Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la toxicologie germinale humaine, telles que la façon dont les dommages dans le génome des cellules germinales primordiales humaines sont créés ou réparés. Le principal avantage de cette technique est que les cellules germinales primordiales humaines peuvent être générées en deux semaines à partir des cellules iPS pluripotency amorcées hébergeant le fond génétique de prédisposition de la maladie. Les implications de cette technique s’étendent à la prévention de l’affaiblissement génomique dans les cellules germinales humaines, parce que notre modèle de culture cellulaire peut nous aider à réduire la toxicité de germline d’un médicament thérapeutique.

Pour commencer avec la génération de cellules humaines primordiales comme les cellules germinales, ou PGCLCs humains, préparer des plaques extracellulaires enrobées de protéines matricielles et la suspension cellulaire des iPSCs humains, tel que décrit dans le protocole de texte. Préparer une suspension à cellule unique des iPSCs humains pluripotences amorcés dans le milieu mTeSR1 contenant l’inhibiteur de la kinase Rho Y-27632. Ajustez soigneusement la densité cellulaire à 100 000 cellules par millilitre.

Inoculer deux millilitres de suspension cellulaire des iPSCs humains amorcés dans chaque puits de la protéine matricielle extracellulaire enduit des plaques de six puits, en s’assurant que les cellules sont réparties uniformément en secouant les plaques verticalement et horizontalement. Incuber les plaques dans un incubateur de CO2 à trois gaz à 37 degrés Celsius. Il est très important d’inoculer exactement 200 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de six puits.

Le comptage précis des cellules est essentiel. Après l’achèvement de la conversion transitoire à la pluripotence naïve, les cellules devraient regarder trop confluent, ce qui est normal. Le moment exact du changement moyen est important pour atteindre des PGCLCs humains élevés et une reproductibilité expérimentale.

La densité de la culture hiPSC 4i est élevée dans ces conditions, et on s’attend à ce que la cellule devienne confluente aux 48 à 72 heures après l’inoculation. 24 heures après l’inoculation, changer le milieu avec deux millilitres par puits de mTeSR1 moyen sans Y27632. Commencez la conversion des iPSCs humains d’état de pluripotence amorcés en cellules souches pluripotentes naïves de 4i, en réchauffant 50 millilitres de milieu complet de 4i dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

À 48 et 72 heures après l’inoculation, retirer les plaques de l’incubateur et changer le milieu avec 2 millilitres par puits de 4i milieu complet. Centrifugez la plaque de microwell enduite de détergent à 1000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Inspecter les puits au microscope inversé pour s’assurer de l’absence de bulles d’air.

Rincez les puits tels que décrits dans le protocole textuel et répétez la centrifugation. Ajouter 4i milieu complet aux puits rincés. Centrifugez la plaque à 1000 g pendant cinq minutes à température ambiante, et inspectez à nouveau les puits.

Pour inoculer 4i iPSCs humains dans la plaque de microwell, préparez la suspension humaine de cellules d’iPSC comme décrit dans le protocole. Filtrer cette suspension cellulaire à l’aide d’une passoire cellulaire de taille pore de 40 micromètres pour enlever les agrégats cellulaires. Lavez la passoire avec un millilitre de milieu complet préchauffé 4i trois fois pour recueillir toutes les cellules de la passoire, et comptez les cellules avec un compteur de culture.

Ensuite, diluer cette suspension cellulaire unique de 4i iPSCs humains naïfs à 27 à 32,4 millions de cellules dans 9 millilitres préchauffé 4i milieu complet contenant Y27632. Retirez la plaque microwell préparée précédemment contenant 1 millilitre de milieu complet de 4i par puits d’un incubateur à trois gaz. Inoculer 1 millilitre de suspension iPSC humaine naïve de 4i dans chaque puits, pour atteindre une concentration de 3,0 à 3,6 millions de cellules par puits.

Pipette doucement pour répartir uniformément les cellules. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 3 minutes à température ambiante. Placer la plaque dans un incubateur de CO2 à trois gaz, en s’assurant de ne pas déranger les cellules granulées dans des microwells, et d’incuber pendant 24 à 30 heures, parce qu’une incubation nocturne est insuffisante pour la formation de corps embryonnaires serrés ou d’ER.

Avant-guerre 5 millilitres de milieu basal PGCLC humain et 20 millilitres de PGCLC humain milieu complet pendant au moins cinq minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius Placer soigneusement une passoire cellulaire de taille pore de 40 micromètres à l’envers sur un tube conique polypropylène de 50 millilitres. Pour détacher les ER des microwells, pipette doucement chaque puits de la plaque. Pour éliminer les cellules non incorporées dans les ER, filtrez le contenu de tous les puits à travers la passoire cellulaire.

Lavez doucement les OG conservés sur la membrane de la passoire cellulaire avec 1 millilitre de milieu basal PGCLC humain préchauffé, et répétez le lavage cinq fois. Placez un tube conique frais de 50 millilitres sur la passoire cellulaire, de sorte que la passoire cellulaire est maintenant positionnée côté droit vers le haut dans le nouveau tube. Inversez rapidement la passoire cellulaire avec le nouveau tube, qui positionnera les ER sous la membrane de la passoire cellulaire.

Ajouter 18 millilitres de PGCLC humain préchauffé à la membrane de la passoire cellulaire pour recueillir les ER dans le tube conique. Ensuite, plaque 3 millilitres par puits de la suspension des È dans les puits d’une plaque à faible fixation de six puits. Placez la plaque sur un rocker en mouvement de scie à scie dans un incubateur à trois gaz, et réglez soigneusement la vitesse de basculement à environ 20 tours par minute.

Le septième au 13e jour de l’expérience, préparez fraîchement 20 millilitres de PGCLC humain milieu complet chaque jour. Retirez la plaque du rocker, ce qui fera couler les EB au fond des puits. Retirer l’ancien milieu sans sécher les ER de sorte qu’environ 0,2 millilitres de vieux milieu reste dans chaque puits.

Ajouter 3 millilitres par puits de pgclc humain frais milieu complet, après avoir enlevé l’ancien milieu tous les jours. Pour identifier les PGCLCs humains comme cellules oct4-positives, récoltez les EBs à un tube de microcentrifugeuse à faible liaison de 1,5 millilitre. Laissez les ER couler vers le bas à température ambiante et jetez le milieu.

Rincer les ER avec du froid glacial 1X PBS. Après avoir enlevé le PBS, incuber les È dans 1 millilitre de froid glacé 1% de poids en volume d’azide de sodium dans PBS sur la glace pendant cinq minutes. Laissez les EBs couler au fond à température ambiante.

Après avoir jeté le surnatant, rincer les ER avec du PBS glacé. Décongeler 200 microlitres de protéines matricielles extracellulaires sur la glace. Ajouter la protéine au tube contenant des ER.

Laissez le tube à température ambiante pendant environ 10 minutes, jusqu’à ce que le gel soit solidifié et que les EB soient intégrés. Pour fixer les EBs, ajouter 1 millilitre de formaldéhyde de 4% dans PBS au tube, et incuber à température ambiante pendant 15 minutes avec un basculement doux. Après cela, jetez le formaldéhyde et rincez les ER une fois avec du PBS glacé.

Ajouter 1 millilitre de 70 % d’éthanol. Conserver à 70 % d’éthanol à 4 degrés Celsius jusqu’à une semaine ou procéder au traitement avec un protocole FFPE standard. La densité cellulaire et même la distribution des cellules sur chaque puits sont critiques.

Les CISP humains en 2 millilitres de Y27632 complété moyen par puits d’une plaque de six puits, atteignent 20 à 30% confluency après 24 heures. Après une culture supplémentaire de 24 heures dans le milieu mTeSR1, en l’absence de Y27632, les cellules se sont agrégées et ont formé des colonies, occupant environ 30% de la zone de croissance. Après 24 heures de culture dans le milieu de reprogrammation 4i, les cellules ont atteint la confluence.

Après 24 heures supplémentaires de culture dans le milieu 4i, les cellules sont devenues plus densément emballées. Après une incubation de 24 heures dans des microwells dans le milieu de reprogrammation de 4i, les cellules ont formé des EBs avec leur contour circulaire visible à 24 à 30 heures après inoculation. Les È maintenus dans le milieu humain de PGCLC, dans des conditions nonadherent de basculement, ont maintenu leur forme sphérique sans agrégation après 24 heures.

Après 192 heures, les ER étaient plus grands, maintenant la même morphologie. Après 5 jours, les cellules ont émergé en tant qu’OCT4 exprimant des cellules à la surface des EBs, augmentant leur nombre après 8 jours. Les cellules de la suspension à cellule unique des PGCLCs humains ont été enrichies en cellules CD38-positives par FACS.

Les cellules qui n’expriment pas le CD38 étaient un contrôle négatif. Pour éviter la contamination, les portes FACS CD38-positives et CD38-négatives ont été séparées par une large marge. Tout en essayant cette procédure, il est important de suivre le comptage exact des cellules et les calendriers de changement moyen.

Omettre le changement moyen ne sera-ce qu’un seul jour, ou réduire le volume de ce milieu à n’importe quelle étape, peut causer la mort massive de cellules. La vitesse de la culture de basculement des corps embryoïdes doit être soigneusement optimisée.