Rigide incrustation du fixe et tachée, ensemble, échelle millimétrique spécimens pour histologie exempt de Section 3D de Micro-Computed Tomography
17 octobre 2018
Nous avons mis au point des protocoles et conçu un appareil personnalisé pour permettre l’incorporation de spécimens à l’échelle du millimètre. Nous présentons des méthodes de préparation d’échantillon en mettant l’accent sur l’incorporation dans la résine acrylique et de polyimide tube pour atteindre l’immobilisation rigide et le stockage à long terme des échantillons pour l’interrogatoire de morphologie architecture et cellules de tissus par micro-CT.
Cette méthode vous permettra de générer des images histologiques tridimensionnelles à partir de petits échantillons à l’échelle millimétrique, y compris de petits organismes modèles. Le principal avantage de cette technique est que les échantillons intégrés sont très stables, vous permettant de garder les échantillons pendant de longues périodes de temps et de les imager plusieurs fois, par exemple avec différentes méthodes d’imagerie au fil des ans. La sortie de cette méthode sera très utile pour la phénomie du système de modèle à haut débit, la toxicologie, et potentiellement même le diagnostic des tissus humains.
En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce que les échantillons sont relativement petits et difficiles à orienter ou à manœuvrer. La démonstration visuelle est essentielle parce que l’attention est nécessaire pour éviter les dommages à l’échantillon. Pour les poissons zèbres juvéniles ou plus âgés, les affamer pendant au moins 24 heures afin de réduire le volume de contenu intestinal avant la fixation.
Déplacez la formaline tampon neutre de 10 % ou NBF et le 2x Tricaine-S pré-refroidi à quatre degrés Celsius sur la glace. Doublez le volume d’eau de poisson avec le 2x MS-222 réfrigéré pour une euthanasie rapide et humaine. Soixante secondes après que les poissons ont cessé de bouger, après l’euthanasie sans cruauté, placez le poisson dans la solution réfrigérée de 10% NBF dans des flacons de verre à fond plat à température ambiante, et fixez-les pendant la nuit.
Le deuxième jour, rincer les spécimens de poisson fixes trois fois en 1x PBS pH 7,4 pendant 10 minutes chacun. Après le lavage, submerger les échantillons dans 35% d’éthanol et incuber pendant 20 minutes à température ambiante avec une agitation douce. Répétez ensuite cette étape avec 50% d’éthanol.
Incuber les échantillons dans de l’acide phosphotungsten fraîchement préparé ou de la solution PTA pendant la nuit à température ambiante avec une légère agitation pour les tacher. Commencez la troisième journée en préparant un mélange volume par volume de 100 % d’éthanol et de résine acrylique blanche LR. Rincer les échantillons trois fois dans 70% d’éthanol pendant 10 minutes chacun, puis incuber les échantillons dans 90% d’éthanol à température ambiante pendant 30 minutes avec une agitation douce.
Répétez l’incubation dans les mêmes conditions, mais 95% d’éthanol, puis deux fois de plus avec 100% d’éthanol. À la fin, submergez les échantillons dans un mélange d’éthanol et de résine acrylique blanc LR, et incubez à température ambiante pendant la nuit avec une légère agitation. Le quatrième jour, retirer le mélange du flacon et ajouter de la résine blanche 100% LR pour submerger les échantillons.
Incuber pendant deux heures à température ambiante avec une légère agitation. Après deux heures, remplacer la résine par de la résine blanche fraîche 100% LR, et incuber pendant une heure à température ambiante avec une légère agitation. Pour assembler l’appareil d’intégration, utilisez le tube poly MI d’un diamètre d’au moins 0,1 millimètre supérieur au diamètre de l’échantillon et coupez-le à une longueur standard de 30 millimètres.
Attachez ensuite une tête de micro-tuyau P1000 à l’extrémité blanche de l’adaptateur d’intégration et insérez le tube poly MI à son extrémité étroite. Une fois que les échantillons ont incubé pendant une heure en résine blanche 100% LR, transférez-les sur un petit bateau de peseur et submergez-les complètement en résine blanche 100% LR. Visez le tube de l’appareil d’intégration à l’extrémité large de l’échantillon fixe, ou vers la tête, et pipet le spécimen lentement dans le tube.
Placez l’échantillon au milieu du tube, en vous assurant que le tube au-dessus et au-dessous du spécimen est rempli de résine. Immédiatement après, pour sceller l’extrémité ouverte du tube, aplatissez un morceau d’argile douce à base d’huile dans une feuille d’environ un millimètre d’épaisseur et stabilisez le tube entre l’index et les doigts du milieu. Puis appuyez lentement sur l’argile contre l’extrémité du tube avec le pouce, et enlever tout excès d’argile.
Retirez l’appareil d’intégration de la tête du micro-tuyau. Retirez le tube par rotation douce. Tout en tenant un doigt contre l’extrémité scellée pour empêcher l’éjection de l’argile, sceller l’autre extrémité en poussant lentement l’extrémité non scellée du tube dans l’argile.
Placez le tube horizontalement sur une grille à tube et laissez la résine polymériser pendant 24 heures à 65 degrés Celsius dans le four. À la fin du lendemain, prélevez les échantillons pour l’acquisition d’images. Une larve de poisson zèbre intégrée avec succès n’a pas de bulles d’air piégées.
Si l’air est emprisonné pendant le processus d’intégration, il peut se déplacer vers le spécimen si l’échantillon n’est pas placé horizontalement pendant la polymérisation, ce qui peut dégrader la qualité de l’image. Ce protocole a réussi à intégrer divers organismes modèles. Comme le poisson zèbre, la drosophile, la daphnie et l’embryon de souris.
L’intégration réussie peut être montrée avec des rendus 3D reconstruits, photographiés par balayage de micro-CT pour zebrafish, Daphnia, et Drosophila. La résine d’intégration peut être vue dans tous les balayages à l’extérieur de l’échantillon, mais n’interfère pas avec l’échantillon lui-même. Ces spécimens peuvent être stockés pendant une longue période de temps et réutilisés pour plusieurs séances d’imagerie, comme le montre la larve de poisson zèbre photographiée en 2011.
Et puis à nouveau en 2013. Les caractéristiques anatomiques sont conservées après le stockage, comme on le voit sur les gros plan des muscles des deux scans. En outre, les profils d’intensité normalisés à leurs moyennes correspondantes le long des lignes segmentées, montre spatialement correspondant pics locaux dans les deux scans.
Les valeurs moyennes d’intensité pour certaines régions des deux scans ont été divisées par une moyenne pour l’arrière-plan et utilisées pour générer des rapports signal-bruit, ce qui correspondait bien entre les balayages. Tout en essayant cette méthode, il est important de travailler doucement pour éviter les dommages à l’échantillon et de travailler avec soin pour empêcher l’introduction de bulles d’air. Suivant cette procédure, d’autres méthodes telles que l’histologie ou la microscopie électronique peuvent être utilisées afin d’étudier les modèles d’expression des protéines, ou d’obtenir une résolution plus élevée des régions d’intérêt en 2D.
Nous espérons que cette publication vous aidera à accéder à la puissance du micro-CT tissulaire haute résolution.
Aperçu
Cet article présente une méthode d'inclusion d'échantillons de taille millimétrique, en mettant l'accent sur l'utilisation de résine acrylique et de tubulure en polyimide. Cette technique permet un entreposage à long terme et plusieurs séances d'imagerie, facilitant l'étude de l'architecture tissulaire et de la morphologie cellulaire par micro-tomographie computed (micro-CT).
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Histologie
Contexte
- Les techniques d'inclusion sont essentielles pour préserver de petits échantillons biologiques.
- La stabilité des échantillons inclus permet un stockage prolongé et des imageries répétées.
- L'imagerie micro-CT fournit des images histologiques tridimensionnelles détaillées.
- Les difficultés courantes incluent l'orientation de l'échantillon et l'évitement des dommages durant la préparation.
Objectif de l'étude
- Développer des protocoles pour l'inclusion de petits échantillons destinés à l'imagerie.
- Améliorer la stabilité et la maniabilité des échantillons dans le temps.
- Démontrer l'efficacité de la méthode sur divers organismes modèles.
Méthodes utilisées
- Préparation des échantillons à l'aide de formol tamponné neutre et de Tricaine-S.
- Inclusion des échantillons dans une résine acrylique LR White à l'aide de tubes en polyimide.
- Polymérisation de la résine à des températures contrôlées.
- Imagerie micro-CT pour la reconstruction tridimensionnelle des échantillons.
Résultats principaux
- Intégration réussie d'échantillons de zebrafish, de Drosophila et de Daphnia.
- Obtention d'images de haute qualité sans bulles d'air affectant les échantillons.
- Les échantillons ont conservé leurs caractéristiques anatomiques pendant de longues périodes de stockage.
- La méthode permet plusieurs séances d'imagerie avec des résultats reproductibles.
Conclusions
- La méthode d'incorporation développée est efficace pour les petits échantillons biologiques.
- Le stockage à long terme et la réutilisabilité des échantillons améliorent les capacités de recherche.
- Ce protocole peut faciliter des études ultérieures en histologie et en microscopie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'histologie 3D sans sectionnement par micro-CT, rendue possible par l'inclusion rigide d'échantillons millimétriques fixés et colorés, répond à un besoin critique d'analyse tissulaire volumique à haute résolution dans la recherche exploratoire et préclinique. Cette approche préserve l'intégrité anatomique et permet une imagerie quantitative répétée, soutenant un criblage phénotypique robuste et une détection fiable des mécanismes. La méthode améliore la confiance prédictive et l'efficacité des ressources dans l'ensemble des flux de travail utilisant des modèles biologiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une analyse complète de l'architecture tissulaire en 3D pour la validation fonctionnelle des cibles.
- Prend en charge la réduction des risques mécanistiques en préservant les caractéristiques cellulaires et subcellulaires pour des interrogations répétées.
- Facilite les études fondées sur des hypothèses chez des organismes modèles pertinents pour les voies de la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Permet d'obtenir des échantillons stables et réutilisables pour des criblages phénotypiques à haut débit et des protocoles en toxicologie.
- Fournit des sorties d'imagerie quantitatives et reproductibles pour la standardisation des tests.
- Assure une compatibilité d'imagerie entre différentes plates-formes, favorisant une flexibilité analytique en aval.
Recherche translationnelle et préclinique
- Préserve la fidélité anatomique pour les études longitudinales et l'alignement des biomarqueurs translationnels.
- Permet la continuité du stade de découverte à la validation préclinique en facilitant la réanalyse des échantillons sur plusieurs années.
- Réduit la variabilité biologique et les risques lors de l'évaluation des modèles précliniques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode d'encapsulation et d'imagerie s'intègre à l'interface entre la découverte précoce, le criblage phénotypique et la validation de modèles précliniques, offrant une plateforme réutilisable pour l'interrogation de tissus en 3D.
- Découverte en biologie : Permet de tester l'hypothèse nulle et de clarifier les voies biologiques en rendant possible l’imagerie 3D quantitative répétée de spécimens préservés.
- Écrantage : Fournit des échantillons stables prêts à être utilisés dans des tests, adaptés à une évaluation phénotypique et toxicologique à grande échelle.
- Analyse : Fournit des profils d’intensité quantitatifs et des mesures du rapport signal sur bruit permettant des comparaisons statistiques robustes.
- Recherche translationnelle : Préserve les échantillons afin d’effectuer, sur plusieurs années et entre différentes études, des analyses de biomarqueurs et d’anatomie.
- Réutilisation institutionnelle : Crée une ressource standardisée et à long terme pour l’imagerie multimodale et les études rétrospectives.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études basées sur les tissus.
- Valeur opérationnelle : Normalise la préparation des échantillons, améliore la reproductibilité et permet des flux de travail d'imagerie évolutifs.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'aller/arrêt et l'efficacité du capital en préservant les échantillons de grande valeur pour des analyses répétées.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustées au risque, des actifs de découverte et précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie micro-CT et une manipulation précise des échantillons afin d'éviter les dommages et l'introduction de bulles d'air.
- Suppose l'accès à des matériaux d'inclusion, à des tubes en polyimide et à une infrastructure de polymérisation contrôlée en température.
- Exige une standardisation entre équipes pour assurer une orientation des échantillons et une qualité d'imagerie constantes.
- Adaptable à divers organismes modèles de petite taille et types de tissus, dans des limites de dimensions spécifiées.
- Une attention particulière aux étapes du protocole est essentielle pour préserver l'intégrité des échantillons et la fidélité de l'imagerie.
