Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du tissu adipeux, telles que la façon dont les différents composants du tissu adipeux interagissent dans un tissu entier. Le principal avantage de cette technique est qu’elle élimine complètement l’excès de lipides stockés dans le tissu adipeux tout en conservant son architecture tridimensionnelle. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’organisation tridimensionnelle du tissu adipeux, elle peut également être généralement appliquée à d’autres tissus à haute teneur en lipides, tels que la mémoire et les ganglions lymphatiques.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de délipidation et de nettoyage nécessitent des temps d’incubation suffisants, qui peuvent être difficiles à déterminer. Commencez par utiliser des pinces à bout émoussé pour disséquer le coussinet adipeux d’intérêt à partir d’un modèle animal fraîchement perfusé. Retirez soigneusement tout le tampon de mode sans pincer ou presser le tissu ou contaminer le tissu disséqué avec de la fourrure.

Placez le coussinet adipeux dans environ 10 millilitres de solution de fixation dans un tube conique de 15 millilitres et post-fixez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, après avoir lavé l’échantillon avec du PBS, retirez délicatement tous les débris de l’échantillon à l’aide d’un microscope de dissection. Les cheveux, les peluches ou d’autres débris attachés à l’échantillon provoqueront des ombres pendant l’imagerie.

Transférez l’échantillon propre dans un tube en polypropylène contenant de la glace et un tampon de méthanol B1N à 20 %. Placez le tube contenant l’échantillon horizontalement sur un agitateur orbital, réglez-le sur 100 tr/min et agitez pendant 30 minutes à 1 heure selon la taille de l’échantillon. Assurez-vous que les échantillons peuvent se déplacer librement à l’intérieur du tube.

Poursuivez la déshydratation des échantillons à travers une série graduée de 40 %, 60 % et 80 % de méthanol dans un tampon B1N suivi de 100 % de méthanol. Minimisez la solution de transfert. Après la déshydratation, remplacez la solution de méthanol à 100 % par du dichlorométhane à 100 % ou du DCM pour délipider l’échantillon.

Répétez le lavage deux fois en suivant les temps d’incubation indiqués dans le tableau 2. L’échantillon doit couler au fond du tube à la fin des deuxième et troisième lavages DCM. Si ce n’est pas le cas, prolongez le temps d’incubation pour assurer une délipidation complète.

Après la délipidation, laver deux fois avec du méthanol à 100 % pendant le temps indiqué dans le tableau 2. Réhydrater l’échantillon dans une série de tampons de méthanol B1N inversé pendant les temps indiqués dans le tableau 2. Après la réhydratation, laver l’échantillon avec un tampon PTXWH pendant 2 heures à température ambiante.

L’échantillon est maintenant prêt pour l’immunocoloration ou peut être stocké dans un tampon PTXWH à 4 degrés Celsius jusqu’à 1 an. Tout d’abord, diluez l’anticorps primaire dans le tampon PTXWH à la concentration recommandée. Ensuite, centrifugez la solution d’anticorps diluée à 20 000 G pendant 10 minutes pour éviter d’introduire des précipités ou des agrégations d’anticorps.

Il est important de choisir des anticorps primaires appropriés qui sont compatibles avec le méthanol et le traitement DCM. Les nouveaux anticorps doivent être validés avec de petits morceaux de tissu ou avec des coupes de tissus traités au méthanol. Incuber l’échantillon délipidé avec la solution d’anticorps primaires pendant 3 à 5 jours selon la taille de l’échantillon.

Après l’incubation primaire, laver l’échantillon avec plusieurs changements de tampon PTXWH. Le lendemain, diluez l’anticorps secondaire dans le tampon PTXWH à la concentration recommandée. Centrifugez la solution d’anticorps diluée comme précédemment.

Incuber l’échantillon avec la solution d’anticorps secondaire pendant 3 à 5 jours selon la taille de l’échantillon. Encore une fois, lavez l’échantillon avec un tampon PTXWH en une série d’étapes d’incubation comme précédemment. Le lendemain, lavez l’échantillon avec 1XPBS pendant 5 minutes, 10 minutes, puis 30 minutes.

Intégrez du tissu adipeux dans l’agarose pour faciliter le montage de l’échantillon pour la microscopie à feuille légère. Tout d’abord, préparez la solution d’enrobage avec 1 % d’agarose dans 1XPBS. Refroidissez la solution d’enrobage à environ 40 degrés Celsius pour éviter d’exposer l’échantillon à une chaleur excessive.

Tout en évitant l’emport de liquide, placez l’échantillon de tissu nettoyé dans un moule et disposez-le dans la position souhaitée. Versez ensuite doucement la solution d’enrobage sur l’échantillon tout en évitant les bulles d’air. Toutes les bulles d’air doivent être déplacées vers la périphérie avant que l’agarose ne se solidifie.

Une fois que l’agarose s’est complètement solidifiée, découpez un bloc contenant l’échantillon. Transférez l’échantillon dans de l’eau à 25 % de méthanol, à l’abri de la lumière et incubez en agitant pendant la durée indiquée dans le tableau 2. Continuez à déshydrater l’échantillon à travers un gradient de méthanol.

Incuber l’échantillon dans 100 % DCM pendant 1 heure en agitant. Les échantillons lavés DCM sèchent facilement à l’air, ce qui affecte la clarté de l’échantillon et entraîne des images floues. Il est important de transférer rapidement les échantillons dans une solution fraîche pour éviter la dessiccation.

L’échantillon doit couler au fond du tube à la fin de chaque lavage DCM. Incuber l’échantillon dans de l’éther dibenzylique ou du DBE pendant la nuit en agitant légèrement pour obtenir une correspondance de l’indice de réfraction. L’échantillon finira par devenir une lumière transparente et invisible.

Le lendemain, après avoir incubé l’échantillon avec du DBE frais en agitant légèrement pendant 2 heures, conservez l’échantillon à température ambiante dans l’obscurité ou passez directement à l’imagerie. Pour imager l’échantillon à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière compatible avec DBE, montez l’échantillon enrobé d’agarose sur un support qui peut empêcher tout mouvement pendant l’imagerie. Pour imager l’échantillon à l’aide d’un microscope confocal inversé ou d’un microscope à deux photons, placez l’échantillon inclus dans l’agarose dans une lame de chambre avec un fond en verre.

Le balayage d’un coussinet adipeux sous-cutané postérieur à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière à faible grossissement montre l’organisation lobulaire des adipocytes. Des informations plus détaillées telles que la taille des adipocytes peuvent être révélées en zoomant sur les régions d’intérêt avec un grossissement plus élevé. Un coussinet adipeux sous-cutané postérieur coloré à la tyrosine hydroxylase, un marqueur du système nerveux sympathique, a été imagé par microscopie à fluorescence à feuillet de lumière.

La coloration TH a révélé des structures qui apparaissent comme de gros faisceaux nerveux, comme l’indique la flèche ici. L’innervation des vaisseaux sanguins ainsi que l’arborisation terminale dense dans le parenchyme tissulaire sont également révélées par la coloration TH. En utilisant la molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires ou PCAM1, également connue sous le nom de CD31, comme marqueur pour marquer les vaisseaux sanguins, on observe que tous les adipocytes sont en contact avec les capillaires dans l’ensemble du tissu, ce qui soutient la forte demande d’échange efficace de nutriments et d’oxygène dans le tissu adipeux.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie adipeuse pour explorer des questions supplémentaires telles que la morphogenèse tissulaire précoce et la cartographie du devenir des progéniteurs adipocytaires. Il peut également être appliqué à l’étude de l’histologie du tissu adipeux humain. N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde, du méthanol, du dichlorométhane et de l’éther dibenzylique peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’une hotte et d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.