Name: Modification des vecteurs d’Expression Baculovirus pour produire sécrétée des protéines végétales dans des cellules d’insecte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Découvrez comment modifier des vecteurs d'expression baculovirus pour produire des protéines végétales sécrétées dans des cellules d'insecte. Cette méthode permet d'obtenir des rendements élevés à faible coût pour la cristallographie.

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Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage nouvelle faculté de North Carolina State University pour Guozhou Xu.

NOTE : Un système de cellule/baculovirus insectes avec des vecteurs d’expression modifiées pour l’expression de la protéine sécrétoire plante et cristallisation est utilisé.
1. modification d’un vecteur d’Expression Baculovirus avec le Peptide Signal GP67 pour Expression de sécrétion des protéines végétales
<ol><li>Synthétiser un fragment d’ADN contenant un 5' BglII coupe site13, la séquence de signaux de sécrétion GP67 et un site multi clonage avec NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI et XhoI (Figure 1 a). NOTE : Puisque les BglII et BamHI digéré ADN a permis aux mêmes fins adhésifs, le vecteur linéarisé peut ligaturer pour le fragment d’ADN digéré, tandis que les sites BamHI tant BglII dans la séquence de ligature recuite vont être mutés à une séquence qui n’est pas CLIVABLES par BglII ou BamHI14.</li>
	<li>Digest 4 µg d’ADN avec BglII et XhoI et 4 µg d’un vecteur d’expression ADN avec BamHI et XhoI14. Mélanger 10 unités de chaque enzyme de restriction avec l’ADN dans un 1 x tampon de réaction de concentration (acétate de potassium 50 mM, 20 mM Tris-acétate, acétate de magnésium de 10 mM et 100 µg/mL de BSA, pH 7,9 à 25 ° C) et laisser incuber le mélange à 37 ° C pendant 4 h.<ol>
<li>Purifier le fragment d’ADN excisé et le vecteur linéarisé ADN par un ADN gel extraction kit15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mélanger 100 ng du vecteur ADN linéarisé avec 400 ng d’ADN digéré fragment dans un mélange de réaction de ligature de 10 µL contenant 1 x tampon de réaction T4 DNA ligase (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2, ATP 1 mM et 10 mM DTT, pH de 7,5 à 25 ° C) et de 5 unités d’ADN T4 ligase. Incuber le mélange réactionnel à 16 ° C pendant 16 h.</li>
	<li>Transformer 5 µL du mélange ligature dans 100 µL de cellules capables de DH5α suite à un protocole de transformation standard, puis sélectionnez les colonies qui en résulte sur une plaque de gélose LB ampicillin16. Prendre 5-10 colonies et grandir chaque colonie dans 2 mL de milieu LB contenant 100 ampicilline µg/mL à 220 tr/mn et 37 ° C dans un incubateur à agitation pendant 16 h.</li>
	<li>Extraire chaque ADN plasmidique avec un DNA miniprep kit17 et confirmer les clones par séquençage de l’ADN d’une amorce de AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>PCR-amplifier le gène TDR a. thaliana fragment encodage résidus 30-642 d’un gène synthétique de TDR construire (avant apprêt : CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, apprêt inverse : GC GGATCC LTC GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Amplifier l’ADN pour 30 cycles dans un tampon de réaction de polymérase d’ADN contenant un mélange dNTP de 0,5 mM, 0,2 µM élémentaires, 0,1 µg d’ADN, 0,4 mM MgCl2et 1 unité de réaction de l’ADN polymérase.<ol>
<li>Pour les étapes du cycle de PCR, définir la dénaturation initiale à 95 ° C pendant 30 s et puis 30 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 30 s, recuit à 55 ° C pendant 30 s et l’extension à 72 ° C pendant 1 min, avec une extension finale à 72 ° C pendant 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digérer le fragment PCR tant le vecteur mis à jour l’avec NotI et BamHI enzymes endonucléases de restriction. Ligaturer le fragment de gène avec le vecteur linéarisé. Mélanger 100 ng du vecteur ADN linéarisé avec 400 ng d’ADN digéré fragment dans un mélange de réaction de ligature de 10 µL contenant du tampon de réaction T4 DNA ligase et 5 unités de T4 DNA ligase. Incuber le mélange réactionnel à 16 ° C pendant 16 h.</li>
	<li>Transformer 5 µL du mélange ligature dans 100 µL de cellules capables de DH5α suite à un protocole de transformation standard, puis sélectionnez les colonies qui en résulte sur une plaque de gélose LB ampicillin16. Confirmer les clones correctes par séquençage de l’ADN.</li>
</ol>2. modification d’un vecteur d’Expression Baculovirus avec le Peptide Signal Hemolin insectes pour Expression de sécrétion des protéines végétales
<ol><li>Synthétiser un fragment d’ADN contenant un 5' BglII coupe site13, la séquence de signaux de sécrétion insectes hemolin et un site multi clonage avec NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI et XhoI (Figure 1 b).</li>
	<li>Digest 4 µg d’ADN avec BglII et XhoI et 4 µg d’un vecteur d’expression ADN avec BamHI et XhoI14. Mélanger 10 unités de chaque enzyme de restriction avec l’ADN dans un 1 x tampon de réaction de concentration (acétate de potassium 50 mM, 20 mM Tris-acétate, acétate de magnésium de 10 mM et 100 µg/mL de BSA, pH 7,9 à 25 ° C) et laisser incuber le mélange à 37 ° C pendant 4 h.<ol>
<li>Purifier le fragment d’ADN excisé et le vecteur linéarisé ADN par un ADN gel extraction kit15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mélanger 100 ng du vecteur ADN linéarisé avec 400 ng d’ADN digéré fragment dans un mélange de réaction de ligature de 10 µL contenant 1 x tampon de réaction T4 DNA ligase (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2, ATP 1 mM et 10 mM DTT, pH de 7,5 à 25 ° C) et de 5 unités d’ADN T4 ligase. Incuber le mélange réactionnel à 16 ° C pendant 16 h.</li>
	<li>Transformer 5 µL du mélange ligature dans 100 µL de cellules capables de DH5α, puis sélectionnez les colonies sur une gélose au ampicilline LB. Prendre 5-10 colonies et grandir chaque colonie dans un milieu LB de 2 mL contenant 100 µg/mL d’ampicilline à 220 tr/mn et 37 ° C dans un incubateur à agitation pendant 16 h.</li>
	<li>Extraire l’ADN de plasmide avec un DNA miniprep kit17 et confirmer les clones par séquençage de l’ADN d’une amorce de AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>PCR-amplifier a. thaliana Pollen Receptor Kinase 3 (PRK3) fragment du gène codant des résidus 20-237 d’un synthétique PRK3 gène chimère (avant apprêt : CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, apprêt inverse : CGC GGATCC LTC GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Amplifier l’ADN pour 30 cycles dans un tampon de réaction de polymérase d’ADN contenant un mélange dNTP de 0,5 mM, 0,2 µM élémentaires, 0,1 µg d’ADN, 0,4 mM MgCl2et 1 unité de réaction de l’ADN polymérase.<ol>
<li>Pour les étapes du cycle de PCR, définir la dénaturation initiale à 95 ° C pendant 30 s et puis 30 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 30 s, recuit à 55 ° C pendant 30 s et l’extension à 72 ° C pendant 30 s au sein de chaque cycle et l’extension finale à 72 ° C pendant 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digérer le fragment PCR tant le vecteur mis à jour l’avec NotI et BamHI enzymes endonucléases de restriction. Ligaturer le fragment de gène avec le vecteur linéarisé. Mélanger 100 ng du vecteur ADN linéarisé avec 400 ng d’ADN digéré fragment dans un mélange de réaction de ligature de 10 µL contenant du tampon de réaction T4 DNA ligase et 5 unités de T4 DNA ligase. Incuber le mélange réactionnel à 16 ° C pendant 16 h.</li>
	<li>Transformer 5 µL du mélange ligature dans 100 µL de cellules capables de DH5α suite à un protocole de transformation standard, puis sélectionnez les colonies qui en résulte sur une plaque de gélose LB ampicillin16. Confirmer les clones correctes par séquençage de l’ADN.</li>
</ol>3. la production et l’Amplification de Baculovirus construit nourrissait la Cassette d’Expression de protéine recombinante
<ol><li>Utilisez 100 ng de plasmide construct de transformer 40 µL de cellules capables de DH10Bac selon le protocole du système baculovirus expression1. La transformation incuber à 37 ° C pendant 48 h.</li>
	<li>Ramasser les deux colonies blanches de chaque plaque de transformation, inoculer chaque colonie dans 2 mL de milieu LB contenant 50 µg/mL kanamycine, gentamicine 7 de µg/mL et 10 tétracycline µg/mL. Suivre le protocole du système expression baculovirus1 d’extraire et de vérifier la bacmid ADN. Aliquote chaque ADN dans deux tubes avec 20 µL de chaque et stockez les tubes à-20 ° C. Remarque : Les étapes suivantes nécessitent une opération aseptique.</li>
	<li>Atteindre une monocouche de cellules Sf9 dans les antibiotiques pénicilline-streptomycine de milieux de culture avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 100 µg/mL (ou 100 UI/ml) à 27 ° C 80 % confluent en une plaque 6 puits. Estimer le pourcentage de confluence basée sur le pourcentage de surface couverte sur la plaque de culture de tissus.</li>
	<li>Préparer les solutions suivantes dans deux tubes à centrifuger de 1,5 mL stérile.<ol>
<li>Tube 1 : Pour chaque transfection, diluer 20 µL de bacmid ADN dans 100 µL de milieu de culture cellulaire sans additifs Sf9 sans antibiotiques. Mélanger doucement la dilution en effleurant la paroi du tube.</li>
		<li>Tube 2 : Pour chaque transfection, diluer 8 µL de réactif de transfection de lipides dans 100 µL de milieu de culture cellulaire sans additifs Sf9 sans antibiotiques. Bien mélanger la dilution par pipetage de haut en bas pour 6 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combiner les deux solutions, mélangez-les délicatement en pipettant également lentement de haut en bas pour x 3 et les incuber pendant 20 à 40 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Lavez chaque puits de la monocouche Sf9 cellules 2 x avec 3 mL de milieu de culture cellulaire sans additifs Sf9 sans antibiotiques. Pour chaque transfection, ajouter 0,8 mL de milieu de culture cellulaire sans additifs Sf9 sans antibiotiques dans chaque tube contenant le mélange de lipides-ADN. Mélanger doucement le contenu des tubes de pipetage lentement de haut en bas pour 3 x. Aspirer les médias de lavage des plaques et superposer les échantillons avec le mélange de transfection.</li>
	<li>Après l’ajout du mélange transfection, incuber la plaque transfectée pendant 5 h à 27 ° C. Remplacer les médias de transfection avec le milieu de culture de cellules Sf9 complet contenant 10 % FBS et 100 µg/mL (ou 100 UI/ml) antibiotiques pénicilline-streptomycine. Incuber la plaque transfectée à 27 ° C, pendant 4 jours.</li>
	<li>Récolter et amplifier le baculovirus recombinant.<ol>
<li>Recueillir le liquide surnageant de la plaque infecté dans un tube conique stérile de 15 mL après 4 jours d’incubation. Faites tourner le surnageant à 1010 x g pendant 5 min éliminer les débris cellulaires. Ignorer le culot et éliminer le surnageant dans un tube propre et conserver à 4 ° C pendant 1 an. NOTE : Ceci est le virus P0. Il peut être aliquotés et congelés à-80 ° C pour une plus longue période de temps.</li>
		<li>Pour amplifier chaque virus recombinant, poussent une monocouche de cellules Sf9 sur un plat de 150 millimètres au confluent de 80 %. Aspirer les médias de la plaque, ajouter 2 mL du virus P0 à l’adhérent de cellules à la plaque et incuber la plaque dans une étuve à 27 ° C pendant 1 heure. Balancer la plaque toutes les 15 min pour mélanger le milieu avec les cellules.<ol>
<li>Ajouter 25 mL de médias de Grace complet contenant 10 % FBS et 100 µg/mL (ou 100 UI/ml) antibiotiques pénicilline-streptomycine. Incuber les plaques pendant 3 jours dans une étuve à 27 ° C pour obtenir le virus de passage de P1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Recueillir le liquide surnageant de la plaque infecté dans un tube conique stérile de 50 mL et un essorage à 1010 x g pendant 5 min éliminer les débris cellulaires. Décanter le liquide surnageant dans un tube propre et conserver à 4 ° C pendant 1 an. Remarque : Le virus P1 peut être aliquotés et congelés à-80 ° C pour une plus longue période de temps.</li>
		<li>Pour amplifier le virus de P1 à P2 passage, cultiver une monocouche de cellules Sf9 sur un plateau de 150 mm à 90 % confluence, aspirer les médias de la plaque, ajouter 2 mL du virus P1 à la plaque et il incuber pendant 1 heure dans une étuve à 27 ° C.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.8.2 et 3.8.3 pour obtenir les passages P2 et P3 des virus. Ne stockez pas le virus P3 pendant plus de 2 mois.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. protein Expression, Purification avec NiNTA et cristallisation
<ol><li>La culture 1 L de Hi5 cellules d’insectes dans les antibiotiques pénicilline-streptomycine de milieux de culture avec 100 µg/mL (ou 100 UI/ml) à une densité de 2 x 106 à 100 tr/min dans un shaker incubateur de 27 ° C. Tournez en bas les cellules à 570 x g pendant 5 min, éliminer le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 20 mL du virus P3 fraîchement produit et gardez-le à température ambiante pour 1 h. agiter doucement le flacon de spin pour remettre en suspension les cellules 1 x toutes les 15 min.</li>
	<li>Les cellules de transfert à 1 L d’antibiotiques pénicilline-streptomycine 100 µg/mL (ou 100 UI/ml), les milieux de culture, la culture des cellules à 100 tr/min dans un shaker incubateur de 27 ° C pendant 72 h. Spin down les cellules à 1 010 x g pendant 5 min et recueillir le surnageant.</li>
	<li>Indicateur de pH d’utilisation des bandes pour ajuster le pH du liquide surnageant à 8.0 en ajoutant 0,1 M HCl ou NaOH 0,1 M et ajouter le tampon de liaison à une concentration finale, contenant un tampon Tris 20 mM à pH 8,0, 100 mM NaCl et imidazole de 5 mM. Ajouter une certaine quantité de résine NiNTA (10 à 40 mL) basée sur le rendement estimé de la protéine recombinante His-tag.<ol>
<li>Mélanger la solution sur une agitation magnétique avec une vitesse réduite à 4 ° C pendant 1 h. lavage la résine et Éluer la protéine liée suivant le protocole de purification standard NiNTA18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sous réserve de la protéine purifiée de l’échange d’ions et la chromatographie par filtration, mais aussi d’autres méthodes de purification des protéines, pour obtenir un échantillon homogène de gel. Remarque : Pour le TDR ectodomaine, Tris, 20 mM, pH 8, 100 mM NaCl étaient utilisés comme tampon de gel filtration. Pour l’ectodomaine PRK3, 20 mM bis-Tris, pH 6, 100 mM NaCl servaient de tampon préféré gel filtration.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Compte tenu de la diversité dans la taille et de la stabilité des milliers de protéines présentes dans les systèmes biologiques, il est souvent empirique pour une recherche laboratoire de décider quel système d’expression hétérologue doit être choisi pour l’expression d’une protéine spécifique. Le système d’expression e. coli est souvent le premier choix pour l’expression de la protéine en raison du cycle de vie court de la bactérie, le faible coût des milieux de culture et assez facilement pour intensifier les<...

Il est impératif pour un laboratoire de recherche être capable de produire de grandes quantités de protéines recombinantes homogènes pour les caractérisations biochimiques et biophysiques, surtout pour les études de diffraction des rayons x. Il existe plusieurs systèmes d’expression hétérologue bien établies telles que Escherichia coli, levure, cellules d’insectes, des cellules de mammifères, les cellules végétales, etc. , parmi eux, le système d’expression baculovirus insectes cellulaire est un des plus couramment utilisé des techniques pour produire de grandes quantités de structurellement pliés grosses eucaryotes protéines recombinantes pour la cristallisation de protéines1.
Les vecteurs d’expression du système baculovirus expression sont conçus pour contenir un polyédrine fort ou un promoteur de P10 pour produire un rendement élevé de protéines intracellulaires recombinantes2,3. Pour faire un baculovirus recombinant, le gène d’intérêt est cloné dans un insecte vecteur contenant le locus polyédrine (Paolo) du génome Autographa californica multi-nucleopolyhedroviral. La construction qui en résulte est ensuite séquencée et son cadre de lecture ouvert correcte (ORF) est vérifié. La construction correcte est ensuite introduite dans la cellule d’insecte hôte à travers le processus de la transfection. Le gène d’intérêt est inséré dans le génome viral par recombinaison homologue. Cet événement donne lieu à la production du génome viral recombinant, qui réplique puis sur produire recombinant ont bourgeonné de particules de virus1.
Les cellules d’insectes qui sont plus couramment utilisés dans le système d’expression sont des cellules (Hi5) cinq Sf9 et haute. Les cellules SF9 sont un isolat clonal de Sf21, dérivé des pupes cellules ovariennes de Spodoptera frugiperda, et Hi5 cellules sont un isolat clonal dérivé le parental Trichoplusia ni cellules ovariennes ligne TN-3684,5. Transfections Co, amplification des virus et des essais de plaque sont menées sur les cellules Sf9, tandis que les cellules de Hi5 sont typiquement pour produire des quantités plus élevées de protéines recombinantes6. Il est à noter que les cellules de Hi5 ne conviennent pas pour la génération et l’amplification des descendances de virus à cause de leur tendance à produire des virus mutants. Traditionnellement, une plage de température de 25-30 ° C est considérée comme bonne pour la culture de cellules d’insectes. Toutefois, il a été signalé que les 27-28 ° C est la température optimale pour la cellule insectes croissance et infection7,8.
L’introduction d’une séquence signal fort qui précède le gène est nécessaire pour la forte expression des protéines sécrétées. La séquence signal guideraient efficacement la protéine recombinante traduite dans le réticulum endoplasmique pour la sécrétion de protéines et de modifications post-traductionnelles nécessaires à repliement adéquat et de stabilisation3. Séquences de peptide signal, tels que le baculovirus enveloppe protéique GP64/67, abeille mélittine et autres, ont été choisis pour faciliter l’expression de protéines recombinantes sécrétrices dans le systèmes de médiation baculovirus expression3. L’introduction du peptide signal de GP67 s’est avérée d’améliorer le rendement de l’expression d’une protéine recombinante sécrétée, en comparaison à l’aide du peptide signal intrinsèque du gène cible9. Hemolin est une protéine de l’hémolymphe de la teigne de soie géante Hyalophora cecropia, induite à bactéries infection10. En raison du niveau relativement élevé d’expression induite, la séquence de peptide signal du gène peut être utilisée à la médiation de l’expression de la sécrétion des protéines recombinantes dans le système baculovirus-insecte cellule.
L’Arabidopsis trachée élément différenciation inhibitrice facteur du récepteur (TDR) et Pollen Receptor Kinase 3 (PRK3) tous deux appartiennent à la famille de répétition comme récepteur Kinase (LRR-RLK) plante riche en Leucine de protéines11,12 . Afin d’étudier la structure et la fonction de cette famille de récepteurs des protéines végétales, aussi bien pour en faciliter la caractérisation structurale et biochimique des autres protéines végétales sécrétée, le système d’expression baculovirus-insecte cellule a été modifié à améliorer le rendement de qualité et de la production de protéines. Les domaines extracellulaires de TDR et PRK3 ont été exprimés avec succès dans le système d’expression baculovirus-insect cell à l’aide de deux vecteurs d’expression mis à jour le. Les deux domaines extracellulaires de TDR et PRK3 protéines ont été cristallisés. Cet article rend compte de l’expression et purification de grandes quantités de protéines recombinantes végétale sécrétée avec vecteurs d’expression baculovirus modifié deux en incorporant un GP67 ou une séquence de signaux de hemolin entre le promoteur et le clonage à des fins multiples sites.

<table><tbody><tr><td>Agitateur d’incubateur</td><td>VWR</td><td>Modèle Excella E25</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>VWR</td><td>Modèle 2005</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>BECKMAN</td><td>Modèle J-6</td><td>avec rotor à godets pivotants</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA polymérase</td><td>Agilent</td><td>600677-51</td><td>Pour l’amplification PCR de l’ADN</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>BIO-RAD</td><td>Modèle C1000 Touch</td><td>Pour l’amplification par PCR de l’ADN</td></tr><tr><td>Agitateur d’incubateur</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model I 24</td><td>Pour la culture de baceria</td></tr><tr><td>Synthèse de l’ADN du client</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td>Restriction Endonuclease</td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td>Restriction Endonuclease</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>Restriction Endonuclease</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Restriction Endonuclease</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>Ligature de l’ADN</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Purification de l’ADN à partir du gel Agorase</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Purification de l’ADN plasmidique à partir d’une culture bactérienne</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15510-019</td><td>Pour l’électrophérose sur gel d’ADN</td></tr><tr><td>MAX Efficacité DH5&alpha ; cellule competen</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>Pour la transformation du mélange de ligature de l’ADN</td></tr><tr><td>Lennox L LB Broth</td><td>Research Product International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>Pour la culture de bactéries</td></tr><tr><td>Ampicilline sel sodique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11593-019</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15160-054</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>Tétracycline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-75-5</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710-064</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>MAX Efficacité DH10Bac cellules compétentes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10361-012</td><td>Pour la fabrication de l’ADN bacmid</td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544-034</td><td>Pour la transformation de l’ADN</td></tr><tr><td>Réactif CellFECTIN II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362-101</td><td>Réactif de transfection de cellules d’insecte</td></tr><tr><td>Système d’expression Bac-à-Bac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10359-016</td><td>Kit d’expression de cellules de baculovirus-insectes</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15519-028</td><td>Pour l’isolement de l’ADN Bacmid récominant</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15529-019</td><td>Pour l’isolement de l’ADN Bacmid récominant</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10360014</td><td>Vecteur d’expression Baculorirus</td></tr><tr><td>Cellules Sf9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 cellules monocouches</td></tr><tr><td>Hi5 cellules</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>High Five cellules d’insectes</td></tr><tr><td>Grace' s milieu d’insecte, non supplémenté</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Sf9 transfection cellulaire minimum</td></tr><tr><td>milieu Grace' s milieu anti-insectes, complété</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11605102</td><td>Sf9 milieu complet de culture cellulaire monocouche</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10902104</td><td>Sf9 milieu de culture cellulaire en suspension sans FBS</td></tr><tr><td>Express Five SFM Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10486025</td><td>Hi5 milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml (10 000 UI/ml)</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>FBS Certifié</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Plaques à fond plat</td></tr><tr><td>150 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353025</td><td>100/caisse</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubes de microcentrifugation</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>500 tubes/sac</td></tr><tr><td>15 ml Tubes à centrifuger à bouchon à vis conique</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td>25 tubes/sac</td></tr><tr><td>50 ml Tubes à centrifuger à bouchon à vis conique</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td>25 tubes/sac</td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td> Bandes indicatrices de pH <td>en résine NiNTA</td></tr><tr><td></td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>pH 0 - 14</td></tr></tbody></table>

modification des vecteurs d’expression baculovirus pour produire sécrétée des protéines végétales dans des cellules d’insecte

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Il a été un défi pour les scientifiques exprimer les protéines eucaryotes sécrétoires recombinantes pour les études structurales et biochimiques. Le système d’expression baculovirus insectes cellulaire est l’un des systèmes utilisés pour exprimer les protéines sécrétoires eucaryotes recombinantes avec quelques modifications post-traductionnelles. Les protéines sécrétoires doivent être acheminés à travers les voies sécrétrices de la glycosylation des protéines, la formation de liaisons disulfure et autres modifications post-traductionnelles. Pour améliorer l’expression cellulaire insectes existants des protéines végétales sécrétoire, un vecteur d’expression baculovirus est modifié par l’ajout de soit un GP67 ou une séquence de peptide signal de hemolin entre le promoteur et le clonage de plusieurs sites. Ce système nouvellement conçu vecteur mis à jour le produit avec succès un rendement élevé de protéines réceptrices plante sécrétées recombinantes solubles d’Arabidopsis thaliana. Deux des protéines végétales exprimées, les domaines extracellulaires de récepteurs de la membrane plasmique d’Arabidopsis TDR et PRK3, ont été cristallisés pour les études de diffraction des rayons x. Le système mis à jour le vecteur est un outil amélioré qui est potentiellement utilisable pour l’expression de protéines recombinantes de sécrétion dans le règne animal ainsi.

Comme illustré à la Figure 1, deux vecteurs d’expression baculovirus mis à jour le pFastBac1 ont été utilisés pour exprimer les protéines sécrétées avec le GP67 ou la séquence signal hemolin pour remplacer la séquence signal intrinsèque du gène cible. Le GP67 virale et les gènes hemolin insectes ont été démontrés d’avoir des niveaux d’expression de sécrétion élevée dans les cellules. Protéines de fusion avec ou l’autre de ces deux séquences signal sont censés...

Nous présentons ici les protocoles utilisant les insectes cellulaire et baculovirus protein expression pour produire de grandes quantités de protéines végétales sécrétée de cristallisation de protéines. Un vecteur d’expression baculovirus a été modifié par GP67 ou peptide signal hemolin insectes pour expression plante de sécrétion des protéines dans des cellules d’insecte.

Modification des vecteurs d’Expression Baculovirus pour produire sécrétée des protéines végétales dans des cellules d’insecte

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biochimie et de la biologie structurale des protéines sécrétées, telles que la détermination de la structure des protéines, par cristallographie et cryo-EM. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit une grande quantité de protéines sécrétées par des recombinantes à un coût relativement faible pour la détermination de la structure des protéines. Tout d’abord, synthétisez un fragment d’ADN contenant un site de coupe à cinq premiers BglII, la séquence de signal de sécrétion d’intérêt dans un site de clonage multiple, comme décrit dans le protocole texte.Ensuite, digérez quatre microgrammes d’ADN avec BglII et X1, et quatre microgrammes d’ADN d’un vecteur d’expression avec BamH1 et X1. Mélangez 10 unités de chaque enzyme de restriction avec l’ADN dans un tampon de réaction de concentration 1X. Incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Ajoutez 10 microlitres d’un mélange de réaction de ligature contenant 1X tampon de réaction d’ADN Ligase T4 et cinq unités d’ADN Ligase T4 dans un tube Eppendorf frais de 1,5 millilitre.Ensuite, ajoutez 100 nanogrammes d’ADN vecteur linéarisé et 400 nanogrammes du fragment d’ADN digéré. Incuber à 16 degrés Celsius pendant 16 heures. Transformez cinq microlitres du mélange de ligature en 100 microlitres de cellules compétentes DH5 alpha et sélectionnez les colonies résultantes sur une plaque de gélose Ampicillin LB comme indiqué dans le protocole de texte.Choisissez entre cinq et 10 colonies, en transférant chacune dans deux millilitres de milieu LB contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Cultivez ces colonies dans un incubateur à secouer à 220 tr/min à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Après cela, utilisez un kit DNA Miniprep pour extraire chaque ADN plasmidique.Confirmez les clones par séquençage de l’ADN à l’aide d’une amorce de séquençage en aval, comme indiqué dans le protocole de texte. En utilisant 100 nanogrammes du plasmide de construction, transformez 40 microlitres de cellules compétentes DH10Bac comme indiqué dans le protocole textuel. Incuber les plaques de transformation à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.Prélevez deux colonies blanches dans chaque plaque de transformation et inoculez chaque colonie dans deux millilitres de milieu LB contenant de la kanamycine, de la gentamycine et de la tétracycline. Extrayez et vérifiez l’ADN du bacmid comme indiqué dans le protocole texte. Aliquote chaque ADN dans deux tubes avec 20 microlitres transférés dans chaque tube.Rangez ensuite les tubes à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à continuer. Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées de manière aseptique. Dans une plaque à six puits, cultivez une monocouche de cellules Sf9 dans le milieu de culture avec 10 % de sérum de veau fœtal et 100 microgrammes par millilitre d’antibiotiques pénicilline-streptomycine à 27 degrés Celsius à 80 % de confluence.Pour chaque transfection, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture cellulaire Sf9 non supplémenté sans antibiotiques dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Diluez 20 microlitres d’ADN bacmid dans chaque tube et agissez doucement pour mélanger. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture cellulaire Sf9 non supplémenté sans antibiotiques dans un tube de 1,5 millilitre pour chaque transfection.Diluez huit microlitres de réactif de transfection lipidique dans chaque tube et mélangez en pipetant soigneusement de haut en bas six fois. Combinez ces deux solutions et mélangez-les en pipetant doucement lentement de haut en bas trois fois. Incuber de 20 à 40 minutes à température ambiante.Lavez chaque puits de la plaque de culture deux fois en utilisant trois millilitres de milieu de culture Sf9 non supplémenté sans antibiotiques pour chaque lavage. Ensuite, ajoutez 0,8 millilitre de milieu de culture cellulaire Sf9 non supplémenté sans antibiotiques dans chaque tube contenant le mélange d’ADN lipidique. Pipeter lentement de haut en bas trois fois pour mélanger.Aspirez le produit de lavage des plaques et recouvrez-les échantillons avec le mélange de transfection. Incuber la plaque transfectée pendant cinq heures à 27 degrés Celsius. Après cela, remplacez le milieu de transfection par le milieu de culture cellulaire Sf9 complet qui contient 10 % de FBS et 100 microgrammes par millilitre d’antibiotiques pénicilline-streptomycine.Incuber à 27 degrés Celsius pendant quatre jours. Ensuite, recueillez le surnageant dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Tournez à 1 010 fois g pendant cinq minutes pour éliminer les débris cellulaires.Jetez la pastille et décantez le surnageant dans un tube propre. Conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à un an ou jusqu’au moment de l’utiliser. Pour amplifier chaque virus recombinant, cultivez d’abord une monocouche de cellules Sf9 sur une plaque de 150 millimètres jusqu’à 80 % de confluence.Ensuite, aspirez le milieu et ajoutez deux millilitres du virus P0 dans chaque puits. Incuber pendant une heure dans un incubateur à 27 degrés Celsius, en secouant la plaque toutes les 15 minutes pour mélanger le milieu avec les cellules. Ensuite, ajoutez 25 millilitres de milieu de grâce complet contenant 10 % de FBS et 100 microgrammes par millilitre d’antibiotiques pénicilline-streptomycine.Incuber la plaque pendant trois jours dans un incubateur à 27 degrés Celsius pour obtenir le virus du passage P1. Après cela, recueillir le surnageant dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Tournez à 1 010 fois g pendant cinq minutes pour éliminer les débris cellulaires.Décanter le surnageant dans un tube propre et le conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à un an ou jusqu’au moment de l’utiliser. Pour amplifier le virus du passage P1 à P2, cultivez d’abord une monocouche de cellules Sf9 sur une plaque de 150 millimètres jusqu’à 90 % de confluence. Une fois la confluence souhaitée atteinte, aspirez le fluide.Ajoutez deux millilitres du virus P1 et incubez pendant une heure dans un incubateur à 27 degrés Celsius. Répétez les étapes d’amplification pour obtenir les passages P2 et P3 du virus. Dans cette étude, deux vecteurs d’expression modifiés du baculovirus pFastBac1 sont utilisés pour exprimer les protéines sécrétées avec la séquence de signal gp67 ou la séquence de signal de l’hémoline en remplaçant la séquence de signal intrinsèque du gène cible.Le PBEC gp67 est utilisé avec succès pour exprimer les domaines extracellulaires du récepteur a-thal-leano TDR. Alors que l’hémoline PBEC1 est utilisée avec succès pour exprimer le domaine extracellulaire PRK3. Ensuite, les protéines purifiées sont concentrées à cinq milligrammes par millilitre et soumises à un criblage de cristallisation.Les conditions qui ont produit des cristaux préliminaires pour chaque protéine sont optimisées jusqu’à ce que des cristaux de protéines supérieurs à 20 micromètres soient observés. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’ils examinent la qualité des protéines par chromatographie d’exclusion stérique, diffusion de la lumière multi-angle et d’autres tests pour déterminer l’état de non-agrégation de la protéine recombinante. N’oubliez pas, de vérifier la pureté de la protéine également par coloration à l’argent.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la cristallographie aux rayons X et la cryo-EM peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les structures tridimensionnelles de la protéine produite. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie structurale pour explorer les propriétés structurelles, fonctionnelles et biochimiques des protéines sécrétées par les plantes et les mammifères. N’oubliez pas que travailler avec la lumière ultraviolette pour visualiser les bandes d’ADN sur le gel d’agarose peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de protections UV, d’un écran facial, de lunettes de protection, d’une blouse de laboratoire, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.De plus, lors de la fabrication de tampons, soyez prudent lorsque vous manipulez des acides et des bases forts.

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