Name: Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez la technique Adipo-Clear pour l'imagerie 3D du tissu adipeux en biologie. Cette méthode de clarification préserve l'architecture tridimensionnelle tout en éliminant les lipides excédentaires.

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Nous remercions Christina Pyrgaki, Tao Tong et Alison North de la Bioimaging Resource Center à l’Université Rockefeller pour assistance et soutien. Nous remercions également Xiphias Ge Zhu d’édition des films. Ce travail a été soutenu par le Human Frontier Science Program organisation (PC).

Expérimentation et protection des animaux ont été réalisés selon les procédures approuvées par la Commission institutionnelle animalerie et utilisation à l’Université Rockefeller.
1. préparation du tissu
<ol><li>Effectuer une perfusion intracardiaque standard avec environ 20 mL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C jusqu'à ce que le sang est complètement retiré du tissu.</li>
	<li>Lancez le perfusat à ~ 20 mL de solution de fixation (4 % paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x) à 4 ° C jusqu'à ce que le cou et la queue ont considérablement durcie. ATTENTION : PFA est toxique. Éviter tout contact avec la peau, des yeux et des muqueuses. Solutions se référera à l’intérieur d’une hotte aspirante.</li>
	<li>Disséquer les coussinets adipeux d’intérêt soigneusement pour retirer le coussin de graisse entière sans l’endommager. Utiliser les pinces émoussé-terminée afin d’éviter le coincement ou l’écrasement le tissu. Éviter de contaminer le tissu découpé avec une fourrure.</li>
	<li>Fixer le tissu en 4 % PFA dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C. Pour chaque grosse garniture, fixer avec environ 10 mL de solution de fixation dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Laver le tissu 3 fois (1 h) avec du PBS 1 x à température ambiante (RT).</li>
	<li>Stocker les tissus pour à court terme (jusqu'à 2 semaines) dans du PBS 1 x à 4 ° C et l’abri de la lumière. Pour le stockage à long terme (p. ex., 1-2 ans), placez-vous dans la mémoire tampon 1 x PBS avec 0,05 % d’azide de sodium (comme agent de conservation). ATTENTION : L’azoture de Sodium est très toxique si ingéré par voie orale ou absorbé par la peau. Concentré d’azide de sodium (à 5 % ou plus) des solutions doivent être manipulées sous une hotte aspirante.</li>
</ol>2. délipidation et perméabilisation
Calendrier: 1-2 jours
<ol><li>Préparer les 20 %, 40 %, 60 % et 80 % méthanol gradient avec tampon B1n (tableau 1) (v/v), par exemple, pour le tampon de 20 % de méthanol/B1n, mélangent 20 mL de méthanol et 80 mL de tampon B1n. Stocker tous les tampons à 4 ° C. Cristaux de glycine précipitera de tampons de méthanol/B1n 60 % et 80 % en raison de la saturation. Éviter de supprimer les cristaux ; utiliser la solution liquide pour les lavages suivants. ATTENTION : Le méthanol est volatile, inflammable et irritant. Éviter le contact cutané ou oculaire.</li>
	<li>Retirez doucement les cheveux de l’échantillon sous un microscope à dissection. Tout cheveux, peluches ou des débris, jointe à l’échantillon entraînera des ombres au cours de l’imagerie. Transférer l’échantillon nettoyé dans un nouveau tube.</li>
	<li>Exécutez toutes les étapes suivantes sur la glace ou à 4 ° C sauf indication contraire. Pour petits échantillons (par exemple, postérieurs coussinets adipeux sous-cutané/perigonadal des jeunes souris maigres), utiliser des tubes de microcentrifuge de 2 mL avec 1,6 mL de la solution. Pour les grands échantillons ou échantillons avec teneur élevée en lipides (par exemple, les coussinets adipeux chez des souris obèses), utiliser des tubes de 5 mL avec 4 mL de la solution.<ol>
<li>Placer les tubes contenant les échantillons horizontalement dans un agitateur orbital à ~ 100 tr/min. Veillez à ce que les échantillons peuvent circuler librement à l’intérieur du tube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déshydrater l’échantillon dans une série graduée de 20 %, 40 %, 60 %, 80 % et 100 % méthanol/B1n tampon pour l’heure indiquée (tableau 2). Minimiser la solution de report.</li>
	<li>Delipidate l’échantillon avec 100 % de dichlorométhane (DCM) (3 fois), chacune avec le temps d’incubation indiqués dans le tableau 2. L’échantillon doit couler au fond du tube à la fin des deuxième et troisième DCM lavages. Si non, prolonger le temps d’incubation pour assurer la délipidation complet (par exemple, s’étendent de 30 min à 1-2 h). ATTENTION : DCM devrait être manipulé à l’intérieur d’une hotte aspirante. Utilisez des récipients de verre pour tubes de microcentrifuge de stockage et de qui sont faits de polypropylène pour des incubations. Les tubes de microcentrifuge ne doivent pas être utilisés pour le stockage à long terme de DCM. Boîtes de Pétri et pipettes sérologiques qui sont faits de polystyrène ne sont pas compatibles avec du DCM. DCM est très volatil. Transférer l’échantillon dans une solution fraîche rapidement pour éviter la dessiccation.</li>
	<li>Laver deux fois avec 100 % de méthanol pour l’heure indiquée (tableau 2).</li>
	<li>Facultatif : Si l’échantillon n’est pas bien irrigué, la couleur de l’hémoglobine des globules rouges restants risquent fort autofluorescence. Eau de Javel 5 % H2O2 dans le méthanol (1 volume de 30 % H2O2 à 5 volumes de méthanol) durant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Réhydrater l’échantillon dans une série de tampons de méthanol/B1n inversé : 80 %, 60 %, 40 %, 20 % méthanol/B1n et 100 % B1n tampon (2 fois) pour l’heure indiquée (tableau 2).</li>
	<li>Laver l’échantillon avec tampon de PTxwH (tableau 1) pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Conserver l’échantillon délipidée dans PTxwH tampon à 4° C (jusqu'à 1 an) ou procéder immédiatement à l’étape de l’immunohistochimie.</li>
</ol>3. toute monture Immunostaining
Calendrier: 8-10 jours
Remarque : Toutes les étapes suivantes devraient être effectué à ta sauf indication contraire, avec agitation et de la protection contre la lumière. Pour petits échantillons, utiliser des tubes de microcentrifuge de 2 mL avec 1,6 mL de solution. Pour les grands échantillons, utiliser des tubes de 5 mL avec 4 mL de solution. Il est recommandé de d’abord valider les anticorps sur des petits morceaux du tissu ou des sections de tissu imprégnées par le méthanol.
<ol><li>Diluer l’anticorps primaire dans le tampon de PTxwH à la concentration recommandée. Centrifuger la solution d’anticorps dilué à ~ 20 000 x g pendant 10 min empêcher la présentation précipités anticorps ou agrégations.</li>
	<li>Incuber l’échantillon délipidée avec la solution d’anticorps primaire pour l’heure indiquée (tableau 2).</li>
	<li>Laver l’échantillon avec le tampon de PTxwH dans une série d’étapes d’incubation : 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h et Pendant la nuit.</li>
	<li>Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de PTxwH à la concentration recommandée. Centrifuger la solution d’anticorps dilué à ~ 20 000 x g pendant 10 min empêcher la présentation précipités anticorps ou agrégations. Remarque : Pour éviter de fond élevé causé par autofluorescence tissu, Anticorps secondaires conjugués avec des fluorophores qui émettent de la lumière dans les régions rouges et rouge sombre sont recommandés. Selon le nombre de lignes laser disponibles sur un microscope, jusqu'à 3-4 marqueurs peut être photographiée simultanément sur un seul échantillon.</li>
	<li>Incuber l’échantillon avec la solution d’anticorps secondaire pour l’heure indiquée (tableau 2).</li>
	<li>Échantillon de lavage avec PTxwH tampon non contrôlé dans une série d’étapes d’incubation : 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h et Pendant la nuit.</li>
	<li>Facultatif : Pour les types de tissus qui sont fragiles, fixez le tissu taché avec 4 % PFA en solution 1 PBS x nuit à 4 ° C pour aider à préserver la morphologie tissulaire. Remarque : Cette étape peut augmenter fond d’imagerie. Il n’est pas nécessaire d’effectuer cette étape pour le tissu adipeux.</li>
	<li>Laver l’échantillon avec du PBS 1 x dans une série d’étapes d’incubation : 5 min, 10 min et 30 min.</li>
	<li>Retirez délicatement les peluches de l’échantillon sous un microscope à dissection.</li>
</ol>4. tissu Clearing
Calendrier: 1-2 jours
<ol><li>Facultatif : Intégrer l’échantillon dans l’agarose pour faciliter le montage des échantillons pour la microscopie de lumière-feuille. Remarque : Cette étape est fortement recommandée pour les tissus adipeux afin de stabiliser sa forme en imagerie.<ol>
<li>Préparer la solution encastrement avec 1 % d’agarose dans 1 x PBS (p/v). Refroidir la solution encastrement à ~ 40 ° C pour éviter d’exposer l’échantillon à une chaleur excessive.</li>
		<li>Placer l’échantillon nettoyé dans un moule(par exemple, boîte de Pétri ou pesage bateau) et l’arranger dans la position souhaitée. Éviter tout report de liquide. Verser doucement la solution encastrement sur l’échantillon. Éviter les bulles d’air.</li>
		<li>Laissez l’agarose entièrement solidifier à RT. Cut out un bloc contenant l’échantillon. Remarque : Toutes les étapes suivantes, y compris des incubations durant la nuit devraient être exécuté à RT, et à secouer et protection contre la lumière. Pour petits échantillons, utiliser des tubes de microcentrifuge de 2 mL avec 1,6 mL de solution. Pour les grands échantillons, utiliser des tubes de 5 mL avec 4 mL de solution.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déshydrater l’échantillon en gradient de méthanol avec H2o : 25 %, 50 %, 75 % et 100 % (3 fois) pour l’heure indiquée (tableau 2). Remarque : Échantillon peut être laissé toute la nuit à l’étape de 100 % de méthanol.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans DCM de 100 % pendant 1 h avec agitation (3 fois). Échantillon doit couler au fond du tube à la fin de chaque lavage de DCM. Si ce n’est pas le cas, prolonger le temps d’incubation pour assurer l’élimination complète du méthanol. Échantillon peut être laissé toute la nuit à l’étape de DCM 100 %.</li>
	<li>Incuber pendant la nuit l’échantillon dans l’éther de dibenzyle (DBE) sous agitation légère pour atteindre correspondant à l’indice de réfraction. Remarque : Échantillon finira par devenir transparent de lumière visible. ATTENTION : DBE est dangereux. Eviter tout contact avec la peau. Le manipuler à l’intérieur d’une hotte avec des gants double couche. Jeter les gants dès qu’il est contaminé par DBE. Utilisez des récipients de verre pour le stockage et microcentrifugeuse tubes (polypropylène) pour des incubations. Les tubes de microcentrifuge ne doivent pas être utilisés pour le stockage à long terme de la deb. Boîtes de Pétri et pipettes sérologiques qui sont faits de polystyrène ne sont pas compatibles avec deb. Nettoyer tout déversement avec 100 % d’éthanol.</li>
	<li>Incuber l’échantillon avec DBE fraîche légère secousse pendant 2 h. magasin l’échantillon à la droite dans l’obscurité ou passer directement à l’imagerie. Remarque : Les échantillons sont recommandés pour être photographié dans un mois. Bien que certains fluorophores sont plus stables que d’autres, un stockage à long terme des échantillons à ce stade n’est pas recommandé.</li>
</ol>5. microscopie
<ol><li>Création d’images avec un microscope de lumière-feuille qui est compatible avec deb. Remarque : Seuls les objectifs qui sont approuvés pour l’imagerie à base de solvants organique et mis en correspondance avec l’indice de réfraction de la deb utilisable comme trempage objectifs en imagerie DBE immergés.<ol>
<li>Monter l’échantillon d’agarose incorporés sur un support qui peut empêcher tout mouvement pendant la formation image. Plongez l’échantillon dans une chambre remplie de DBE.</li>
		<li>Recueillir une z-pile couvrant l’ensemble de l’échantillon (par exemple, un grossissement de X 1-2) pour obtenir l’ensemble des tissus/structure de distribution du marqueur d’intérêt.</li>
		<li>Basculer vers un objectif avec un grossissement supérieur (p. ex., un grossissement de X 4-12) pour zoomer sur les régions d’intérêt à l’image des structures détaillées. Remarque : Le collagène est un contributeur majeur à la matrice extracellulaire du tissu adipeux, qui entoure les cellules graisseuses13. Collagène a un spectre d’émission typique allant vers 400 nm et 550 nm14. Imagerie de l’échantillon avec la ligne 488 laser (verte) et la collecte de la lumière émise à une plage de longueur d’onde qui se situe dans le spectre d’émission du collagène (p. ex., 525-550 nm) donnera le signal d’autofluorescence tissu, qui a déjà été démontré à délimiter le contour adipocyte et globale d’architecture tissulaire12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>L’imagerie avec une inversée confocale ou un microscope biphotonique.<ol>
<li>Place l’échantillon d’agarose incorporé dans une diapositive de chambre avec un fond de verre sans toucher les pièces en plastique (ou autre chambre d’imagerie DBE-compatible qui peut sceller). Assurez-vous que DBE ne fuit pas.</li>
		<li>Choisissez des objectifs avec des distances de travail plus longues pour atteindre une pénétration plus profonde. Remarque : Imagerie devrait être fait avec un microscope confocal ou deux photons inversé à travers le fond de verre de la diapositive de la chambre. Évitez tout contact direct entre l’échantillon et le trempage des objectifs qui ne sont pas suggérés pour imagerie DBE.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Adipo-Clear est une méthode simple et robuste pour dégager le tissu adipeux, qui peut être facilement effectué dans une configuration de laboratoire réguliers. En comparaison avec d’autres méthodes de nettoyage à base de solvants tels qu’iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear est particulièrement optimisé pour dégager le tissu adipeux et autres tissus à haute teneur en matières grasses. L’étape de délipidation supprime complètem...

Jusqu'à tout récemment, le tissu adipeux a été conçu comme une collection amorphe de cellules graisseuses. Dans les dernières décennies, notre compréhension s’est développée plus sophistiquée, avec de la graisse, maintenant reconnue comme un organe complexe contenant différents types d’adipocytes, ainsi que les précurseurs adipocytaires, cellules immunitaires, les fibroblastes, la vascularisation et projections nerveuses. Interactions entre ces cellules résidentes adipeux ont des effets marqués sur le tissu adipeux et organismique physiologie et physiopathologie1. Bien que les nouvelles études ont démêlé importants mécanismes moléculaires de certaines interactions, une compréhension plus globale requiert un profilage structurelle fiable du tissu tout en trois dimensions (3D).
Nos connaissances actuelles de la morphologie du tissu adipeux est largement basée sur l’analyse histologique des sections minces (5 μm) avec l’imagerie relativement fort grossissement (plus de 10 X)2,3. Toutefois, cette approche présente plusieurs limites importantes. Tout d’abord, complexes de structures filamenteuses comme les nerfs sympathiques et le système vasculaire, qui sont connus pour jouer un rôle important dans le tissu adipeux fonction4,5,6,7, sont difficiles à évaluer par le biais de coupes minces. Deuxièmement, en raison de sa forme apparemment amorphe et le manque d’unités structurales représentatifs de se concentrer sur, il est difficile d’apprécier le tissu adipeux structures basées uniquement sur la section coloration. En troisième lieu, le tissu adipeux a une teneur très élevée en lipides, en créant des défis dans l’obtention des coupes sériées cohérentes qui se prêtent à une reconstruction anatomique 3D, une méthode conventionnelle utilisée pour étudier le cerveau entier morphologie8. Compte tenu de ces facteurs, il y a un grand besoin d’une approche toute monture qui peut fournir une visualisation 3D d’un dépôt de tissu adipeux ensemble tout en permettant la résolution cellulaire.
L’imagerie volumétrique 3D d’un organe entier est difficile en raison des effets masquant des nuages de points lumineux. Une source majeure de facteur de diffusion dans les tissus biologiques provient d’interfaces lipide aqueux. Bien que les efforts pour éliminer les nuages de points en supprimant les lipides ont été en cours pendant plus d’un siècle, on a un grand nombre de ces dernières innovations9. Une de ces méthodes nettoyage des tissus nouvellement développée est imagerie 3D compatible immunomarquage des organes cote de solvant (iDISCO / iDISCO +)10,11. Cependant, le tissu adipeux représente un défi particulier compte tenu de son niveau élevé de lipides et par conséquent, des modifications supplémentaires à l’iDISCO / iDISCO + protocole sont requis pour extraire complètement les lipides tout en protégeant le tissu de s’effondrer. Le protocole modifié, que nous avons mis au point, maintenant appelé Adipo-Clear, emploie méthanol/à base de dichlorométhane délipidation du tissu adipeux à une transparence optimale convenant à haute résolution d’imagerie volumétrique12. Parce que la délipidation étape désaltère exprimés en grande partie les protéines fluorescentes comme GFP et DP, visualisation de ces protéines doit être atteint par immunomarquage. Dans l’ensemble, ce protocole simple et robuste peut être appliqué pour étudier l’organisation tissulaire au niveau des cellules résidentes adipeux, traçage de la lignée de cellules progénitrices adipocytaire et morphogenèse adipeuse au cours du développement.

<table><tbody><tr><td>1x solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270991</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène 30 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>325-100</td><td></td></tr><tr><td>Éther benzylique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Lapin polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Chèvre polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td>Concentration finale de 2 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>Concentration finale de 2 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Âne anti-lapin IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>Concentration finale de 5-10 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-chèvre IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>Concentration finale de 5-10 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Âne anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>Concentration finale de 5-10 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Chambre d’imagerie</td><td>ibidi</td><td>80287</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à feuillet de lumière</td><td>LaVision BioTec</td><td>Ultramicroscope II</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie Logiciel</td><td></td><td>LaVision BioTec</td><td>Imspector</td></tr><tr><td>Logiciel de visualisation de microscopie</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td></td></tr></tbody></table>

adipo-clear : un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Le tissu adipeux joue un rôle central dans l’homéostasie énergétique et la thermorégulation. Il est composé de différents types d’adipocytes, comme précurseurs adipocytaires, cellules immunitaires, fibroblastes, les vaisseaux sanguins et les projections nerveuses. Bien que le contrôle moléculaire de précision du type de cellule et de l’interaction de ces cellules ont été délimitées de plus en plus, une compréhension plus approfondie de ces cellules résidentes adipeux est possible en visualisant leur distribution et leur architecture tout au long du tissu entier. Approches existantes d’immunohistochimie et immunofluorescence pour analyser l’histologie adipeuse s’appuient sur des coupes minces de paraffine. Toutefois, des coupes minces ne capturent qu’une petite partie du tissu ; en conséquence, les conclusions peuvent être biaisées par quelle partie du tissu est analysée. Nous avons donc développé un technique de compensation Adipo-Clear, afin de permettre une visualisation en trois dimensions complète des modèles moléculaires et cellulaires dans les tissus adipeux tout le tissu adipeux. Adipo-Clear est une adaptation d’iDISCO / iDISCO +, avec des modifications spécifiques apportées à supprimer complètement les lipides stockés dans les tissus tout en préservant la morphologie tissulaire native. En combinaison avec la microscopie en fluorescence lumière-feuille, nous démontrons ici l’utilisation de la méthode Adipo-Clear pour obtenir des images haute résolution volumétriques d’un tissu adipeux ensemble.

Adipo-Clear préparé toute graisse tampons peuvent être photographiées en 3D pour analyser comment les interactions de tissu cellulaire et de morphologie sont affectées dans les États de maigres et obèses. Cette méthode peut être facilement appliquée pour analyser la structure adipeuse générale en recueillant le tissu autofluorescence signal dans le canal vert. Nous avons montré précédemment que l’autofluorescence signal en superpositions adipeuses favorablement avec perilipin coloration, ...

En raison de la teneur élevée en lipides, le tissu adipeux a été difficile à visualiser à l’aide des méthodes histologiques traditionnelles. Adipo-Clear est un tissu technique qui permet l’étiquetage robuste et une imagerie de fluorescence volumétrique du tissu adipeux de compensation. Nous décrivons ici les méthodes de préparation des échantillons, prétraitement, la coloration, la compensation et montage pour l’imagerie.

Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du tissu adipeux, telles que la façon dont les différents composants du tissu adipeux interagissent dans un tissu entier. Le principal avantage de cette technique est qu’elle élimine complètement l’excès de lipides stockés dans le tissu adipeux tout en conservant son architecture tridimensionnelle. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’organisation tridimensionnelle du tissu adipeux, elle peut également être généralement appliquée à d’autres tissus à haute teneur en lipides, tels que la mémoire et les ganglions lymphatiques.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de délipidation et de nettoyage nécessitent des temps d’incubation suffisants, qui peuvent être difficiles à déterminer. Commencez par utiliser des pinces à bout émoussé pour disséquer le coussinet adipeux d’intérêt à partir d’un modèle animal fraîchement perfusé. Retirez soigneusement tout le tampon de mode sans pincer ou presser le tissu ou contaminer le tissu disséqué avec de la fourrure.Placez le coussinet adipeux dans environ 10 millilitres de solution de fixation dans un tube conique de 15 millilitres et post-fixez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, après avoir lavé l’échantillon avec du PBS, retirez délicatement tous les débris de l’échantillon à l’aide d’un microscope de dissection. Les cheveux, les peluches ou d’autres débris attachés à l’échantillon provoqueront des ombres pendant l’imagerie.Transférez l’échantillon propre dans un tube en polypropylène contenant de la glace et un tampon de méthanol B1N à 20 %. Placez le tube contenant l’échantillon horizontalement sur un agitateur orbital, réglez-le sur 100 tr/min et agitez pendant 30 minutes à 1 heure selon la taille de l’échantillon. Assurez-vous que les échantillons peuvent se déplacer librement à l’intérieur du tube.Poursuivez la déshydratation des échantillons à travers une série graduée de 40 %, 60 % et 80 % de méthanol dans un tampon B1N suivi de 100 % de méthanol. Minimisez la solution de transfert. Après la déshydratation, remplacez la solution de méthanol à 100 % par du dichlorométhane à 100 % ou du DCM pour délipider l’échantillon.Répétez le lavage deux fois en suivant les temps d’incubation indiqués dans le tableau 2. L’échantillon doit couler au fond du tube à la fin des deuxième et troisième lavages DCM. Si ce n’est pas le cas, prolongez le temps d’incubation pour assurer une délipidation complète.Après la délipidation, laver deux fois avec du méthanol à 100 % pendant le temps indiqué dans le tableau 2. Réhydrater l’échantillon dans une série de tampons de méthanol B1N inversé pendant les temps indiqués dans le tableau 2. Après la réhydratation, laver l’échantillon avec un tampon PTXWH pendant 2 heures à température ambiante.L’échantillon est maintenant prêt pour l’immunocoloration ou peut être stocké dans un tampon PTXWH à 4 degrés Celsius jusqu’à 1 an. Tout d’abord, diluez l’anticorps primaire dans le tampon PTXWH à la concentration recommandée. Ensuite, centrifugez la solution d’anticorps diluée à 20 000 G pendant 10 minutes pour éviter d’introduire des précipités ou des agrégations d’anticorps.Il est important de choisir des anticorps primaires appropriés qui sont compatibles avec le méthanol et le traitement DCM. Les nouveaux anticorps doivent être validés avec de petits morceaux de tissu ou avec des coupes de tissus traités au méthanol. Incuber l’échantillon délipidé avec la solution d’anticorps primaires pendant 3 à 5 jours selon la taille de l’échantillon.Après l’incubation primaire, laver l’échantillon avec plusieurs changements de tampon PTXWH. Le lendemain, diluez l’anticorps secondaire dans le tampon PTXWH à la concentration recommandée. Centrifugez la solution d’anticorps diluée comme précédemment.Incuber l’échantillon avec la solution d’anticorps secondaire pendant 3 à 5 jours selon la taille de l’échantillon. Encore une fois, lavez l’échantillon avec un tampon PTXWH en une série d’étapes d’incubation comme précédemment. Le lendemain, lavez l’échantillon avec 1XPBS pendant 5 minutes, 10 minutes, puis 30 minutes.Intégrez du tissu adipeux dans l’agarose pour faciliter le montage de l’échantillon pour la microscopie à feuille légère. Tout d’abord, préparez la solution d’enrobage avec 1 % d’agarose dans 1XPBS. Refroidissez la solution d’enrobage à environ 40 degrés Celsius pour éviter d’exposer l’échantillon à une chaleur excessive.Tout en évitant l’emport de liquide, placez l’échantillon de tissu nettoyé dans un moule et disposez-le dans la position souhaitée. Versez ensuite doucement la solution d’enrobage sur l’échantillon tout en évitant les bulles d’air. Toutes les bulles d’air doivent être déplacées vers la périphérie avant que l’agarose ne se solidifie.Une fois que l’agarose s’est complètement solidifiée, découpez un bloc contenant l’échantillon. Transférez l’échantillon dans de l’eau à 25 % de méthanol, à l’abri de la lumière et incubez en agitant pendant la durée indiquée dans le tableau 2. Continuez à déshydrater l’échantillon à travers un gradient de méthanol.Incuber l’échantillon dans 100 % DCM pendant 1 heure en agitant. Les échantillons lavés DCM sèchent facilement à l’air, ce qui affecte la clarté de l’échantillon et entraîne des images floues. Il est important de transférer rapidement les échantillons dans une solution fraîche pour éviter la dessiccation.L’échantillon doit couler au fond du tube à la fin de chaque lavage DCM. Incuber l’échantillon dans de l’éther dibenzylique ou du DBE pendant la nuit en agitant légèrement pour obtenir une correspondance de l’indice de réfraction. L’échantillon finira par devenir une lumière transparente et invisible.Le lendemain, après avoir incubé l’échantillon avec du DBE frais en agitant légèrement pendant 2 heures, conservez l’échantillon à température ambiante dans l’obscurité ou passez directement à l’imagerie. Pour imager l’échantillon à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière compatible avec DBE, montez l’échantillon enrobé d’agarose sur un support qui peut empêcher tout mouvement pendant l’imagerie. Pour imager l’échantillon à l’aide d’un microscope confocal inversé ou d’un microscope à deux photons, placez l’échantillon inclus dans l’agarose dans une lame de chambre avec un fond en verre.Le balayage d’un coussinet adipeux sous-cutané postérieur à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière à faible grossissement montre l’organisation lobulaire des adipocytes. Des informations plus détaillées telles que la taille des adipocytes peuvent être révélées en zoomant sur les régions d’intérêt avec un grossissement plus élevé. Un coussinet adipeux sous-cutané postérieur coloré à la tyrosine hydroxylase, un marqueur du système nerveux sympathique, a été imagé par microscopie à fluorescence à feuillet de lumière.La coloration TH a révélé des structures qui apparaissent comme de gros faisceaux nerveux, comme l’indique la flèche ici. L’innervation des vaisseaux sanguins ainsi que l’arborisation terminale dense dans le parenchyme tissulaire sont également révélées par la coloration TH. En utilisant la molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires ou PCAM1, également connue sous le nom de CD31, comme marqueur pour marquer les vaisseaux sanguins, on observe que tous les adipocytes sont en contact avec les capillaires dans l’ensemble du tissu, ce qui soutient la forte demande d’échange efficace de nutriments et d’oxygène dans le tissu adipeux.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie adipeuse pour explorer des questions supplémentaires telles que la morphogenèse tissulaire précoce et la cartographie du devenir des progéniteurs adipocytaires. Il peut également être appliqué à l’étude de l’histologie du tissu adipeux humain. N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde, du méthanol, du dichlorométhane et de l’éther dibenzylique peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’une hotte et d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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