Name: Une stratégie efficace pour générer des systèmes de Transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile par modification du génome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Découvrez une méthode CRISPR/Cas9 pour créer des systèmes de transcription binaires spécifiques aux tissus chez Drosophila. Cette technique permet d'étudier l'expression génique spatiotemporelle avec précision.

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Nous remercions le Dr F. Port, K. Dr. o ' Connor-Giles et Dr S. Feng pour des discussions sur la stratégie de CRISPR ; Dr. T.B. Kornberg et le centre de Stock Bloomington réactifs ; Installation de base d’imagerie UMD ; et le financement du NIH : R00HL114867 et R35GM124878 à SR.

1. concevoir et construire le gRNA vecteur d’Expression
<ol><li>Pour justement remplacer une région bien définie d’un exon, utilisez un gRNA double approche6, dans lequel chaque gRNA peut cibler spécifiquement les deux extrémités de la région sélectionnée d’intérêt. Pour obtenir une expression spatio-temporelle précise de gène-spécifique du pilote, sélectionnez deux sites de cibles gRNA dans le premier exon codante du gène.</li>
	<li>
Pour Drosophila melanogaster, sélectionnez les sites cibles gRNA à l’aide de l’outil de recherche de cible optimale de le flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Autres outils de conception CRISPR disponibles peuvent être utilisés aussi bien, y compris l’outil optimisé CRISPR Design (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9) et E-CRISP (www.e-crisp.org/E-CRISP). NOTE : Les protocoles suivants de conception gRNA et le clonage a été adopté des méthodes décrites précédemment6,7.<ol>
<li>Copier la séquence réelle dans la case prévue dans l’outil en ligne. Sélectionnez la plus récente Drosophila melanogaster génome annotation version, « r_6, » dans le menu déroulant « Select génome. » Dans la champ « Select guide longueur (nt), » entrée « 20 ». Sélectionnez cette option pour trouver « Toutes les cibles CRISPR » et cliquez sur « Trouver CRISPR cibles ».</li>
		<li>Évaluer toutes les cibles de gRNA candidat en définissant « Maximum » pour la « Rigueur » et « NGG Only » pour « PAM ». Essayez de sélectionner les sites gRNA sans aucun hors-cibles potentielles ou un nombre minimum de possible hors-cibles. Utilisation de l’outil web décrit dans Doench al 2014 8 pour sélectionner gRNAs avec un score de « bonne » activité potentielle.</li>
		<li>En même temps, s’assurer qu’il n’y a aucun polymorphisme simple nucléotide dans les cibles gRNA dans le génome de la ligne mouche parent sélectionné pour injection (Par exemple, amendements-Cas9 sur le chromosome X, BL # 54591). Suivez le protocole décrit à Gratz et coll. 20157 pour extraire l’ADN génomique de la ligne mouche parent. PCR amplification, approximativement, les régions de nt 500 – 1 000 en utilisant des amorces qui flanquent la séquence d’intérêt et une polymérase d’ADN de haute fidélité ; séquence-vérifier les produits PCR amplifié.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pour générer un vecteur d’expression gRNA tandem, suivre une ligature indépendante clonage Protocole6 pour introduire deux séquences de protospacer dans un vecteur d’expression de RNA pCFD4. Notez qu’un vecteur d’expression multi-gRNA améliorée (pCFD5) est maintenant disponible dans laquelle les deux sgRNAs sont exprimés de la forte U6:3 promoteurs9 (https://www.crisprflydesign.org). Utiliser une méthode d’assemblage de l’ADN à cloner le gRNAs dans le vecteur pCFD4.
	<ol>
<li>Concevoir et de commander les amorces avant et arrière pour introduire deux séquences de protospacer dans le RNA expression vector pCFD4 (tableau 1). Comme décrit précédemment6, l’apprêt avant contient la première séquence de protospacer flanquée de régions dont le promoteur U6-1 et gRNA core dans pCFD4 ; l’apprêt inversée contient la séquence inverse de complément de la deuxième protospacer flanquée de régions correspondant au noyau gRNA et promoteur U6-3 en pCDF4.</li>
		<li>Remettre en suspension les amorces à 100 μM et DNase et RNase sans eau bidistillée (ddH2O). Faire une amorce de concentration 10 μM travail. Utilisez le plasmide pCFD4 comme modèle et mettre en place une réaction de PCR utilisant une polymérase de haute fidélité et paramètres pour PCR réaction6recommandés.</li>
		<li>Pour cloner le produit amplifié dans pCFD4, digérer le plasmide pCFD4 avec enzyme BbsI en mettant en place la réaction suivante : 2 – 5 μg de plasmide pCFD4, 5 μL de digestion mémoire tampon 10 x, 1 μL de BbsI enzyme et FD2O pour porter le volume final à 50 μL. Mélanger le contenu de la réaction par doucement tapant le tube et collecte toutes les gouttelettes dispersées de la paroi du tube au fond d’un essorage bref. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 2 h.</li>
		<li>Faire fonctionner l’appareil PCR à l’étape 2 et le produit digéré de l’étape 3 sur un gel d’agarose à 1 %. Effectuer l’électrophorèse pour assez de temps pour séparer complètement les bandes d’ADN. Couper à la bonne taille des bandes d’ADN sous un UV trans-illuminateur avant de purifier les produits attendus à l’aide de la colonne élution de gel suivant les instructions du fabricant (voir Table des matières). Le produit PCR devrait être 600 bp et le plasmide linéarisé pCFD4 devraient être ~6.4 Ko 6.</li>
		<li>Mettre en place la réaction de l’Assemblée de l’ADN dans un tube PCR, par les instructions du fabricant (voir Table des matières).</li>
		<li>Transformer 2 μl du produit Assemblée des bactéries compétentes (DH5α ou des souches similaires avec ΔrecA1, Δ,endA1), plaque d’identification sur l’ampicilline (100 μg/mL) contenant des plaques de gélose LB (LB/Amp) et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Notez que le mélange de l’Assemblée de l’ADN peut être toxique pour certaines souches de bactéries, mais diluer le mélange de l’Assemblée peut réduire la toxicité.</li>
		<li>Choisir des colonies résistantes à l’ampicilline 3 et 4 de la plaque incubés pendant la nuit, inoculer la colonie dans 3 mL LB contenant 100 ampicilline μg/mL et cultiver des bactéries inoculées dans un shaker de 37 ° C pendant la nuit. Extrait de plasmide de bactéries cultivées pendant la nuit en utilisant le kit de mini-préparent de plasmide suivant les instructions du fabricant (voir Table des matières).</li>
		<li>Les plasmides avec T3 amorce universelle pour dépister les clones corrects contenant la tandem gRNA insertion de séquences. Mettre en place un stock de glycérol de bactéries transformées avec une séquence-vérifié pCFD4-gRNA dans 20 % de glycérol et de stocker dans un congélateur à-80 ° C pour une utilisation future.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. concevoir et construire le donateur HDR
<ol><li>
Pour génomique knock-in d’une séquence de Gal4 ou LexA , concevoir un donneur HDR double brin qui contient la séquence de transactivateur flanquée de deux bras de l’homologie.
	<ol>
<li>Utilisation > 1,5 Ko gauche et bras droit d’homologie flanquant le ciblage gRNA site (s). Bras étendus homologie accroître l’efficacité de HDR durant le processus de réparation 10.</li>
		<li>PCR amplifier les bras d’homologie de l’ADN génomique (ADNg) extrait de la ligne mouche parent sélectionnée pour injection (Par exemple, amendements-Cas9 (sur le chromosome X), BL # 54591). Utiliser une relecture hot-start Taq ADN polymérase enzyme adapté aux longues extension de PCR (voir Table des matières). Séquence-vérifier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour éviter de reciblage de la gRNA au locus machiné, concevoir le donateur de remplacement de telle manière que les sites de reconnaissance gRNA soient perturbés par la séquence exogène introduite. Remarque : pour éviter d’altérer les éléments cis-régulateurs putatifs, toujours choisir les sites de reconnaissance gRNA au sein de la région codante de l’exon.</li>
	<li>
Pour générer une cassette de remplacement, planifier la stratégie de l’Assemblée de l’ADN pour réunir les quatre segments : les bras d’homologie 5' et 3', la séquence d’ADN intermédiaire transactivateur exogènes et le clonage linéarisé vecteur colonne vertébrale (par exemple, pUC19 ou autre couramment utilisé la clonage vecteurs). Suivant les directives du fabricant pour l’assemblage de l’ADN (voir Table des matières), concevoir les amorces convenables pour l’amplification PCR et l’assemblage de chaque segment. Remettre en suspension les amorces à 100 μM avec FD2O. faire une amorce de concentration 10 μM travail. Utilisez haute fidélité polymérase pour toutes les réactions de PCR. Suivre le protocole suivant :
	<ol>
<li>PCR amplifier une cassette d’expression de Gal4 ou LexA de vecteur disponible (par exemple, nls-LexA:p65; les plasmides d’expression de Gal4/LexA/QF2 idéales peuvent être trouvés et obtenus à partir des ressources communes telles que Addgene) à l’aide de la amorces répertoriés dans le tableau 1 b.<ol>
<li>Pour conserver tous les règlements transcriptionnelles et post-transcriptionnelle originales de l’exon remplacé sur l’expression de la séquence d’ADN transactivateur, concevoir la cassette de telle manière que l’allèle génomique édité exprimerait un ARNm chimérique de la transactivateur et le gène. Préserver l’extrémité 5' et 3' de l’exon ciblée de conserver tout signal d’épissage.</li>
			<li>Incorporer une séquence de peptide de T2A un clivage entre les résidus de 5' codage exon et la séquence de transactivateur pour empêcher la traduction en protéine chimérique. Ajouter un codon d’arrêt traduction après la séquence exogène transactivateur (Figure 5).</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR amplifier les bras d’homologie de l’ADN génomique (ADNg) extrait de la ligne mouche parent sélectionnée pour injection (Par exemple, amendements-Cas9 (sur le chromosome X), BL # 54591) avec les amorces qui figurent dans le tableau 1 b. Utiliser la polymérase haute fidélité pour toutes les réactions de PCR utilisant les systèmes comme suit : 5 μL de 5 x tampon de réaction, 0,5 μL des dNTPs 10 mM, 1.25 μL de 10 μM Forward Primer, 1,25 μL de 10 μM Reverse Primer, 0,5 μL de modèle ADN, 0,25 μL de haute fidélité ADN polymérase , 16.25 μL de ddH2O.</li>
		<li>Utiliser le vecteur linéarisé de clonage tel que pUC19. Un certain nombre de vecteurs de donateurs est maintenant disponible. Voir la liste complète sur le site suivant-http://flycrispr.molbio.wisc.edu.</li>
		<li>Exécuter les produits PCR sur un gel d’agarose à 1 %. Effectuer l’électrophorèse pour assez de temps pour assurer une séparation claire de la bande souhaitée des bandes indésirables non spécifique (le cas échéant). Gel-purifier les fragments d’ADN attendues. Mesurer la concentration de chaque fragment d’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
		<li>Mettre en place la réaction de l’Assemblée d’ADN suivant les instructions du fabricant. Mélanger les fragments clonage linéarisés de vecteur et cible de l’étape 3 et l’étape 4 dans la réaction suivante : 1 μL de linéaire clonage vector (50 ng/μl), 2 – 3 fois excès de chaque fragment de la cible, 10 μL de 2 x mélange principal d’ADN Assemblée, porter le volume réactionnel final à 20 μL avec ddH < C21 > 2O. Incuber le mélange pendant 1 heure à 50 ° C.</li>
		<li>Transformer 2 μl du produit Assemblée en bactéries compétentes, plaque sur plaques de gélose LB/Amp contenant 100 ampicilline μg/mL. En outre, ajouter X-Gal + IPTG sur la plaque pour le dépistage de bleu/blanc.</li>
		<li>Prélever des colonies blancs 3 et 4 de la plaque incubés pendant la nuit, inoculer la colonie dans 3 mL LB contenant 100 ampicilline μg/mL et grandir à 37 ° C durant la nuit dans un shaker. Manuel de l’extrait de plasmide de bactéries cultivées pendant la nuit en utilisant le kit de mini-préparent de plasmide suivant le fabricant (voir Table des matières).</li>
		<li>Écran la colonie positif par PCR ou la restriction de la digestion.</li>
		<li>Séquence de vérifier la région de donateurs HDR du plasmide final. Sauver un stock bactérien transformé avec les clones correctes en glycérol de 20 % à-80 ° C pour l’inoculation future.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. embryon Injection, mouche de la génétique et le dépistage pour l’édition de génome
<ol><li>Préparer le grand vecteur d’expression exempte d’endotoxine gRNA pureté ainsi que le plasmide de donateurs HDR à l’aide d’un plasmide maxiprep nécessaire (voir la Table des matières).</li>
	<li>Co, injecter le plasmide d’expression gRNA (100 ng/μL) et le donateur de remplacement (500 ng/μL) dans la lignée germinale des Amendements-Cas9 embryons6. Remarque : nous utilisons un service commercial pour l’injection, mais cette procédure peut être effectuée aussi bien en laboratoire.</li>
	<li>
Mouche de la génétique et le dépistage (Figure 2 et Figure 3) :
	<ol>
<li>Lorsque les embryons injectées se développent en adultes, Croix chaque unique G0 vole à balancer les mouches. Sélectionnez équilibreur adapté pour le chromosome contenant l’allèle ciblée.</li>
		<li>Anesthésier la F1 progéniture de chaque G0 traverse sur un bloc de2 CO et choisir au hasard 10 à 20 hommes sous un stéréomicroscope. Les croix individuellement aux femelles équilibreur tel qu’illustré à la Figure 3.</li>
		<li>Quand l’éclosion de larves de F2, choisissez le père célibataire de F1 de chaque croisement et extrait ADNg en utilisant la mouche protocole ADN génomique unique préparation :<ol>
<li>Préparer le tampon d’extraction ADNg : pH 10 mM Tris-Cl 8.2, EDTA 1 mM, 25 mM NaCl, conserver à température ambiante. Préparer 20 mg/mL solution protéinase K et stocker dans le congélateur.</li>
			<li>Mettre chaque volée dans un tube à centrifuger-micro 1,5 mL et l’étiquette du tube. Garder au congélateur à-80 ° C durant la nuit.</li>
			<li>Préparer un volume de travail frais de tampon d’extraction ADNg contenant la concentration finale de 200 µg/mL de protéinase K. Remarque : N’utilisez pas un vieux tampon pour cette étape.</li>
			<li>Écraser chaque volée pour 10 à 15 s avec un embout de la pipette contenant 50 μL d’empiète sur le tampon sans distribuer le liquide. Diluer le tampon reste dans le tube et bien mélanger. Incuber à 37 ° C pendant 20 à 30 min.</li>
			<li>Mettre les tubes dans le bloc chauffant 95 ° C pendant 1 à 2 minutes inactiver la protéinase k</li>
			<li>Tournez vers le bas pendant 5 min à 10 000 x g. Stocker la préparation à 4 ° C pour une analyse ultérieure des PCR.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser la même méthode pour préparer ADNg d’une mouche Amendements-Cas9 , qui sert de témoin négatif. Effectuer des écrans PCR selon trois étapes afin d’identifier le HDR (Figure 2, Figure 5) correct « finit par » utilisant ADNg de chaque mâle F1 comme un modèle de5. Utiliser 1 μL de la préparation de l’ADN dans le système de réaction PCR suivant : 10 μL de 2 x PCR Master Mix avec colorant, 1 μL de chaque amorce (10 μM), 1 μL de la matrice d’ADN et 7 μL de ddH2O.</li>
	<li>Comme le montre la Figure 5 a, effectuer des PCR avec des amorces fwd1 et rev1 à l’écran pour l’existence de l’insertion ou remplacement ; effectuer des PCR avec des amorces fwd2 et rev2 pour vérifier l’insertion ou remplacement de la région 3' ; effectuer le PCR avec des amorces M13F et rev3 pour vérifier « se termine en » HDR (tableau 1).</li>
	<li>Garder les lignes mouches avec le HDR extrémités-out confirmé et d’établir des stocks équilibrées de la génération F2. Croiser à le mouches équilibreur nouveau pour enlever toute mutations inattendues sur d’autres chromosomes.</li>
	<li>
Préparer l’ADNg de haute qualité provenant des stocks établis d’amplification PCR longue (> 800-1 000 nt) amplicon avec haute fidélité Taq polymérase et entièrement la séquence vérifier les amplicons obtenus à partir des régions génomiques machinées. Également utiliser ADNg brut extrait comme décrit précédemment pour amplifier plus courte (< 800 nt), chevauchement des produits PCR pour séquence-valider le génome modifié. Le protocole suivant permet de préparer l’ADN génomique de drosophile de bonne qualité :
	<ol>
<li>Mettre environ 25 mouches adultes dans un tube de microtubes de 1,5 mL et gel dans le congélateur-20 ° C ou à-80 ° C pendant au moins 1 heure.</li>
		<li>Ajouter 250 μL de Solution A (pH 9,0 Tris HCl 0,1 M, EDTA 0,1 M, SDS 1 %).</li>
		<li>Homogénéiser les mouches à l’aide de l’homogénéisation pilons dans des microtubes à centrifuger et mettre le tube sur la glace.</li>
		<li>Incuber à 70 ° C pendant 30 min.</li>
		<li>Ajouter 35 μL de KACO (5 M), secouer et bien mélanger, mais ne pas vortexer.</li>
		<li>Incuber sur glace pendant 30 min.</li>
		<li>Tournant à 12 000 g pendant 15 min.</li>
		<li>Avec une micropipette de 1 mL, soigneusement transférer seulement le surnageant clair dans un nouveau tube, laissant retourner n’importe quel précipité ou interphase.</li>
		<li>Ajouter 150 μL d’isopropanol pour le surnageant. Mélanger doucement par inversion.</li>
		<li>Filer à 10 000 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Avec précaution, retirez le surnageant et laisser le diabolo dans le tube.</li>
		<li>Laver le culot avec 1 mL 70 % EtOH.</li>
		<li>Tournant à 12 000 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Retirez le surnageant. Sécher à l’air le culot pour 15 à 20 min. Ne pas sécher le culot.</li>
		<li>Dissoudre le culot dans 100 μl de ddH2O.</li>
		<li>Utilisez haute fidélité ADN polymérase adapté aux longues amplicon (> 800 bp) pour amplifier la région éditée complete. Idéalement, prenez deux amorces en dehors de la cassette insérée pour amplifier la région génomique. Gel de purifier le produit PCR, et comme décrit précédemment, la séquence vérifier le produit avec des amorces multiples qui se chevauchent.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Valider les configurations d’expression spatio-temporelle correcte de tissus/embryons disséqués des lignes mouches ingénieries :
	<ol>
<li>Effectuer RT-PCR à partir de l’ARN total pour vérifier l’expression du produit ARNm hybride (tableau 1).</li>
		<li>Effectuer une hybridation in situ du produit de l’intérêt dans le tissus/embryon larvaire de valider l’expression ARNm.</li>
		<li>À l’écran pour les modèles précis expression spatio-temporelle spécifique des tissus parmi les lignes de sortie se termine séquence-vérifié, traverser chaque ligne modifiée obtenue pour le pilote d’expression binaire avec le LexO- GFP ou LexO- DP (pour LexA pilote) line (disponible auprès des centres de stock de Bloomington) et observez la LexA ou Gal4 conduit l’expression du gène rapporteur dans des tissus embryonnaires, larves et adultes sous un microscope à fluorescence.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Traditionnellement, pièges de renforceur de drosophile ont été générés par deux méthodes différentes. Une des façons comprend insertion aléatoire d’un conducteur (eg., Gal4) séquence du génome par transposition (e.g., transposition de l’élément P)1 . Par ailleurs, les séquences de conducteur peuvent être placés sous le contrôle transcriptionnel d’une région d’enhancer/promoteur présumé dans une construction de plasmide, qui serait ensuite intégrée dans un site ectopique ...

La boîte à outils génétique pour l’expression des gènes ciblés a été bien développé chez la drosophile, ce qui en fait l’un des meilleurs systèmes de modèle pour étudier la fonction des gènes impliqués dans une grande variété de processus cellulaires. Systèmes d’expression binaire, telles que la levure Gal4/UAS (séquence activatrice en amont), a été adopté pour les études de piégeage et gène exhausteur de tissu-spécifiques dans la drosophile modèle génétique1 (Figure 1). Ce système a facilité l’élaboration d’un grand nombre de techniques telles que le règlement spatio-temporelle de la surexpression du gène, études, knockout dans certains groupes de cellules ainsi que dans l’ablation de la cellule, marquage cellulaire, traçage direct du cellulaire et moléculaire processus en embryon et tissus, suivi de lignée et analyses de mosaïque au cours du développement. Un certain nombre de système de transcription binaires, tels que les bactéries LexA/LexAop système (Figure 1) et Q-système de Neurospora , sont de puissants outils génétiques qui sont maintenant largement utilisés chez la drosophile, en plus de le système de Gal4/UAS original pour l’expression de gène ciblé pour1,2,3.
Nous présentons ici une méthode pour générer le système très fiable expression binaire spécifique des tissus en employant une technique de modification du génome. Les progrès récents dans la technologie d’édition CRISPR/Cas9 génome ont permis des possibilités sans précédent apporter des modifications du génome dirigée dans un large éventail d’organismes. Par rapport aux autres techniques de modification du génome disponible, le système CRISPR/Cas9 est peu coûteux, efficace et fiable. Cette technologie utilise des composants du système immunitaire adaptatif bactérien : une endonucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes qui crée une pause bicaténaires (DSB) et un ARN chimérique guide (gRNA), qui guide le Cas9 à un site particulier génome pour ORD ciblée4. Les cellules contiennent la machinerie pour réparer l’ORD en utilisant différentes voies. Fin non homologue rejoindre (NHEJ) conduit à petites insertions ou suppressions de perturber la fonction du gène, alors que la réparation axés sur l’homologie (HDR) introduit un défini réalisé/recherchées génomique dans/knock-knock-out par une donneuse HDR exogène en utilisant comme modèle. La stratégie de remplacement axés sur le HDR peut être efficacement utilisée pour générer un système hautement fiable expression binaire spécifique des tissus qui peut surmonter toutes les limites des méthodes traditionnelles enhancer trap. Nous décrivons une procédure pas à pas pour une utilisation de réparation de base CRISPR/Cas9 HDR dans la production d’une ligne pilote binaire de transcription qui s’exprime sous le contrôle d’endogène régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle d’un Drosophila gène. Dans ce protocole, nous démontrons la génération d’une ligne pilote spécifique pour dépourvu de branches (bnl) gène codant pour une protéine de famille FGF qui réglemente la morphogenèse ramification de trachéale bronchique épithélium5. Dans cet exemple, le premier codage exon du gène bnl a été remplacé par l’enchaînement d’une séquence de transactivateur LexA bactérienne sans altérer toute endogène cis-séquences régulatrices du gène bnl . Nous montrons que la stratégie a généré une ligne pilote de bnl-LexA spatio-temporelle contrôle l’expression d’un gène rapporteur placé en aval de LexAoperator (LexAop ou LexO) exclusivement dans bnl- cellules épithéliales/mésenchymateuses/neuronales exprimant.

<table><tbody><tr><td>X-Gal/IPTG</td><td>Gentrox (Genesee Scientific)</td><td>18-218</td><td>clonage</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>BD Difco</td><td>BD&nbsp ; 244520</td><td>clonage</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1161</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free</td><td>Water ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>10 % SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71736</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>KOAc</td><td>Fisher-Scientific</td><td>P1190</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher-Scientific</td><td>04-355-451</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>GeneJET Miniprep</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td>Miniprep</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210006</td><td>Maxiprep</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R0539S</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>Amorces</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>pCFD4</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>Modèle d’ADN et vecteur pour ARNg</td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK2601</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Q5-high fidelity Taq</td><td>NEB</td><td>NEB #M0491</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>NEB #E2611</td><td>Assemblage de l’ADN</td></tr><tr><td>pBPnlsLexA :p65Uw</td><td>Modèle d’ADN Addgene</td><td></td><td>pour l’amplification LexA</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>2x PCR PreMix, avec colorant (rouge)</td><td>Sydlab</td><td>MB067-EQ2R</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Kit d’élution de gel</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-300</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Réactif</td> <td>TRISigma-Aldrich</td><td></td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Kits de purification d’ARN Direct-zol</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-330</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>OneTaq One-Step RT-PCR Kit</td><td>NEB</td><td>E5315S</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>lexO-CherryCAAX</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>Fly line</td></tr><tr><td>UAS-CD8 :GFP</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Ligne de mouche</td></tr><tr><td>btl-Gal4</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Mouche</td></tr><tr><td>Mouche MKRS/TB6B</td><td>Kornberg</td><td></td><td>lab.</td></tr><tr><td>Mouche Microscope confocal SP5X</td><td>Leica</td><td></td><td>Imagerie motif d’expression</td></tr><tr><td>CO2 station</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td>Fly</tr><tr><td>Microscope Olympus</td><td></td><td>SZ-61</td> fly <td>pushing</td></tr><tr><td>Pilons homogénéisants à microtubes</td><td>Fisher-Scientific</td><td>03-421-217</td><td>isolement de l’ADN génomique</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>quantification de l’ADN</td></tr></tbody></table>

une stratégie efficace pour générer des systèmes de transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile par modification du génome

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Systèmes de transcription binaires sont de puissants outils génétiques, largement utilisés pour visualiser et manipuler des cellules sort et l’expression génétique dans des groupes spécifiques de cellules ou tissus chez les organismes modèles. Ces systèmes contiennent deux composantes dans des lignes distinctes de transgéniques. Une ligne pilote exprime un activateur de la transcription sous le contrôle des promoteurs/exhausteurs de tissu-spécifiques et un ports de ligne journaliste/effecteur un gène cible placé en aval du site de liaison de l’activateur de transcription. Animaux hébergeant les deux composants induire la transactivation de tissu-spécifique d’une expression du gène cible. Expression spatio-temporelle précise du gène dans les tissus ciblés est critique pour l’interprétation impartiale de l’activité cellulaire/génétique. Par conséquent, l’élaboration d’une méthode pour générer les lignes exclusives spécifiques des cellules/tissus conducteur est essentiel. Nous présentons une méthode pour générer le système hautement spécifique aux tissus expression ciblée en employant un « groupés régulièrement Interspaced Short palindromique Repeat/CRISPR-associés » (CRISPR/AR)-base de génome édition technique. Dans cette méthode, l’endonucléase Cas9 est ciblé par deux chimérique guide RNAs (gRNA) à des sites spécifiques dans le premier exon codante d’un gène dans le génome de la drosophile pour créer des cassures double-brin (DSB). Par la suite, les mécanismes de réparation cellulaire autonome à l’aide d’un plasmide de donneurs exogènes qui contient la séquence de transactivateur, permet réparation axés sur l’homologie (HDR) de l’ORD, ayant pour résultat précise suppression et le remplacement de l’exon avec le transactivateur séquence. Le transactivateur frappé composant logiciel enfichable est exprimée exclusivement dans les cellules où le cis-éléments de régulation du gène remplacé sont fonctionnels. Le protocole étape par étape détaillé présenté ici pour générer un pilote binaire de transcriptional exprimé dans drosophile fgf/sans branches-produisant des cellules épithéliales/neuronales peut être adoptée pour n’importe quelle expression de gène - ou tissu-spécifique.

Ce protocole a été utilisé avec succès pour générer une expression binaire ciblées journaliste système spécifique pour bnl exprimant les cellules5. Le cis-éléments de régulation (CREs) qui contrôlent l’expression spatio-temporelle complexe bnl ne sont pas caractérisés. Par conséquent, pour atteindre l’expression spatio-temporelle sous le contrôle de la séquence de réglementation endogène bnl , seulement le premier exon codage de ...

Nous présentons ici une méthode pour générer des systèmes de transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile en remplaçant le premier exon codante des gènes avec les pilotes de la transcription. La méthode CRISPR/Cas9 met une séquence transactivateur en vertu du règlement endogène d’un gène remplacé et par conséquent facilite transctivator expression exclusivement dans des modèles spatio-temporels de gène-spécifique.

Une stratégie efficace pour générer des systèmes de Transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile par modification du génome

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

L’objectif global de cette méthode est de générer un système d’expression ciblée hautement spécifique aux tissus. Dans cette méthode, nous avons démontré la génération d’un pilote transcriptionnel binaire spécifique à notre homolog Drosophila FGF, sans branche. L’expression dynamique et spatiotemporal de branchless régule l’hémogenèse de branche de l’épithélium trachéal de voie aérienne.Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’expression spatiotemporale et de la migration des cellules productrices sans branches, elle peut être facilement appliquée à d’autres gènes et tissus dans Drosophila ou dans d’autres organismes modèles, tels que C.Elegans et zebrafish. Le principal avantage de cette technique est qu’elle génère des systèmes d’expression hautement fiables, spécifiques aux tissus et aux gènes, et actifs exclusivement dans les cellules où les éléments réglementaires cis du gène remplacé sont fonctionnels. Les systèmes de transcription binaire sont des outils essentiels pour l’expression et la manipulation ciblées des gènes.Un activateur trans, tel que GAL4 ou LexA, exprimé sous le contrôle d’éléments réglementaires cis d’un gène, conduisent un gène trans effecteur pl

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Developmental Biology

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Cette vidéo décrit une méthode de criblage pour identifier les mouches Drosophila transgéniques, dont le génome a été modifié à l’aide de CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 est un puissant outil d'édition du génome qui a révolutionné la façon dont les scientifiques peuvent manipuler le génome d'un organisme. Dans l’exemple de protocole, nous verrons comment identifier les mutants générés par CRISPR, dans lesquels l’insertion d’une séquence de transactivation remplace le premier exon du gène sans branche...

Dépistage des modifications génomiques : une méthode pour identifier les mutants générés par CRISPR chez la drosophile

Techniques de recombinaison homologue progresser...

Recombineering homologues constructions de recombinaison<em&gt; Drosophila</em

nucléases de créateurs tels que nucléases à doigts de zinc (ZFN) et transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens) peuvent être utilisés pour modifier le génome d'embryons de pré-implantation de souris en déclenchant à la fois la fin non homologue rejoindre (NHEJ) et la recombinaison homologue (RH) des voies. Ces progrès permettent la génération rapide de la souris avec des modifications génétiques précises.

Souris ingénierie des génomes Utilisation nucléases de créateurs

La meilleure approche de la validation expérimentale de l’activité de l’amplificateur est l’analyse de perte de fonction. Voici un protocole efficace qui utilise la délétion médiée par CRISPR/Cas9 pour étudier la régulation de la transcription des gènes spécifique de l’allèle dans les cellules ES F1 qui contiennent un génome hybride (Mus musculus129 x Mus castaneus).

CRISPR Génération / cas9 Mediated monoallélique Suppressions pour étudier la fonction Enhancer dans souris cellules souches embryonnaires

Édition de génome ciblé dans le système de modèle Danio rerio (poisson-zèbre) a été grandement facilitée par l’émergence des approches axées sur les CRISPR. Ici, nous décrivons un protocole simplifié et robuste pour la génération et l’identification d’allèles de dérivés CRISPR non-sens qui intègre l’analyse de mobilité hétéroduplex et l’identification des mutations à l’aide de séquençage de prochaine génération.

Une Production efficace et généré par l’Identification de CRISPR/Cas9 les débouchures de gène dans le modèle système Danio rerio

Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de l’enzyme Cas13D ciblant l’ARN (RfxCas13D) chez les mouches.

Ciblage de l’ARN omniprésent et spécifique aux tissus chez Drosophila Melanogaster à l’aide de CRISPR/CasRx

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Protocoles pour la mutagenèse CRISPR/Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis

Ici, nous décrivons une technique simple destinée à la génération efficace de souris génétiquement modifiées appelée CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Cette méthode délivre des réactifs d’édition par électroporation dans des embryons avec une efficacité proche de 100%. Ce protocole est efficace pour les mutations ponctuelles, les petites insertions génomiques et les délétions dans les embryons de mammifères.

Édition efficace du génome de souris par électroporation CRISPR de zygotes

Ici, nous présentons un protocole simplifié de marquage génétique endogène pour la drosophile, qui utilise une technique basée sur la PCR pour l’identification sans marqueur des modifications génétiques réussies, facilitant le développement de lignées d’inclusion stables.

Stratégie basée sur CRISPR en une étape pour le marquage des gènes endogènes chez Drosophila melanogaster

Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole optimisé pour la micro-injection embryonnaire, une étape cruciale pour la création de mouches transgéniques.

Microinjection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile

La délivrance des éditeurs génomiques sous forme d’ARN est un moyen particulièrement puissant de modifier les génomes des cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères. L’objectif de ce protocole est de délivrer des éditeurs de génome sous forme d’ARNm dans les cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères, suivis d’un séquençage ciblé Illumina et d’une analyse afin de quantifier les résultats d’édition.

Édition génomique dans les cellules primaires de mammifères via électroporation de l’ARN éditeur

Découvrez une méthode CRISPR/Cas9 pour créer des systèmes de transcription binaires spécifiques aux tissus chez Drosophila. Cette technique permet d'étudier l'expression génique spatiotemporelle avec précision.

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