Name: Contractions de syncytiums Cardiomyocyte iPSC-anthropique mesurées avec un colorant Fluorescent Ca sensible dans le contrôle de la température des plaques 384 puits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Découvrez une méthode de criblage à haut débit pour évaluer les effets de composés sur la fréquence de contraction des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines. Cette technique permet un dépistage rapide et économique en pharmacologie cardiaque.

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1. préparation des plaques de la cellule
NOTE : Préparez les plaques de la cellule 3–4 semaines avant la mesure des effets de la drogue.
<ol><li>Jour 0 de l’expérience NOTE: aux fins de planification, l’application composé de test peut être effectuée sur n’importe quel jour entre jours 22–28 de l’expérience.<ol>
<li>Allumez le bain-marie à 37 ° C et chaud 40 mL de milieu de placage (tel que fourni par le fabricant). NOTE : Utiliser les cellules avec leurs médias correspondant de culture et d’entretien fournies par le fournisseur.</li>
		<li>Décongeler le hiPSC-CM en plaçant les cryotubes contenant des cellules congelées dans un bain-marie pendant 2 min.</li>
		<li>Transfert avec soin les suspensions cellulaires de 1 mL dans un tube conique de 50 mL.</li>
		<li>Lavez chaque cryotube avec 1 mL de milieu de placage chaude pour récupérer les restes cellules et ajouter le support de lavage dans le tube conique même des cellules contenant étape 1.1.3.</li>
		<li>Mélanger soigneusement un autre 8 mL de milieu chaud placage dans la suspension cellulaire.</li>
		<li>Compter les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan et un hematocytometer8. NOTE: l’exigence de 6 x 106 cellules pour une plaque de 384 puits cellulaire considère la possibilité de jusqu'à 20 % de cellules mortes parmi les cellules congelées, qui est un maximum dans notre expérience.</li>
		<li>Ajuster la suspension de cellules à 5 x 105 cellules/mL direct avec le milieu de placage à chaud.</li>
		<li>Distribuer la suspension cellulaire dans deux plaques de 384 puits cellulaires en ajoutant 25 µL à chaque puits (environ 12 500 cellules / puits). Remarque : Les plaques de la cellule n’avez pas besoin d’être revêtus d’une matrice (voir Discussion).</li>
		<li>Maintenir les plaques de la cellule à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 1 de l’expérience<ol>
<li>Allumez le bain-marie à 37 ° C et chaud 50 mL de milieu de maintenance supplémenté avec solution de pénicilline-streptomycine 1 % v/v.</li>
		<li>Remplacer le médium placage avec 50 µL de milieu chaleureux entretien dans chaque puits de plaques des cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jours 2–21 (jusqu’au jour 27) de l’expérience NOTE: les hiPSC-CMs n’est pas nécessaire tout passage au cours de cette période, car ils sont non de Division des cellules.<ol>
<li>Renouveler la moitié de la moyenne de l’entretien tous les 2–3 jours et le renouveler entièrement sur les 7, 14 et 21 jours. Remarque : La mesure de la fluorescence peut être effectuée entre le 22 et le 28 de l’expérience. Durées plus longues n’ont pas été jugés, mais peuvent encore être fines.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation de l’Instrument, composé de planches et plaques de dosage
NOTE: préparer l’instrument, les plats composés et dosage des plaques le jour de la mesure des effets des médicaments, entre 22 et 28 de l’expérience. Utilisez un lecteur de plaque fluorescente avec contrôle de température et un témoin de filtre approprié fluorescence kit et excitation source. Par exemple, utiliser un kit de filtre de fluorescence Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 (excitation : 472 nm ; émission : 520–560 nm) et une unité de source lumineuse 150 W excitation.
<ol><li>Au moins 2 h avant la première plaque de cellule doit être placée dans le lecteur de plaque pour la mesure, allumez le lecteur et régler le système de chauffage à 37 ° C. NOTE: cela peut aussi être fait la veille au soir.</li>
	<li>Préparer les témoins positifs, la forskoline, N6-cyclopentyl-adénosine et E-4031 comme des solutions mères de 0,33 mM dans le DMSO, 10 mM dans le DMSO et 3,33 mM H2O, respectivement. NOTE: solutions mères seront diluées 333-fold au moment où ils sont ajoutés aux cellules, et le but est d’atteindre des concentrations d’essai final de 1 µM forskoline, 30 µM N6-cyclopentyl-adénosine et 10 µM E-4031, qui produisent des effets fiables et reproductibles.</li>
	<li>Préparer les 352 composés d’essai comme solutions mères de DMSO à 333-fold les concentrations d’essai prévue (par exemple, 10 mM pour un test à 30 µM). Remarque : L’objectif est d’atteindre une concentration finale de 0,3 % (v/v) de DMSO dans la plaque cellulaire après l’application de composés ; Il s’agit de la plus forte concentration de DMSO qui n’affecte pas l’activité rythmique des cardiomyocytes. Les solutions mères peuvent également être préparées la veille. Il faut un minimum de 5 µL de solution mère pour chaque mesure en double.</li>
	<li>Préparer les assiettes composées.<ol>
<li>Chauffez 40 mL de milieu d’entretien complété avec solution de pénicilline-streptomycine 1 % v/v à la température ambiante.</li>
		<li>Distribuer en deux plaques 384 puits composés en ajoutant 1,5 µL de solution mère / puits : i) des composés d’essai (deux puits), ii) les contrôles positifs (la forskoline, N6-cyclopentyl-adénosine et E-4031, quatre puits de chaque par plat composé) et iii) le négatif contrôle (DMSO, 20 puits par plat composé).</li>
		<li>Centrifuger les plaques composés à 100 x g pendant 1 min.</li>
		<li>Ajouter 37 µL de milieu de maintenance à la température ambiante dans chaque cupule (3,9 % DMSO à 38,5 µL à ce stade).</li>
		<li>Centrifuger les plaques composés à 100 x g pendant 1 min.</li>
		<li>Charger les plaques composés dans le lecteur de plaque. NOTE : Les prochaines étapes devraient être effectuées dès que possible afin de minimiser l’évaporation dans les plats composés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le colorant fluorescent.<ol>
<li>Allumez le bain-marie à 37 ° C et chaud 100 mL de milieu de maintenance supplémenté avec solution de pénicilline-streptomycine 1 % v/v.</li>
		<li>Reconstituer le colorant fluorescent Ca-sensible et extincteur 10 ml de milieu de maintenance chaud avec des antibiotiques. NOTE: ce milieu de fluorescence stock contient le colorant fluorescent Ca sensibles, généralement Fluo-4 et un extincteur, et les restes peuvent être stockés à 4 ° C pendant au moins 5 jours.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Acquisition de données
Remarque: effectuer l’acquisition de données sur le jour de la mesure des effets de la drogue. Procédez comme 3.1–.10 entièrement pour la première plaque de cellule, puis répéter pour la seconde plaque cellulaire.
<ol><li>Lancez le logiciel de lecteur de plaque (si nécessaire) et charger les pointes de pipette.</li>
	<li>Ajustez les réglages du logiciel pour enregistrer un segment 2 min des vagues de Calcium avec une fréquence d’acquisition au moins 10 Hertz pour définir la fréquence des battements de base pour chaque puits.</li>
	<li>Pour une plaque cellulaire, diluer 3 mL de milieu de fluorescence stock dans 12 mL de milieu de maintenance chaud avec des antibiotiques pour rendre le milieu de la fluorescence.</li>
	<li>Remplacer 20 µL de milieu dans chaque puits de la plaque cellulaire avec 30 µL de milieu de fluorescence.</li>
	<li>Pipetter, monter et descendre de 1 x à mélanger.</li>
	<li>Placer la plaque cellulaire dans le lecteur de plaque aussi rapidement que possible pour laisser le hiPSC-CM s’acclimater à la température.</li>
	<li>Attendez 60 min avant de commencer la collecte de données.</li>
	<li>Commencer la collecte de données dans le logiciel de lecteur de plaque pour enregistrer un segment de 2 min d’ondes Ca avec une fréquence d’acquisition d’au moins 10 Hz, pour définir le niveau de référence battant le taux pour chaque puits. Remarque: pour chaque séquence de l’enregistrement, assurez-vous que la plaque cellulaire ne sont pas transférée automatiquement hors de l’appareil après l’acquisition de données. Cela empêche la plaque de la cellule de refroidissement à la température ambiante. Avec certaines versions du logiciel de lecteur de plaque, il peut être nécessaire d’arrêter chaque enregistrement avant la fin complètement pour y parvenir.</li>
	<li>Ajouter les composés d’essai et de référence avec le robot de lecteur de plaque en pipettant également, puits à puits 5 µL dans le plat composé dans la plaque cellulaire (après l’addition, la concentration de DMSO est 0,3 % [v/v]).</li>
	<li>Commencer la collecte de données dans le logiciel de lecteur de plaque à segments record 2 min des vagues de Ca à partir de 5, 15, 30, 45 et 60 min après l’addition de composé (Assurez-vous que chaque fois que la plaque cellulaire reste dans l’appareil).</li>
</ol>4. analyse des données
NOTE: l’analyse des données peut être effectuée à tout moment après la mesure.
<ol><li>Exporter les données brutes pour chaque période d’enregistrement par le logiciel de lecteur de plaque comme des fichiers texte ASCII.</li>
	<li>Importer les données brutes dans le logiciel d’analyse de données.</li>
	<li>Pour chaque puits et tous les points dans le temps, extraire la fréquence de battement principal. Remarque : Avec le logiciel d’analyse de données énuméré dans la Table des matières, battant des fréquences peut être calculée avec une routine d’analyse personnalisée en utilisant la fonction LombPeriodogram, basée sur la méthode Lomb – Scargle d’analyse spectrale des moindres carrés7 . Le périodogramme doit être calculé pour une gamme de fréquences comprises entre 0,01 et 5 Hz. Les primaires de fréquence peuvent être extraites le périodogramme utilisant les routines de PeakAutoFind. Cette méthode d’analyse fournit des mesures plus précises de battre les fréquences que la méthode fourni en option avec le logiciel de lecteur de plaque. Toutefois, ce dernier toujours utilisable si la personnalisation du logiciel n’est pas une option.</li>
	<li>Exporter les fréquences de battement principal pour chaque période d’enregistrement du logiciel d’analyse de données comme presse-papiers copies ou des fichiers texte ASCII.</li>
	<li>Importer les fréquences de battement primaire dans un logiciel de tableur par collage de presse-papiers ou importation de fichiers texte. NOTE: étapes 4,5–4,9 peuvent être effectuées dans n’importe quel tableur moderne.</li>
	<li>Pour chaque puits, normaliser au niveau de référence la fréquence de battement à chaque point dans le temps après la demande de drogues (5, 15, 30, 45 et 60 min) en divisant la fréquence de battement principal à ce moment-là point par la fréquence de battement principal au départ.</li>
	<li>Calculer l’effet moyen de DMSO à chaque point dans le temps après la demande de drogue (5, 15, 30, 45 et 60 min) en faisant la moyenne des valeurs normalisées pour les 20 puits où le DMSO a été appliquée.</li>
	<li>Pour chaque bien et chaque fois que le point après la demande de drogue (5, 15, 30, 45 et 60 min), soustraire l’effet moyen de DMSO (apparié dans le temps) pour la même plaque.</li>
	<li>Moyenne des mesures en double. Remarque: si un composé change de fréquence ou le logiciel ne peut pas trouver une fréquence primaire après l’addition de composé, un examen visuel du modèle battant peut évaluer si le composé produit des arythmies.</li>
</ol>

<ol><li>Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+risk+of+drug-induced+proarrhythmia+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).</li>
<li>Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance-based+detection+of+beating+rhythm+and+proarrhythmic+effects+of+compounds+on+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).</li>
<li>Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+their+derivatives%3A+a+renaissance+in+cardiovascular+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).</li>
<li>Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li>
<li>Sube, R., Ertel, E. A. <a target="_blank" href="https://www.scirp.org/journal/PaperInformation.aspx?PaperID=80769">Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs.</a> Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23(2017).</li>
<li>Sirenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+in+vitro+assessment+of+compound+effects+on+cardiomyocyte+physiology+using+iPSC+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).</li>
<li>VanderPlas, J. T. <a target="_blank" href="https://arxiv.org/pdf/1703.09824.pdf">Understanding the Lomb-Scargle Periodogram.</a> Cornell Univeristy Library. , arXiv:1703.09824 (2017).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3 B 1-3 (2015).</li>
<li>Ertel, E. A., Godfraind, T. Calcium channel blockers and calcium channels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErtel%2C+EA+%22Calcium+Channel+Blockers%22">Calcium Channel Blockers</a>. Godfraind, T. , Springer. Basel, Switzerland. 11-80 (2004).</li>
<li>Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+potassium+channels+by+antiarrhythmic+and+antihypertensive+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs.</a> Hypertension. 19, 228-236 (1992).</li>
<li>Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidinium+Toxins+and+Their+Interactions+with+Voltage-Gated+Sodium+Ion+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels.</a> Marine Drugs. 15 (10), (2017).</li>
<li>Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li>
<li>Puppala, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiling+in+human-induced+pluripotent+stem+cell--derived+cardiocytes+and+human+and+cynomolgus+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue.</a> Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).</li>
<li>CIPA. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cipaproject.org">http://cipaproject.org</a> (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Deux aspects sont plus critiques pour l’enregistrement réussi d’avoir battu des fréquences. La première consiste à faire preuve de prudence avec l’électrodéposition de cellule et de la culture. En particulier, il est important d’essayer de ne pas rayer la couche de cellules au fond des puits lors de l’échange du milieu. Il est acceptable de toucher le fond du puits avec les pipettes, mais le même angle doit être utilisé à chaque fois, ce qui produit seulement une petite égratignure dans la couche de cellules et sans incidence sur les performances du test. Le deuxième aspect critique d’obtention reproductibles rythmes homogènes est de fournir le bon contrôle de température à 37 ° C dans l’ensemble de la plaque cellulaire pendant la durée de la mesure. Nous ne pourrions pas obtenir cette homogénéité à l’aide de dispositifs autres que le lecteur utilisé ici, mais il peut être possible avec des modifications de la régulation de la température : il rendrait le protocole présenté ici plus largement utilisable au-delà d’une seule marque de plaque lecteur. Pour atteindre une stabilité de température pendant la durée de l’expérience avec le dispositif utilisé ici, il fallait arrêter chaque enregistrement avant que ça s’est terminé ; dans le cas contraire, le robot serait éjecter la plaque cellulaire mesurée. Ce problème technique peut disparaître avec la prochaine version du logiciel lecteur plaque, mais il demeure critique pour l’instant. Si une plaque de cellules est transférée par erreur en dehors du lecteur de plaque, il doit être chargé à l’intérieur aussi vite que possible. Néanmoins, la qualité de l’expérience se détériorera, parce que les changements de température affectent la fréquence des battements très rapidement.
D’autres aspects, qui n'ont pas été testés à fond, peut-être moins importants. Par exemple, hiPSC-CM fabricants recommandent de plaques de culture cellulaire enduit avant d’ensemencer les cellules, mais dans ce test spécifique, revêtement non utilisée, parce que les cellules adhèrent facilement sur diverses surfaces, et il est très difficile pour bien enrober 384 puits plaques. Pourtant, revêtement plaque cellulaire peut toujours être admissible, ou il peut même améliorer la qualité de l’analyse. Nous avons vérifié également jamais si des solvants autres que le DMSO serait acceptables, mais de l’expérience avec d’autres technologies d’enregistrement, il est prévu que des concentrations similaires de EtOH ou MeOH serait aussi tolérables. Nous utilisons généralement hiPSC-CMs provenant du même fabricant, et les cellules d’un seul fournisseur supplémentaire ont été testés, qui semblait fonctionner d’une manière similaire. De même, nous avons utilisé seulement un petit nombre de lots différents de hiPSC-CMs qui ont été choisis par eux vérifie pour vérifier qu’ils se sont comportés de la même façon pour le premier lot. Un ou deux lots ont été jugées inappropriées parce que leurs syncytiums eu faible stabilité ou reproductibilité dans les conditions de culture utilisées ici. Dans le cas contraire, la pharmacologie apparaît très semblable à travers des lots lors du test d’un groupe limité de composés « typiques » (la forskoline, N6-cyclopentyl-adénosine et E-4031, ainsi que l’endothéline, isoprotérénol, amlodipine et ponesimod). Nous avons utilisé seulement hiPSC-CM provenant de donneurs sains. Il peut être utile d’évaluer si hiPSC-CM provenant de patients atteints de cardiopathie donnerait des résultats différents, bien qu’aucune différence entre donneurs sains et des patients a été observée lors de l’évaluation de la cardiotoxicité des inhibiteurs de tyrosine kinase 12. Enfin, nous avons normalement attendre 22 – 28 jours de culture avant de mesurer les effets des médicaments : dans notre expérience avec des enregistrements d’impédance des mêmes cellules, un état d’équilibre pour ralentir impédance (un indicateur de stabilité de couche de cellules) et l’impédance rapide (un indicateur de battre la fréquence) est atteint après 12–15 jours de culture. Cependant, nous avons décidé d’attendre 22–28 jours, parce que c’est le moment où le profil d’expression des canaux cardiaque et marqueurs maturation s’est stabilisée à13. Il n’a pas examiné si des résultats comparables seraient obtenus si les cellules ont été utilisés plus tôt ou plus tard.
Le protocole décrit ici utilise une mesure très simple de la fréquence des battements spontanée de hiPSC CM pour évaluer les éventuels effets des médicaments sur l’électrophysiologie cardiaque humaine. Ses principaux avantages par rapport aux autres méthodologies sont que i) elle se prête à un environnement de criblage à haut débit, ii) il enregistre l’activité des cardiomyocytes et les effets des médicaments à température physiologique, et iii) il ne nécessite pas expertise électrophysiologique pour l’exécution ou pour une évaluation des résultats.
Dans une étude de validation réalisée avec beaucoup de médicaments approuvés pour usage humain, nous avons montré que le test réagit aux médicaments utilisés en médecine humaine tel que prédit par les données cliniques5. Parce que cette méthode tient compte de tous les effets potentiels sur le rythme cardiaque, il complète le complète en vitro proarythmiques assay (CiPA) initiative14 qui évalue spécifiquement potentiel pro-arythmique.
À l’avenir, cette méthode pourrait fournir un mieux comprendre le mode d’action des médicaments montré d’influer sur la fréquence des battements spontanée. Il est probable qu’adicionais mécanistes sont présents dans les enregistrements de la fluorescence des transitoires de Ca (p. ex., dans leur forme ou leur amplitude). Si les enregistrements de fluorescence sont effectuées au taux d’acquisition plus élevés (p. ex., 30 Hz), ces paramètres sont facilement extraits en plus de battre des taux, et il peut être intéressant de corréler les variations de ces paramètres avec les effets connus du sur le plan clinique consommé de la drogue.

Le présent protocole décrit une méthode pour mesurer les effets des médicaments sur la fréquence de battement spontanée de syncytiums de hiPSC CM à rythmes physiologiquement pertinents. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme peuvent se différencier en cardiomyocytes fonctionnelles qui établissent spontanément battant syncytiums in vitro1,2,3,4. Ces hiPSC-CM peut être obtenus en grand nombre par le biais de fournisseurs commerciaux ou production en laboratoire, et elles constituent une source utile de cellules pour produire des modèles de la physiologie cardiaque humaine et de la pharmacologie. En particulier, il peuvent servir à prévoir ou à caractériser les effets cardiaques qui peuvent survenir lorsqu’un médicament est administré à l’homme5.
La fréquence de battement de syncytiums hiPSC-CM peut être mesurée dans des conditions physiologiques, à l’aide de matrices de microélectrodes ou impédance détection1: ces techniques non invasives des renseignements très détaillés sur les effets des médicaments, mais ils sont plutôt bas-débit et ils ne permettent pas de grandes bibliothèques composés le test dans les temps réaliste et contraintes budgétaires. Un système plus efficace peut être élaboré à l’aide d’une fluorescence de 384 puits lecteur de plaques d’imagerie et un sensible Ca teindre6, mais lecteurs de plaques classiques sont gênées par fréquence de commande et acquisition de température sous-optimale. Ces limitations sont illustrées par des taux de battement non (~ 15 bpm, comparativement à 35 – 55 bpm dans des environnements contrôlés1) et la mauvaise résolution de signal Ca (une fréquence d’acquisition de 8 Hz est à la limite inférieure aux taux Records pouvant atteindre 120 bpm dans des conditions stimulées, et il ne peut pas extraire les informations telles que la pente ou la durée). La méthode décrite ici combine l’enregistrement de battre les patrons à rythmes physiologiques et à une résolution suffisante pour empêcher ces préoccupations.
Du côté positif, cette méthode est simple, fiable et haut débit, qui permet l’essai rapide d’un grand nombre de composés à des coûts raisonnables. Sur le plan négatif, cette méthode nécessite un lecteur de plaque rapide avec contrôle de température effective, ce qui représente un investissement coûteux, et il fournit des informations peu mécanistes sur les effets des médicaments observés, qui peuvent nécessiter d’autres essais avec plus détaillées Méthodes.
Environ 6 x 10 hiPSC6 CM sont nécessaires pour une mesure dans une plaque de 384 puits cellulaire. hiPSC-CM sont habituellement fournis dans le commerce comme des aliquotes congelés du ~ 4 x 106 cellules dans 1 mL. Par conséquent, il convient de préparer deux plaques cellulaires avec trois aliquotes congelées. Dans la plupart des cas, en raison de la faible variabilité de ce test, il suffit de réaliser des mesures en double des composés d’essai et, dans chaque plaque cellulaire, quatre mesures de contrôle positif (la forskoline, N6-cyclopentyl-adénosine et E-4031), et mesures 20-plissées de contrôle négatif (DMSO uniquement). Par conséquent, un maximum de 352 paires composé/concentration peut être évalué avec deux plaques de 384 puits cellulaires. Le protocole suivant estime qu’une telle expérience avec 352 composés d’essai, deux plaques de la cellule et 12 millions de cellules fournies comme trois aliquotes congelées ; Il peut être facilement mis à l’échelle en place si les points de données supplémentaires sont nécessaires.

<table><tbody><tr><td>FDSS7000 lecteur de plaques fluorescentes</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td><td>non inscrit au</td><td></td>catalogue</tr><tr><td>FDSS7000 kit de filtre de fluorescence Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td><td></td><td>installé initialement dans l’appareil</td></tr><tr><td>FDSS7000 contrôle de température</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td><td>A10118-09</td><td></td></tr><tr><td>FDSS7000 Unité de source lumineuse d’excitation 150 W</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td><td>C11653-11</td><td></td></tr><tr><td>FDSS7000 pointes de pipette pour plaques à 384 puits</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td><td>A8687-62</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de forme d’onde pour cardiomyocytes</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td><td>U8524-12</td><td>alternative optionnelle au logiciel</td></tr> <tr><td>Igor ProLogiciel d’analyse de données Igor Pro</td><td>Wavemetrics (Portland, Oregon, États-Unis)</td><td>Dernière version</td><td></td></tr><tr><td>iCell-Cardiomyocytes Kit</td><td>Cellular Dynamics International (Madison, WI)</td><td>R1106</td><td>comprend des cellules, des supports de placage et de maintenance</td></tr><tr><td>Cor.4U Cardiomyocyte Kit</td><td>Ncardia Germany (Cologne, Allemagne)</td><td>Ax-B-HC02-4M</td><td>comprend des cellules, des supports de placage et d’entretien alternative aux plaques de culture cellulaire à 384 puits iCell-Cardiomyocytes</td></tr><tr><td></td><td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Allemagne)</td><td>781091</td><td></td></tr><tr><td>plaques composées à 384 puits</td><td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Allemagne)</td><td>781280</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Calcium 4 Assay</td><td>Kit Molecular Devices (Sunnyvale, Californie)</td><td>R8142</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich (Buchs, Suisse)</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>N6-cyclopentyl-adénosine</td><td>Sigma-Aldrich (Buchs, Suisse)</td><td>C8031</td><td></td></tr><tr><td>E-4031</td><td>Enzo Life Sciences (Lausen, Suisse)</td><td>BML-KC158</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine solution</td><td>Gibco/ThermoFisher (Reinach, Suisse)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Gibco/ThermoFisher (Reinach, Suisse 15250061</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

contractions de syncytiums cardiomyocyte ipsc-anthropique mesurées avec un colorant fluorescent ca sensible dans le contrôle de la température des plaques 384 puits

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

Contractant spontanément syncytiums de cardiomyocytes dérivés de pluripotentes induites par l’homme des cellules souches (hiPSC CM) sont un modèle intéressant de la physiologie cardiaque humaine et de la pharmacologie. Diverses méthodes ont été proposées pour enregistrer cette activité spontanée et pour évaluer les effets des médicaments, mais beaucoup de ces méthodes souffrent d’un débit limité et/ou pertinence physiologique. Nous avons développé un système de criblage à haut débit afin de quantifier les effets des composés exogènes à la fréquence de battement de hiPSC CM, à l’aide d’un colorant fluorescent Ca sensible et un lecteur de plaque multipuits imagerie thermorégulées. Nous décrivons comment préparer les plaques de la cellule et les plaques composés et comment faire pour exécuter le test automatisé pour atteindre la reproductibilité et sensibilité élevée. Nous décrivons également comment transformer et analyser les données de fluorescence pour fournir une mesure fiable des effets de la drogue sur le rythme spontané. Ce test peut être utilisé dans les programmes de recherche pour guider optimisation chimique loin de, ou vers, composés qui affectent la fonction cardiaque humaine.

La figure 1 montre un enregistrement représentant des ondes de Ca au départ à travers une plaque 384 puits. Dans la plupart des cas, tous les puits révèlent un taux de battement régulier avec peu de variabilité dans l’ensemble de la plaque (moyenne ± écart-type = 40,1 ± 3,5 bpm ; fourchette = 34 – 54 bpm). Très rarement (moins de 1 sur 10 expériences), quelques puits (inférieur à 5) ont arythmie ou l’absence de rythme. En trois plaques 384 puits, nous avons aussi essayé d’un autre fournisseur, les cardiomyocytes (voir Table des matières) et a obtenu des valeurs de base très similaire pour avoir battu spontanée.
Bloqueurs des canaux ioniques cardiaques, le rythme des cardiomyocytes dans une manière reproductible5perturbé. Amlodipine, un bloqueur de la lente Ca canaux9, accélère le rythme de plus de 100 % d’une manière dépendante de la concentration jusqu'à 1 µM (Figure 2 a). L’effet est bien développé au cours des 5 premières minutes, mais il augmente encore environ 50 % dans les prochaine 30 min avant de se stabiliser. Au-dessus de 1 µM, amlodipine arrête le battement (en pointillés), comme peut s’y attendre du fait que Ca cyclisme est essentiel aux contractions spontanées. Autres bloqueurs de canaux Ca dihydropyridine sélectives produisent des effets très similaires.
E-4031, un bloqueur des canaux redresseur retardé rapide K10, ralentit le rythme environ 65–70 % d’une manière dépendante de la concentration jusqu'à 10 µM (Figure 2 b). L’effet se développe dans les 5 premières minutes et elle ne varie pas au cours des 60 prochaines minutes. Autres bloqueurs sélectifs des IKr produisent des effets similaires, bien que la réduction maximale des taux peut varier (par exemple, 35–40 % pour le cisapride, 70 % pour les E-4031 et 90-95 % pour dofétilide). On ne connaît pas le fondement de cette disparité.
La tétrodotoxine, un bloqueur de la rapide Na canaux11, ralentit le rythme d’environ 15 % de manière dose-dépendante, jusqu'à 1–30 µM (Figure 2). L’effet est bien développé au cours des 5 premières minutes et elle ne varie pas beaucoup dans le prochaine 60 min. Cependant, au-dessus de 30 µM, la tétrodotoxine arrête le passage à tabac au cours des 5 premières minutes, alors qu’après 30 min, il arrête il au-dessus de 1 µM. Autres bloqueurs de canaux Na, comme la lidocaïne ou la mexilétine, produisent des effets similaires de type tout ou rien.
Bépridil, un bloqueur mixte de cardiaque Na, Ca et K canaux9, produit également un effet tout ou rien (Figure 2D). Ceci suggère que, dans cette préparation, un bloc de canaux Na est l’action principale de bépridil. Une accélération due à la bloc canal Ca ne se voit pas, et le plus progressif ralentit en raison du bloc IKr apparaît masqué par l’effet du canal Na.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig1.jpg"> Figure 1 : base représentative Ca vagues à travers une plaque 384 puits. (A) tous les puits à travers la plaque démontrent un taux de battement régulier avec peu de variabilité. Cette image est capturée directement depuis le logiciel de lecteur de plaque. Chaque trace est de 10 s dans la durée. L’intensité de la fluorescence est arbitraires (relatives légères unités provenant de l’échelle de gris de caméra vidéo). (B) ce Blow-Up de 10 s trace indique le faible bruit du signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig2.jpg"> Figure 2 : effets représentatifs d’ioniques cardiaques des canaux calciques. Ces panneaux montrent les courbes concentration-réponse avec (A), le Ca sélective channel blocker amlodipine, (B) la IKr sélectif blocker E-4031, (C) le bloqueur sélectif des canaux Na TTX et (D), le canal non sélectifs bloqueur bépridil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Contractant spontanément syncytiums de cardiomyocytes dérivés de pluripotentes induites par l’homme les cellules souches sont des modèles utiles de la physiologie cardiaque humaine et de la pharmacologie. Nous présentons ici un système de criblage à haut débit afin de quantifier les effets des composés exogènes sur les coups de fréquence, à l’aide d’un colorant fluorescent Ca sensible et un lecteur de plaque multipuits imagerie thermorégulées.

Contractions de syncytiums Cardiomyocyte iPSC-anthropique mesurées avec un colorant Fluorescent Ca sensible dans le contrôle de la température des plaques 384 puits

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pharmacologie de la sécurité cardiaque. Par exemple, un nouveau médicament humain risque-t-il de modifier le rythme cardiaque normal? Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut évaluer un grand nombre de composés rapidement et à un coût modéré.Camille Forny, associée de recherche dans mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour se préparer à la mesure des contractions de syncytie des cardiomyocytes pluripotents dérivés de cellules souches induites par l’homme, ou HIPSCCMs, commencez par placer des CryoTube contenant des cellules congelées dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Transférer toute la suspension décongelée de chaque tube dans un seul tube conique frais de 50 millilitres.Pour récupérer les restes de cellules, lavez chaque tube avec un millilitre de 37 degrés Celsius milieu de placage préchauré et ajoutez ce milieu au tube conique de 50 millilitres contenant des cellules décongelées. Ajouter huit millilitres de placage chaud moyen au tube et mélanger délicatement la suspension. Utilisez la méthode d’exclusion bleue trypan et un hémocytomètre pour compter les cellules vivantes.En ajoutant un milieu de placage chaud, ajustez la concentration à 50 000 cellules par millilitre. Pour répartir les cellules en deux nouvelles plaques de culture cellulaire de 384 puits, ajoutez 25 microlitres à chaque puits, ce qui donnera environ 12 500 cellules par puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans des plaques de 384 puits dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de dioxyde de carbone pendant un total de trois à quatre semaines.Le lendemain, remplacer le milieu de placage par 50 microlitres de milieu d’entretien chaud. Ensuite, remplacez la moitié du milieu d’entretien tous les deux à trois jours. Les jours 7, 14 et 21, remplacez entièrement le milieu.Une fois que les cellules ont été maintenues en culture pendant trois à quatre semaines, elles se sont formées spontanément contractant la syncytie, et l’effet des composés sur ces contractions peut être mesuré. Le jour de l’analyse, au moins deux heures avant que la première plaque cellulaire ne soit placée à l’intérieur du lecteur de plaque pour la mesure, allumez le lecteur et réglez le système de chauffage à 37 degrés Celsius. Pour préparer les plaques composées, réchauffer à température ambiante 40 millilitres de milieu d’entretien complété par 1% de streptocotomycine pénicilline volume par volume.Pendant que le milieu se réchauffe, distribuez les composés d’essai et les commandes en deux plaques composées de 384 puits en ajoutant 1,5 microlitres de solution de stock par puits. Centrifuger les plaques composées à 100 G pendant une minute. Ajouter 37 microlitres de milieu d’entretien à chaque puits et centrifuger les plaques à nouveau à 100 G pendant une minute.Pour préparer le colorant fluorescent, réchauffer 100 millilitres de milieu d’entretien complété par 1% de streptomycine de pénicilline volume par volume dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 10 millilitres du milieu réchauffé au mélange de colorant fluorescent sensible au calcium et de quencher pour les reconstituer comme milieu de fluorescence des stocks. Démarrez le logiciel de lecteur de plaques.Préparez le logiciel à enregistrer un segment de deux minutes d’ondes calciques avec une fréquence d’acquisition d’au moins 10 hertz. Pour faire du milieu de fluorescence pour chaque plaque cellulaire, diluer trois millilitres de milieu de fluorescence de stock avec 12 millilitres de milieu d’entretien chaud avec des antibiotiques. Remplacer 20 microlitres de milieu dans chaque puits de la plaque cellulaire par 30 microlitres de milieu de fluorescence et mélanger en pipetting de haut en bas une fois.Immédiatement après cela, placez la plaque dans un lecteur de plaque afin de laisser les HIPSCCMs s’adapter à la température du lecteur pendant 60 minutes. Ensuite, démarrez le logiciel de lecteur de plaques. Enregistrez un segment de deux minutes d’ondes calciques avec une fréquence d’acquisition d’au moins 10 hertz pour définir le taux de battement de base pour chaque puits.Il est important de s’assurer que la plaque cellulaire n’est pas transférée hors de l’appareil après l’acquisition des données. Avec certaines versions logicielles, vous devez arrêter l’enregistrement avant qu’il ne se termine complètement. Utilisez le robot lecteur de plaque pour pipette cinq microlitres de l’essai et les composés de référence bien-à-bien de la plaque composée dans la plaque cellulaire.Après cela, commencer l’acquisition de données dans le logiciel lecteur de plaque pour enregistrer deux segments de minute d’ondes de calcium à partir de cinq, 15, 30, 45, et 60 minutes après l’ajout composé. Pour commencer l’analyse des données, exportez les données brutes pour chaque période d’enregistrement à partir du logiciel de lecteur de plaques dans les fichiers texte ASCII. Et puis les importer dans un logiciel d’analyse de données.À partir du logiciel d’analyse des données, exportez les fréquences de battement primaires pour chaque période d’enregistrement sous forme de copies de presse-papiers. Extraire la fréquence de battement primaire pour chaque puits et chaque point de temps. Enfin, importez les fréquences de battement dans un logiciel de feuille de calcul par le passé de presse-papiers et continuez l’analyse des données telle que décrite dans le protocole texte.L’enregistrement des ondes calciques à la ligne de base sur une plaque de 384 puits montre que, dans la plupart des cas, tous les puits révèlent un taux de battement régulier avec peu de variabilité dans la plaque. Lorsque des bloqueurs de canaux irionaux cardiaques sont ajoutés, ils affectent le rythme des cardiomyocytes. L’amlodipine, un bloqueur des canaux calciques lents, accélère le rythme à plus de 100% d’une manière dépendante de la concentration jusqu’à un micromolaire.Et au-dessus de cela, amlodipine arrête le passage à tabac. E-4031, un bloqueur des canaux de potassium rectifier rapidement retardés ralentit le rythme d’environ 65 à 70%, d’une manière dépendante de la concentration jusqu’à 10 micromolaires. La tétrodotoxine, un bloqueur des canaux de sodium rapide décélére le rythme d’environ 15% d’une manière dépendante de la concentration jusqu’à un à 30 micromolaires, tandis qu’au-dessus de 30 micromolaires, la tétrodotoxine arrête le passage à tabac dans les cinq premières minutes.Bepridil, un bloqueur mixte de canaux cardiaques de sodium, de calcium et de potassium produit également un effet tout ou rien, suggérant que le bloc de canal de sodium est l’action primaire du bepridil. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’être extrêmement doux lors de pipetting dans la plaque de culture cellulaire. Ces tissus sont très fragiles et facilement endommagés s’ils sont touchés par des pipettes.N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines et des médicaments actifs peut être dangereux, et des précautions telles que le port de gants de sécurité et de lunettes doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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