La détection immunohistochimique de la 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine dans l’élaboration et de la rétine de souris ici

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la méthylation de l’ADN, telles que les changements de la chromatine au cours du développement rétinien dans la rétine postmitotique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée de manière robuste sur n’importe quelle section de tous les tissus de la rétine de souris portant la distribution de la 5-méthylcytosine, de la 5-hydroxyméthylcytosine qui sont traités selon une approche similaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de préparation et de coloration des tissus sont difficiles à apprendre, car si des préparations histologiques congelées sont utilisées, des tissus organisationnels et originaux précieux peuvent être perdus.

Pablo Diaz, associé de recherche de notre laboratoire, fera la démonstration du reste de la procédure. Pour commencer cette procédure, utilisez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 29 pour percer les yeux d’une souris euthanasiée décapitée sur la face dorsale des yeux. Pour obtenir des œilletons, énucléez immédiatement les yeux en coupant autour de la sclérotique avec de fins ciseaux ophtalmiques pour retirer la cornée et le cristallin.

Fixez les œilletons et l’E16 yeux entiers dans du paraformaldéhyde à 4 % ou du PFA dans du 1xPBS pH 8,0 pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez-les deux fois dans un millilitre de 1xPBS à température ambiante pendant 10 minutes. Pour cryoprotéger les œilletons et les yeux entiers, incubez-les dans 1xPBS pH 8,0 avec 10 % de saccharose à température ambiante pendant une heure.

Puis dans 20 % de saccharose dans 1xPBS pendant une heure. Et enfin à 30 % de saccharose dans 1 x PBS à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, intégrez les œilletons et les yeux dans un composé à température de coupe optimale, ou OCT, dans des cryomoules.

Ensuite, congelez-les dans un bain d’éthanol à la glace sèche et conservez-les à 80 degrés Celsius. Avant de commencer la cryosection, retirez les moules avec les œilletons incrustés et les yeux à 80 degrés Celsius. Placez-les dans un support de cryostat et laissez-les s’équilibrer à 20 degrés Celsius pendant une heure.

À l’aide d’un cryostat à 20 degrés Celsius, coupez des sections efficaces rétiniennes de 12 micromètres d’épaisseur parallèlement à l’axe temporonasal à travers la tête du nerf optique. Montez les sections sur des lames de microscope et rangez-les à 80 degrés Celsius. Pour commencer l’immunomarquage, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour encercler les sections rétiniennes montées sur les lames.

Lavez les sections une fois avec 200 microlitres de 1xPBS pendant 10 minutes. Perméabiliser les sections avec 200 microlitres de PBST pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, dénaturez-les avec 200 microlitres d’acide chlorhydrique 2 normaux fraîchement préparés, soigneusement titrés, dans 1xPBS pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius pour optimiser le signal 5mC.

Après dénaturation, ajoutez 100 microlitres de 0,1 Tris-HCl pH 8,3 sur les sections rétiniennes, et incubez pendant 10 minutes à température ambiante pour les neutraliser. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution de blocage. Et incubez les sections dans une chambre d’humidité à température ambiante pendant une heure.

Ajoutez les anticorps appropriés, dilués de un à 500 dans une solution de blocage, dans les sections et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les sections trois fois pendant 10 à 15 minutes chacune avec 0,1 % de PBST. Ajouter des anticorps secondaires appropriés dilués de un à 1000 dans une solution bloquante contenant une solution de DAPI à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, lavez les lames trois fois avec un millilitre de 0,1 % de PBST pendant 10 minutes chacune. Après le dernier lavage, ajoutez un support de montage aqueux. Couvrir avec une lamelle.

Et puis procédez à la microscopie confocale. Après l’immunomarquage rétinien à E16, le signal 5mC était fort dans les chromocentres des noyaux cellulaires et présent à un niveau beaucoup plus bas dans l’ensemble des noyaux cellulaires. La coloration au 5hmC a été trouvée exclusivement dans les noyaux cellulaires et absente des chromocentres.

Dans la rétine P0, les signaux 5mC et 5hmC étaient présents dans la couche externe des neuroblastes et la couche interne des neuroblastes. Le signal 5mC était fort dans les chromocentres et la périphérie nucléaire des noyaux cellulaires, et plus faible entre les chromocentres des noyaux cellulaires. La coloration 5hmC était limitée au noyau cellulaire.

Dans la rétine P15, dans la couche nucléaire externe, le signal 5mC a été détecté dans les chromocentres des noyaux cellulaires et la périphérie nucléaire. Alors que le signal 5hmC était dans tous les noyaux cellulaires, à l’exception des chromocentres. Dans la couche interne des cellules nucléaires et ganglionnaires, le signal 5mC était fort dans les chromocentres des noyaux cellulaires et faible dans les noyaux cellulaires entiers.

Alors que le signal 5hmC a été trouvé dans l’ensemble des noyaux cellulaires, à l’exception des chromocentres. Dans les photorécepteurs à bâtonnets adultes, le signal 5mC était limité au chromocentre et à la périphérie nucléaire, tandis que le signal 5hmC était limité à la périphérie nucléaire. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de traiter les coupes histologiques avec l’exposition optimale de HCl, qui est de 30 minutes.

Si l’exposition est plus ou moins grande, les résultats optimaux ne peuvent pas être reproductibles. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme la chromatographie liquide à haute pression, la spectrométrie de masse, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la quantification des changements dans la mesure de la 5-méthylcytosine et de la 5-hydroxyméthylcytosine. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du développement neuronal pour explorer les changements épigénétiques de la chromatine.

N’oubliez pas que travailler avec du HCl et du PFA peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles qu’une élimination appropriée, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.