Un haut débit de luciferase pour évaluer la protéolyse de la PCSK9 protéase de simple-chiffre d’affaires

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biochimie de PCSK9, telles que les médicaments ou les changements génétiques qui affectent la fonction protéolytique de PCSK9. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une lecture rapide et amplifiable d’un événement biochimique intrinsèquement basse fréquence. Les implications de cette technique s’étendent aux maladies cardiaques athéroscléreuses car la fonction protéolytique PCSK9 est nécessaire pour son effet ultime sur les taux de cholestérol sérique.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de PCSK9 lui-même, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes biochimiques tels que d’autres protéases ayant une activité protéolytique intrinsèquement faible. Pour commencer, aspirez le milieu de chaque cellule T HEK293. Laver avec du PBS et traiter avec le volume minimal de 0,5 % de trypsine-EDTA.

Et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes pour dissocier les cellules de la fiole mère. Ajouter deux volumes de DMEM complétés par 10 % de FBS pour inactiver la trypsine-EDTA. Ensuite, pipetez le liquide dans le flacon de haut en bas plusieurs fois, en délogeant les cellules adhérentes et transférez les cellules dans un tube stérile.

Ensuite, retirez une petite aliquote de cellules. Coloriez avec un volume égal de bleu trypan et transférez les cellules colorées sur une lame, puis utilisez un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules. Centrifugez le tube à 500 fois G pendant cinq minutes pour récupérer les cellules.

Après cela, aspirez le milieu et reconstituez les cellules et le milieu de culture à la concentration souhaitée. À l’aide d’une pipette multicanaux et d’une auge stérile, transférez 100 micromètres des cellules de chaque puits dans une plaque blanche à 96 puits. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Ensuite, préparez la plaque de plasmides à la concentration souhaitée pour la transfection, y compris quatre puits chacun pour le plasmide de contrôle positif, le plasmide de contrôle négatif et le tampon sans plasmide. Tout d’abord, préparez un Master Mix de réactif de transfection lipidique dilué et un Master Mix de réactif de pré-complexation de l’ADN. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux et d’une auge stérile, aliquote 16,8 microlitres du réactif de pré-complexation de l’ADN dilué dans chaque puits d’une plaque à puits profond.

Après cela, utilisez la pipette multicanaux pour transférer 3,2 microlitres de chaque plasmide de la plaque maîtresse à chaque puits de la plaque de puits profonds. Ensuite, à l’aide de la pipette, ajoutez 20 microlitres du mélange de réactifs de transfection lipidique diluée dans chaque puits de la plaque et mélangez soigneusement. Couvrez les plaques et laissez-les reposer à température ambiante pendant 10 à 15 minutes pour former des complexes d’ADN lipidique.

Ensuite, à l’aide de la pipette multicanaux, retirez délicatement le milieu des cellules T 293 dans la plaque à 96 puits. Ensuite, remplacez le Medium par 95 microlitres de DMEM complété par 10 % de FBS. Ensuite, utilisez la pipette multicanaux pour ajouter 10 microlitres du mélange de transfection à chaque puits approprié.

Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Tout d’abord, préparez les solutions mères nécessaires à la fabrication du réactif de dosage de la coelenterazine à double concentration, y compris trois molaires d’ascorbate de sodium dans le PBS, cinq molaires de chlorure de sodium dans de l’eau distillée, 10 milligrammes par millilitre de BSA dans du PBS et deux millimolaires de coelenterazine dans du méthanol acidifié. Ensuite, préparez suffisamment de réactifs de coelenterazine pour la lecture de la luciférase.

Avec un réactif séparé pour chacune des cellules du milieu. Ensuite, mélangez tous les réactifs à l’exception de la coelentérazine. Filtrez le mélange à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre.

Et puis après filtration, ajoutez la coelentérazine. Retirez les cellules de l’incubateur 24 heures après la transfection. Ensuite, utilisez la pipette multicanaux pour transférer 50 microlitres de milieu conditionné de chaque puits vers une plaque blanche fraîche à 96 puits.

À l’aide de la pipette multicanaux, ajoutez 50 microlitres de réactif de coelenterazine non lytique à double concentration dans la plaque contenant uniquement du milieu conditionné. Ensuite, secouez doucement la plaque dans l’obscurité pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. Ensuite, répétez cette étape en ajoutant le réactif de coelenterazine lytique à double concentration sur la plaque contenant les cellules.

Après les incubations, mesurez la luminescence de la plaque Medium only et de la plaque contenant des cellules dans un lecteur de plaques. Enfin, jetez les plaques et enregistrez les fichiers pour une analyse plus approfondie des données. Il est important d’incuber le réactif de luciférase avec la plaque de support uniquement et la plaque contenant des cellules pendant la même durée, car les données de ces plaques sont directement comparées.

Dans ce protocole, la spécificité de la séquence de clivage de la protéase PCSK9 aux sites de substrat P6 à P6 Prime a été évaluée par un test de luciférase. Les changements dans la séquence de clivage aux positions P6 et P4 à P1 Prime sont mal tolérés par la protéase. Mais les positions P5 et P2 Prime à P6 Prime sont plus souples à changer.

De plus, les résultats montrent que les séquences de clivage optimales sont essentiellement les mêmes que les séquences de type Wild. L’activité de clivage relative d’une bibliothèque de cisailles de méssent trouvées en clinique a été comparée à celle de la protéase de type sauvage. Sur les 84 cisailles évaluées, plus de la moitié ont montré des changements significatifs de l’activité par rapport à la protéase de type sauvage, ce qui suggère que des altérations de l’activité de la protéase sont fréquemment observées dans la population clinique.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la cytométrie en flux ou les tests d’absorption du cholestérol dans les hépatocytes, peuvent être effectuées pour évaluer les altérations de la capacité protéolytique de PCSK9 sur l’effet de PCSK9 sur le récepteur LDL.