques sont sensibles à l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine-1 et récapitulent les lésions hépatiques observées dans patients infectés par le VIH.

Création du modèle de souris TK-NOG humanisé double pour la pathogénie du foie associée au VIH

Un protocole de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de la réactivation efficace du VIH et de la clairance du provirus latentes est décrite et appliqué en testant l’impact des interventions sur la transcription de VIH et d’épissage. Des résultats représentatifs de l’effet de latence inversant agents sur LTR axée sur la transcription et épissage sont fournis.

Haut débit en évaluation in Vitro de latence en inversant les Agents sur le VIH Transcription et épissage

On décrit ici trois approches expérimentales pour étudier la dynamique de l'infection par le VIH chez les souris humanisées. Le premier permet l'étude des événements d'infection chronique, tandis que les deux derniers permettent l'étude des événements aigus après l'infection primaire ou la réactivation virale.

Infection chronique, aigue et réactivée du VIH dans des modèles de souris immunodéficientes humanisés

Nous avons développé un protocole pour la génération et l'évaluation d'un modèle de souris NOG humanisé et infecté par le virus de l'immunodéficience humaine basé sur la greffe de cellules souches, l'exposition intravaginale au virus de l'immunodéficience humaine et l'ARN PCR numérique de gouttelettes Quantification.

Souris NOG humanisées pour l'exposition intravaginale au VIH et le traitement de l'infection par le VIH

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour administrer des médicaments antirétroviraux combinés oraux qui suppriment avec succès la réplication de l’ARN du VIH-1 chez des souris humanisées.

Traitement antirétroviral combiné oral chez des souris humanisées infectées par le VIH-1

Ce protocole décrit comment la combinaison de l’infection EcoHIV avec des souris Tmem119-EGFP offre un système biologique précieux pour l’étude des altérations microgliales et des réservoirs viraux dans des modèles de rongeurs de troubles neurocognitifs associés au VIH.

Identification de cellules infectées par EcoHIV chez des souris transgéniques manipulées par la microglie

VIH tropisme peut être déduite de la région V3 de l'enveloppe virale. V3 est amplifié par PCR en triple en utilisant RT-PCR nichée, séquencé, et interprétées en utilisant un logiciel de bioinformatique. Les échantillons ayant des séquences 1 ou plusieurs (s) avec des scores faibles G2P sont classés comme non-virus R5.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Découvrez comment établir des souris humanisées hu-NSG par injection intra-hépatique de cellules souches CD34+ chez des nouveau-nés irradiés. Ce modèle permet d'étudier la latence et la réplication du VIH.

(Hu-NSG) souris humanisée NOD/SCID/IL2rγ^null modèle d’études de latence et de réplication du VIH

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