Name: Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Découvrez la génération de cellules germinales primordiales humaines à partir de cellules iPSC en 13 jours. Cette méthode permet d'étudier la toxicité germinale et l'intégrité génomique in vitro.

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Nous reconnaissons Shiomi Yawata et Chie Owa pour l’assistance technique pendant les études initiales. Cette étude a été financée par des subventions NIEHS/NIH R01 ES023316 et R21ES024861 de TS et de subvention de l’Institut de recherche médicale de bord (FAMRI) à Amina.

<ol><li>Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+primordial+germ+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), Cambridge, England. 245-252 (2014).</li>
<li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375(2012).</li>
<li>De Felici, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-0-85729-826-3_2">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li>
<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li>
<li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li>
<li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li>
<li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li>
<li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li>
<li>Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li>
<li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li>
<li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li>
<li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), Clifton, N.J. 217-226 (2017).</li>
<li>Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li>
<li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li>
<li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li>
<li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li>
<li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li>
<li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Mek1%2F2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li>
<li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erasure+of+DNA+methylation%2C+genomic+imprints%2C+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li>
<li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Fabrication robuste de hPGCLCs en utilisant le protocole décrit ici a été confirmée avec trois clones indépendants de CISP humaine avec le caryotype diploïde normale10. Ces clones iPSC provenaient de la peau cutanée néonatale humaine même fibroblaste cellule culture10. Ils seront fournis par les auteurs de cet article aux enquêteurs sur demande et sous l’accord de transfert de matériel approprié et arrangement de cellules humaines vivantes congelés d’expédition. On ignore actuellement si le caryotype normal est nécessaire pour la production de hPGCLC robuste en utilisant notre protocole ou celles rapportées par d’autres laboratoires.
Des études récentes ont montré que la production de hPGCLCs de hiPSCs11 ou ESCs14 en utilisant un protocole décrit par groupe de Saitou de l’Université de Kyoto8 dépend de l’expression de EOMESODERMIN, un facteur de transcription T-box requis pour induction de SOX17. SOX17 semble fonctionner comme la lignée de maître déterminer le facteur de transcription dans la différenciation de cellules souches pluripotentes humaines6germinale. EOMESODERMIN est codée par le gène LAEVIS , CRISPR/Cas9 knockout de LAEVIS causé une absence presque totale d’induction SOX17 dans la hPGCLC produisant des condition11et expression d’autres gènes a suivi le même schéma de la Cellules nulles SOX17 knockout. La surexpression de la EOMESODERMIN d’un vecteur inductible dans l' LAEVIS-cellules null knockout durant la culture induction hPGCLC efficacement secourus le robuste hPGCLC production ainsi que l’induction de gènes, cellules germinales, y compris SOX17. En revanche, induite par la surexpression SOX17 secouru également la production de PGCLC robuste mais sans provoquer de LAEVIS. Ainsi, EOMESODERMIN est un inducteur critique en amont de SOX17, et cela semble le rôle le plus important simple de EOMESODERMIN dans hPGCLC induction de cellules souches pluripotentes humaines. Notre protocole induit SOX17 hiPSCs10, mais sa dépendance sur l’induction EOMESODERMINE vous attend à déterminer.
Ce protocole convertit apprêté-pluripotence CISP humaine maintenus dans le milieu mTeSR1 pour ERK-indépendant naïve pluripotence pendant 96 heures dans le 4i reprogrammation moyenne6, qui est une mis à jour le naïf des cellules souches humaines medium (NHSM)5. Nos tentatives pour générer des hPGCLCs commençant par les mêmes clones humains iPSC, mais conservés dans d’autres milieux de croissance iPSC humain disponible dans le commerce avant la culture dans la 4i reprogrammation moyen a donné lieu à des degrés divers des rendements inférieurs à hPGCLC. Bien que si l’adaptation à long terme dans d’autres médias améliore la production de hPGCLC ou ne reste pas être déterminée dans de futures études, cette observation suggère que l’état exact de la pluripotence apprêtée de CISP humaine avant la 4i reprogrammation significativement impact formation EB dans le milieu de 4i et différenciation EB dans un milieu hPGCLC.
Production de hPGCLCs de hiPSCs selon notre protocole est robuste et hautement reproductible, en partie à cause de l’utilisation des plaques microwell qui permettent la production efficace d’un grand nombre d’EBs (~ 8 000 EBs par lot) avec une taille unique (3 000 hiPSCs par EB). Le nombre d’EBs facilement produites en un seul lot d’expérience, en utilisant notre protocole peut être beaucoup plus grand que les méthodes utilisant des puits de culture cellulaire U-bas régulières. Production d’un grand nombre de même taille EBs uniformément parsemé de hPGCLCs peut-être offrir des possibilités uniques de haut débit projections chimiques à identifier petit poids moléculaire activateurs ou inhibiteurs de spécification du PGC ou leur caractéristiques biologiques telles que la reprogrammation épigénétique. Ces EBs peut aussi être utile pour les évaluations toxicologiques d’un grand nombre de substances toxiques de la cellule germinale, en incluant non seulement les polluants environnementaux mais aussi cliniquement les médicaments tels que les agents chimiothérapeutiques.
Les facteurs critiques de la production robuste et reproductible de hPGCLCs en utilisant le protocole présenté comprennent (i) l’utilisation de saine hiPSCs maintenu en mTeSR1 sur la protéine de la matrice extracellulaire, (ii) à inoculer le nombre exact de cellules tel que spécifié et strictement Suivez les timings de changement médiatique et sous-culture, (iii) pour sélectionner la bonne beaucoup de BMP4 recombinante humaine et (iv) afin de minimiser les dommages physiques de EBs pendant le balancement de la culture. C’est notre expérience qui le meilleur lot de réactif BMP4 travaillait à 100 concentration ng/mL alors que l’autre lot de réactifs BMP4 requis 2 X ou plus doses. En revanche, rendement de hPGCLCs production en utilisant le meilleur lot de BMP4 plutôt diminué des doses élevées de BMP4 (p. ex. 200 ng/mL). Nous vous recommandons de tester plusieurs différents lots de recombinant humain BMP4 réactifs provenant de plusieurs fournisseurs pour leur performance en soutenant hPGCLC génération et pour garantir une grande quantité du meilleur lot.
Une particularité de notre protocole de hPGCLC est que hPGCLCs sont localisées sur la couche de surface extérieure de l’EBs10 (Figure 8), tandis que les autres protocoles peuvent générer des hPGCLCs au milieu de la cellule agrégats6,8. Corps embryoïdes tendent à former plusieurs couches distinctes telles que surface, enveloppe extérieure, coque intérieure et noyau, et les régions de noyau central sont souvent nécrotiques en raison de la quantité limitée de nutriments, oxygène, ainsi que pro-survivant des facteurs de croissance fournies forme la culture medium de diffusion20. Localisation de hPGCLCs sur la surface de l’EBs sans restrictions possibles en raison de la faible diffusion vers le centre de l’EBs peut être bénéfique pour l’exposition directe, et dose-temporisation, de hPGCLCs aux drogues ou de substances toxiques pour pharmacologique ou études toxicologiques.
Alors que les souris PGCLCs voir la robuste génome ADN déméthylation impliquant l’impression contrôler des régions au moins en partie7,19,20, le degré de déméthylation Adng global en hPGCLCs semble plus faible que la souris PGCLCS ou PGC6,7. Transcriptomal profils suggèrent que hPGCLCs peut ressembler à un stade plus précoce du PGC embryonnaires de souris PGCLCs10. Il a été rapporté que culture prolongée d’EBs dans des conditions de production de hPGCLC a provoqué un degré accru d’Adng déméthylation7; Toutefois, si une longue période de culture de hPGCLCs dans EBs ou sous forme de cellules isolées peut atteindre des stades plus avancés de la différenciation de la lignée germinale doit être déterminé par les études à venir.

Les cellules germinales primordiales (PGC) sont des précurseurs communs de toutes les cellules de la lignée germinale chez les deux sexes. La plupart de nos connaissances sur le développement de PGC dans des embryons de mammifères a été obtenue grâce à l’étude des souris de laboratoire1,2. À jour embryonnaire 6,0 à 6,5 des embryons de souris, 6 ou même de petits nombres de précurseurs PGC sont situés dans l’épiblaste et une population fondatrice de ~ 40 que PGC est induites d’eux d’une manière dépendante de protéines morphogénétiques osseuses Bmp2 et Bmp4 sécrétée par adjacentes cellules. Les premiers PGC humaine jusqu'à présent identifié chez les embryons était sur le mur endodermique du sac vitellin à vers la fin de la troisième semaine de gestation3. Parce que c’est au même endroit que la migration PGC est observées chez des embryons de souris, il est probable que le PGC humains observés était sur le chemin de migration, mais pas la population fondatrice. Toutefois, des études remontant des stades antérieurs du PGC ou PGC précurseurs sur les embryons humains ont disparu.
Accès au PGC embryonnaire humaine est difficile en raison d’obstacles techniques et éthiques. Pour surmonter ces obstacles, modèles de culture de cellules PGC ont été récemment générées à partir des cellules souches pluripotentes humaines (PSC). La pluripotence est la capacité cellulaire à se différencier en la lignée germinale et trois couches de germe embryonnaires4. Alors que la PSC humaine maintenue dans le milieu de mTeSR1 (un milieu prêt à l’emploi, disponible dans le commerce formulé pour l’entretien de PSC humaine dans l’état de pluripotence apprêté) sur plats revêtus de la protéine de la matrice extracellulaire ont apprêté-état pluripotence 4, en 2013, laboratoire de Jacob Hanna a montré que les cellules de pluripotence apprêté peuvent être convertis en un état de pluripotence naïve en exposant au milieu de cellules souches humaines naïves (NHSM) contenant des inhibiteurs chimiques aux protéines kinases ERK1/2 GSK3, JNK, ROCK, PKC, et p38 MAPK ainsi que les facteurs de croissance FRV, TGF, bFGF5. De la PSC humaine naïve-pluripotence, en 2015, un groupe de recherche dirigé par Hanna et Azim Surani a accompli la première production robuste de cellules humaines de PGC-Like (hPGCLCs) du PSC6. Plus tard, plusieurs autres laboratoires, y compris la nôtre, a signalé de génération de hPGCLCs de PSC en utilisant légèrement différents protocoles7,8,9,10. Notre étude a prouvé que hPGCLCs générés à l’aide de différents protocoles (qui sont résumées dans le tableau S1 de notre étude précédemment publiée10) sont transcriptomally semblable à l’autre10. Éléments de preuve disponibles soutient la ressemblance des humains PGCLCs au début des PGC embryonnaires humaines avant l’effacement épigénétique global7 et/ou migration chimiotactique10.
Études de souris embryonnaires PGC, souris PGCLCs et PGCLCs humains (mais avec seulement un accès très limité aux PGC humaine) ont révélé que les mécanismes moléculaires de la spécification du PGC diffèrent sensiblement entre les souris et les humains1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,,17. Par exemple, Prdm14 joue un rôle crucial dans la spécification de PGC dans des embryons de souris, mais son rôle dans la spécification du PGC humaine semble limitée1,15. En revanche, l’induction de SOX17 par EOMESODERMIN est essentielle pour PGC spécification6,11,14, alors que ces facteurs de transcription semblent dispensables pour souris PGC spécification15. Ces réalisations initiales des études utilisant la hPGCLCs fortement confirment l’importance de ce modèle de culture cellulaire comme substitut du PGC embryonnaires humaines.
Des études publiées récemment, impliquant l’évaluation de séquençage en profondeur de notre laboratoire d’ADN copie numéro l’analyse génomique, ont montré que maintenance prolongée de PSC dans l’état de pluripotence naïf augmente considérablement le risque d’une instabilité chromosomique et anomalies structurales. Ce phénomène a été observé avec les deux souris18 et humaine19 PSC. Le protocole initial de production de hPGCLC rapporté par Hanna/Surani a été développé pour PSC humaine maintenus dans le milieu de la pluripotence 4i naïf au moins 2 semaines,6. Afin de préserver le caryotype diploïde normal de la PSC et PGCLCs, nous avons développé un protocole modifié dans lequel PSC humains est exposés au milieu de 4i pour seulement 72 heures10, qui est présenté dans cet article. CISP humaine (hiPSCs) est maintenues en vertu de l’état de pluripotence apprêtée. Immédiatement avant la formation de EB, les cellules sont incubées dans le milieu de reprogrammation de naïf de 4i (un milieu modifié de NHSM) pendant 48 heures. Les cellules sont alors dissociées et emballés dans des micropuits de forme EBs pour 24 heures supplémentaires dans le milieu de 4i. EBs sont maintenus dans un milieu d’induction hPGCLC contenant une forte concentration de recombinant BMP4 humaine condition bascule pour la culture de la non-pièce jointe jusqu'à 8 jours pour obtenir le rendement maximal de hPGCLCs. Après la culture EB 8 jours, hPGCLCs peuvent être isolés des cellules dissociées de EB de FACS, en tant que cellules CD38 + jusqu'à environ 40 % en FACS-sortable suspension monocellulaire. Alors que l’autre publié méthodes7,8,9, y compris le protocole initial avant nos modifications6, génèrent habituellement de hPGCLCs dans les agrégats de cellules spontanément formé sans spécifiques localisation, hPGCLC produite par notre protocole sont observées à la surface du corps embryoïdes (EBs).

<table><tbody><tr><td><forte>Pluripotence amorcée culture hiPSC</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Aliquot Matrigel au volume indiqué par le fabricant (environ 200 &mu ; L). Utilisez des tubes froids. Conserver à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21041-025</td><td>Stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Reconstituer en ajoutant un supplément 5X au milieu basal. Le milieu reconstitué peut être stocké à 4 &deg ; C jusqu’à 4 semaines sans affecter les performances de culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon</td><td>1683</td><td>Dilué 5 mg Y27632 (MW 320.26) avec 312.2 &mu ; L d’eau pour préparer 50 mM de solution mère Y27632. Stériliser par filtration (0,22 &mu ; m). Aliquote 20 &mu ; L/tube x 15 tubes et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07930</td><td>Magasin à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Technologies cellulaires innovantes</td><td>AT104-500</td><td>Enzyme de dissociation cellulaire ; aliquote 40 mL/tube x 12 tubes et stockée à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4i culture hiPSC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286101</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Aliquote 40 mL/tube x 12 tubes et conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine-glutamine (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Insuline du pancréas bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882-100MG</td><td>Ajouter 0,1 mL d’acide acétique glacial à 10 mL d’eau. Stériliser par filtration (0,22 um). Diluer 100 mg de poudre lyophilisée d’insuline avec 10 mL d’eau froide acidifiée pour obtenir une solution mère de 10 mg/mL. Aliquote 650 &mu ; L/tube x 15 tubes et stocker à -80 &deg ;C.</td></tr><tr><td>humain LIF</td><td>PeproTech</td><td>300-05</td><td>Reconstituer 250 &mu ; g LIF humain avec 250 &mu ; L d’eau. Ajouter 750 &mu ; L de 0,1 % d’albumine sérique bovine dans PBS(-) pour faire 250 &mu ; g/mL de solution mère de LIF humaine. L’activité spécifique de ce produit est de >10 000 unités/&mu ;g. Aliquote 40 ul/tube x 25 tubes et stocker à -80 &deg ;C.</td></tr><tr><td>FGF2 humain</td><td>R& D Systems</td><td>4114-TC</td><td>Reconstituer 1 mg de FGF2 humain avec 5 mL de PBS(-) pour obtenir 200 &mu ; g/mL de solution mère humaine de FGF2. Aliquote 100 &mu ; L/tube x 50 tubes et stocker à -80 &deg ;C.</td></tr><tr><td>TGF-&bêta humain ; 1</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>Reconstitite 50 &mu ; g avec 50 &mu ; L de 10 mM d’acide citrique (pH 3,0). Ajouter 150 &mu ; L de 0,1 % d’albumine sérique bovine dans PBS(-) pour faire 250 &mu ; g/mL de TGF-&bêta humain ; 1 solution mère. Aliquote 4 &mu ; L/tube x 50 tubes et stocker à -80 &deg ;C.</td></tr><tr>Milieu <td></td><td></td><td>basal 4i</td><td>Mélanger les réactifs suivants pour obtenir un milieu basal 4i 500 mL de KnockOut DMEM 100 mL de KnockOut Serum Replacement 6 mL de Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100x) 6 mL de solution d’acides aminés non essentiels MEM (100x) 650 &micro ; L de 10 mg/mL d’insuline du pancréas bovin 40 & micro ; L de 250 & micro ; g/mL humain LIF 20 & micro ; l de 200 &micro ; g/ml humain FGF2 4 & micro ; l de 250 &micro ; g/ml de TGF-&bêta humain ; 1 Aliquotes 40 ml/tube et conserver à -80 °C.</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>Reconstitue 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) avec 1791 &mu ; L DMSO pour faire 30 mM CHIR99021 solution mère. Aliquote 50 &mu ; L/tube x 35 tubes et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>Reconstitue 5 mg PD0325901 (MW 482.19) avec 1037 &mu ; L DMSO pour faire 10 mM PD0325901 solution mère. Aliquote 50 &mu ; L/tube x 20 tubes et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>BIRB796</td><td>Axon</td><td>1358</td><td>Reconstitue 10 mg BIRB796 (MW 527.66) avec 948 &mu ; L DMSO pour faire 20 mM BIRB796 solution mère. Aliquote 50 &mu ; L/tube x 18 tubes et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>SP600125</td><td>Tocris</td><td>1496</td><td>Reconstitue 10 mg SP600125 (MW220.23) avec 908 &mu ; L DMSO pour faire 50 mM SP600125 solution mère. Aliquote 50 &mu ; L/tube x 18 tubes et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27845</td><td>Plaque de micropuits</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Reconstituer 5 g de Pluronic F-127 dans 100 mL d’eau pour faire une solution mère de Pluronic F127 à 5 % (p/v). Stériliser par filtration (0,22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes et conserver à r.t.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>hPGCLC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow' s MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11710035</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Milieu</td><td></td><td></td> basal hPGCLC <td>Mélanger les réactifs suivants pour obtenir le milieu basal hPGCLC. 500 mL de Glasgow' s MEM 75 mL de KnockOut Serum Replacement 6 mL de solution d’acides aminés non essentiels MEM (100x) 6 mL de 100 mM de pyruvate de sodium 6 mL de Pénicilline-Streptomycine (x100) Aliquotes 40 mL/tube et conserver à -20 &°C.</td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>Dilué 350 &mu ; L 2-Mercaptoéthanol (14,3 M) dans 9,65 mL de PBS(-) pour faire 500 mM de solution mère de 2-Mercaptoéthanol. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>Reconstituer 400 mg d’acide L-ascorbique avec 20 mL d’eau pour obtenir une solution mère d’acide L-ascorbique à 20 mg/mL. Stériliser par filtration (0,22 um). Aliquote 500 &mu ; L/tube x 40 tubes et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>BMP4 humain recombinant</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td>Reconstituer 1 mg de BMP4 humain recombinant avec 10 mL de 4 mM HCl aq. pour faire 100 &mu ; g/mL de solution mère humaine recombinante de BMP4. Aliquote 250 &mu ; L/tube x 40 tubes et stocker à -80 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Humain SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>Reconstituer 250 &mu ; g SCF humain avec 500 &mu ; L de 0,1 % d’albumine sérique bovine dans PBS(-) pour faire 500 &mu ; g/mL de solution mère de SCF humain. Aliquote 35 &mu ; L/tube x 14 tubes et stocker à -80 &deg ;C.</td></tr><tr><td>EGF humain</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>Reconstituer 1 mg d’EGF humain avec 1 mL d’albumine sérique bovine à 0,1 % dans PBS(-) pour obtenir une solution mère d’EGF humain de 1 mg/mL. Aliqot 100 &mu ; L/tube x 10 tubes. Diluer 100 &mu ; L de 1 mg/ml de solution mère d’EGF humain avec 300 &mu ; L de 0,1 % d’albumine sérique bovine dans PBS(-) pour faire 250 &mu ; g/mL de solution mère humanEGF. Aliquote 20 &mu ; L/tube x 20 tubes. Conserver à -80 °C.</td></tr><tr><td>Crépine de cellule</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Taille des pores = 40 &mu ;m.</td></tr><tr><td>Tube conique en polypropylène de 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de fixation basse</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Vari-Mix Platform Rocker</td><td>Thermofisher</td><td>M79735Q</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Coloration immunohistochimique </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BLOXALL Solution bloquante</td><td>VECTOR</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse serum ImmPRESS Réactif Anti-chèvre IgG</td><td>VECTOR</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>OCT-3/4 Anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-8629</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>VECTOR</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermofisher</td><td>SP15-100</td><td>Montage medium</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Isolateing hPGCLC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diabetes Body Dissociation</td> Kit <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-348</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD38 conjugué à l’APC</td><td>abcam</td><td>ab134399</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Les cellules germinales primordiales (PGC) sont des précurseurs communs de toutes les cellules de la lignée germinale. Chez les embryons de souris, une population fondatrice de ~ 40 PGC sont induits des cellules pluripotentes épiblaste par exposition orchestrée aux cytokines, dont la protéine morphogénétique osseuse 4 (Bmp4). Sur les embryons humains, le PGC plus tôt ont été identifiés sur la paroi endodermique du sac vitellin vers la fin de la semaine 3rd de la gestation, mais on connaît mal le processus de spécification du PGC humaine et leur développement précoce. Afin de contourner les barrières techniques et éthiques d’étudier le PGC embryonnaires humaines, modèles de culture de cellules porteuses ont été récemment générés à partir de cellules souches pluripotentes. Nous décrivons ici un protocole de 13 jours pour une production robuste de cellules humaines de PGC-Like (hPGCLCs). Les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) maintenus dans l’état de pluripotence apprêtée sont incubées dans les naïfs 4i reprogrammation moyen pendant 48 heures, monocellules se dissociés et emballés dans des micropuits. Maintenance prolongée de hiPSCs dans l’état de pluripotence naïf provoque des aberrations chromosomiques importantes et devrait être évité. hiPSCs dans les puits sont maintenues pour supplémentaires 24 heures dans le milieu de 4i à corps embryoïdes forme (EBs), qui sont ensuite cultivées en basse-respect des ustensiles en plastique sous une condition bascule dans le milieu de l’induction de hPGCLC contenant une forte concentration de BMP4 humaine recombinante. EBs sont ensuite mis en culture pendant 8 jours dans l’état bascule, non adhérents d’obtenir des rendements maximaux de hPGCLCs. Par immunohistochimie, les hPGCLCs sont facilement détectés comme cellules exprimant fortement OCT4 dans presque tous les EBs exclusivement sur leur surface. Lorsque EBs sont enzymatiquement dissociées et soumis à l’enrichissement de FACS, hPGCLCs peuvent être collectées comme cellules CD38 + jusqu'à 40-45 % rendement.

La plaque de microtitration utilisée ici est dans le format de 24 puits et dispose de 8 puits tenant les feuilles de microtitration, dont chacun prend en charge la formation pouvant atteindre 1 200 EBs. D’environ 24 millions de cellules de pluripotence 4i naïve, cette plaque de microtitration génère généralement ~ 8 000 EBs composé de ~ 3 000 cellules par EB. Au cours de la culture non adhérents d’EBs avec balancement constant, le nombre d’EBs intact progressivement diminue en raison de la spontanée un démantèlement et ~ 3 000 EBs survivre jusqu’au jour 13 du protocole. La plupart de ces survivants EBs ont 50-200 hPGCLCs sur leur surface (estimée par détection immunohistochimique des cellules OCT4 + dans des coupes sériées de EBs ; voir Figure 8), ce qui donne ~ 100 000 OCT4 + hPGCLCs au total. Digestion enzymatique de l’EBs en cellules individuelles est un processus relativement inefficace, en réduisant le rendement des FACS enrichi CD38 + hPGCLCs à 9 000-47 000 cellules. Dans nos mains, une moyenne de six lots indépendants mais consécutifs d’expériences a été 14 038 ± 5 731 (moyenne ± SEM). Parce que les cellules négatives CD38 EB expriment OCT4 ARNm (qPCR) ou des protéines (immunohistochimie) que très faiblement, si ce n’est pas complètement absent, toutes les cellules EB fortement exprimant la protéine OCT4 sont pratiquement équivalent à l’ensemble de la population de la CD38 + hPGCLCs.
Le paramètre critique du présent protocole inclut la densité cellulaire. 2.0 x 105 humain CISP sont inoculées dans une matrice extracellulaire protéines-enduit puits de la plaque de culture de cellules de 6 puits (surface de croissance2 cm 9,60 / puits) avec 2 mL de milieu de Y27632-complétée (2.2.9), cellules atteindra environ 20-30 % confluency à 24 heures suivant l’inoculation (Figure 1). Après une culture de 24 heures supplémentaire dans le milieu de mTeSR1 en l’absence de Y7632, de cellules agrégées et de former des colonies, occupant environ 30 % de la surface de croissance (Figure 2). Les cellules sont ensuite cultivées dans le milieu de reprogrammation 4i (2.3.2). Après 24 heures de culture dans le confluent de devenir des cellules moyennes, 4i (Figure 3). Une culture de 24 heures supplémentaire dans le milieu de 4i rend les cellules dense (Figure 4). Le moment exact du changement médiatique (toutes les 24 heures +/-4 heures) et la densité des cellules sont indispensables pour une formation réussie d’EBs et hPGCLCs.
Après 48 heures culture dans le milieu de 4i, les cellules sont dissociées et inoculés à la plaque de microtitration, qui possède des puits 400 µm taille (2.4). Bien que cette plaque de microtitration disponibles dans le commerce est enduite de faible adhérence par le constructeur, frais de re-enduit avec du détergent (2.4.3) est recommandé pour réduire le risque d’adhérence des cellules indésirables. 800 µm micropuits entraîné avec un rendement réduit de hPGCLCs, ce qui suggère l’importance de la taille EB pour différencier correctement dirigée. Les cellules inoculées dans le milieu de 4i formeront EBs dans des micropuits à 24 à 30 heures, que l'on peut observer à l’aide d’un standard, inversé phase microscope à contraste (Figure 5). Le contour circulaire d’EBs deviennent clairement visibles et après 24 heures d’incubation. EBs de récolte à une époque antérieure (p. ex., 16 heures après l’inoculation) avant leur contour circulaire est clairement visible n’est pas recommandée car ces EBs sont très vulnérables aux dommages mécaniques et démonter facilement. Notez que des quantités significatives de naïve hiPSCs ne sont pas incorporées dans EBs, ce qui est normal. Ces cellules individuelles vont être emportés avant le démarrage de la culture de l’EBs sur surface peu adhérentes (2.5.2) à bascule. Notez également que, dans notre protocole, EBs se forment dans le milieu de la pluripotence 4i naïve - pas dans le milieu de hPGCLC. Formation préalable de EBs solide dans le milieu de 4i avant l’exposition au milieu de hPGCLC est importante pour la distribution des hPGCLCs sur la surface de l’EBs.
EBs a maintenu dans le milieu de hPGCLC sous une bascule, condition de culture non adhérents maintiendront leur forme sphérique sans agrégation ou fusion (Figure 6 et Figure 7). Trop faible condition à bascule provoquera l’agrégation EB et fusion, mais trop dure condition démantèlerons EBs. PGCLCs humaines émergent comme cellules exprimant OCT4 sur la surface de l’EBs après dès que la culture de 5 jours dans le milieu de hPGCLC et leur nombre augmente jusqu'à ce que la culture de 8 jours (Figure 8). L’incubation supplémentaire de EBs peut causer démantèlement d’EBs et perte de hPGCLCs. PGCLCs humaines peuvent être enrichis de cellules EB enzymatiquement dissociées après 5 à 8 jours de culture dans le milieu hPGCLC par FACS comme cellules CD38 + (Figure 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> Figure 1 : culture de cellules humaines iPSC dans un milieu additionné de Y27632 24 heures après l’inoculation. La densité cellulaire est d’environ 20-30 % confluentes. En présence de l’inhibiteur de la roche Y27632, les cellules ont tendance à se répandre bien avec élongation longue, pointe. Echelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> Figure 2 : culture de cellules humaines iPSC 48 heures après l’inoculation. Agrégation de former des colonies, occupant environ 30 % de la surface de croissance des cellules. Echelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> Figure 3 : la culture de cellules humaines iPSC incubé dans le milieu de reprogrammation 4i pendant 24 heures. Cellules atteignent à la confluence. Echelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> Figure 4 : la culture de cellules humaines iPSC incubé dans le milieu de reprogrammation 4i pendant 48 heures. Confluentes sont dense. Echelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> Figure 5 : humain iPSC EBs formé dans des micropuits après 24 heures d’incubation dans la 4i reprogrammation moyen. Le contour circulaire d’EBs deviennent visibles à 24 à 30 heures après l’inoculation. Lorsque le contour est confirmé sous un microscope à contraste de phase, EBs sont prêts pour le transfert à une condition de culture bascule. Echelle = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> Figure 6 : humain iPSC EBs incubée pendant 24 heures dans le milieu de hPGCLC. EBs a largement maintenir leur forme sphérique. Echelle = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> Figure 7 : humain iPSC EBs incubé pendant 192 heures dans le milieu de hPGCLC. EBs sont agrandies par rapport à leur apparition à la culture de 24 heures, mais ils affirment encore largement des formes sphériques avec aucune agrégation ou la fusion. Echelle = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> Figure 8 : humains PGCLCs exprimer OCT4 sont localisés sur la surface du hiPSC EBs incubé pendant 192 heures dans le milieu de hPGCLC. EBs ont été incorporés dans les protéines de la matrice extracellulaire et traitées pour FFIP diapositive marquage immunohistochimique de OCT4 (substrat DAB). Echelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> Figure 9 : PGCLCs humaines sont enrichis de cellules EB enzymatiquement dissociées par FACS comme CD38+ cellules. Après une incubation dans le milieu de hPGCLC de 5 à 8 jours, EBs peut être dissocié par digestion enzymatique pour préparer la suspension cellulaire unique. hPGCLCs peut être enrichi comme CD38+ cellules de FACS (points rouges). Cellules EB qui n’expriment pas CD38 (points bleus) devraient également être collectées comme contrôle négatif. Portes de FACS de cellules CD38-positifs et négatifs CD38 doivent être séparés par une large marge (points verts) pour éviter la contamination de chaque type de cellules. Les panneaux supérieurs et inférieurs montrent des profils de FACS sans ou avec les anticorps anti-CD38 coloration, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Les cellules germinales primordiales (PGC) sont des précurseurs communs du sperme et des œufs. PGC embryonnaires humaines est spécifiées de pluripotentes épiblaste grâce à des interactions des cytokines. Nous décrivons ici un protocole 13 jours d’induire les cellules humaines transcriptomally ressemblant à des PGC à la surface du corps embryoïdes d’apprêté-induite la pluripotence des cellules souches pluripotentes.

Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la toxicologie germinale humaine, telles que la façon dont les dommages dans le génome des cellules germinales primordiales humaines sont créés ou réparés. Le principal avantage de cette technique est que les cellules germinales primordiales humaines peuvent être générées en deux semaines à partir des cellules iPS pluripotency amorcées hébergeant le fond génétique de prédisposition de la maladie. Les implications de cette technique s’étendent à la prévention de l’affaiblissement génomique dans les cellules germinales humaines, parce que notre modèle de culture cellulaire peut nous aider à réduire la toxicité de germline d’un médicament thérapeutique.Pour commencer avec la génération de cellules humaines primordiales comme les cellules germinales, ou PGCLCs humains, préparer des plaques extracellulaires enrobées de protéines matricielles et la suspension cellulaire des iPSCs humains, tel que décrit dans le protocole de texte. Préparer une suspension à cellule unique des iPSCs humains pluripotences amorcés dans le milieu mTeSR1 contenant l’inhibiteur de la kinase Rho Y-27632. Ajustez soigneusement la densité cellulaire à 100 000 cellules par millilitre.Inoculer deux millilitres de suspension cellulaire des iPSCs humains amorcés dans chaque puits de la protéine matricielle extracellulaire enduit des plaques de six puits, en s’assurant que les cellules sont réparties uniformément en secouant les plaques verticalement et horizontalement. Incuber les plaques dans un incubateur de CO2 à trois gaz à 37 degrés Celsius. Il est très important d’inoculer exactement 200 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de six puits.Le comptage précis des cellules est essentiel. Après l’achèvement de la conversion transitoire à la pluripotence naïve, les cellules devraient regarder trop confluent, ce qui est normal. Le moment exact du changement moyen est important pour atteindre des PGCLCs humains élevés et une reproductibilité expérimentale.La densité de la culture hiPSC 4i est élevée dans ces conditions, et on s’attend à ce que la cellule devienne confluente aux 48 à 72 heures après l’inoculation. 24 heures après l’inoculation, changer le milieu avec deux millilitres par puits de mTeSR1 moyen sans Y27632. Commencez la conversion des iPSCs humains d’état de pluripotence amorcés en cellules souches pluripotentes naïves de 4i, en réchauffant 50 millilitres de milieu complet de 4i dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.À 48 et 72 heures après l’inoculation, retirer les plaques de l’incubateur et changer le milieu avec 2 millilitres par puits de 4i milieu complet. Centrifugez la plaque de microwell enduite de détergent à 1000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Inspecter les puits au microscope inversé pour s’assurer de l’absence de bulles d’air.Rincez les puits tels que décrits dans le protocole textuel et répétez la centrifugation. Ajouter 4i milieu complet aux puits rincés. Centrifugez la plaque à 1000 g pendant cinq minutes à température ambiante, et inspectez à nouveau les puits.Pour inoculer 4i iPSCs humains dans la plaque de microwell, préparez la suspension humaine de cellules d’iPSC comme décrit dans le protocole. Filtrer cette suspension cellulaire à l’aide d’une passoire cellulaire de taille pore de 40 micromètres pour enlever les agrégats cellulaires. Lavez la passoire avec un millilitre de milieu complet préchauffé 4i trois fois pour recueillir toutes les cellules de la passoire, et comptez les cellules avec un compteur de culture.Ensuite, diluer cette suspension cellulaire unique de 4i iPSCs humains naïfs à 27 à 32,4 millions de cellules dans 9 millilitres préchauffé 4i milieu complet contenant Y27632. Retirez la plaque microwell préparée précédemment contenant 1 millilitre de milieu complet de 4i par puits d’un incubateur à trois gaz. Inoculer 1 millilitre de suspension iPSC humaine naïve de 4i dans chaque puits, pour atteindre une concentration de 3,0 à 3,6 millions de cellules par puits.Pipette doucement pour répartir uniformément les cellules. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 3 minutes à température ambiante. Placer la plaque dans un incubateur de CO2 à trois gaz, en s’assurant de ne pas déranger les cellules granulées dans des microwells, et d’incuber pendant 24 à 30 heures, parce qu’une incubation nocturne est insuffisante pour la formation de corps embryonnaires serrés ou d’ER.Avant-guerre 5 millilitres de milieu basal PGCLC humain et 20 millilitres de PGCLC humain milieu complet pendant au moins cinq minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius Placer soigneusement une passoire cellulaire de taille pore de 40 micromètres à l’envers sur un tube conique polypropylène de 50 millilitres. Pour détacher les ER des microwells, pipette doucement chaque puits de la plaque. Pour éliminer les cellules non incorporées dans les ER, filtrez le contenu de tous les puits à travers la passoire cellulaire.Lavez doucement les OG conservés sur la membrane de la passoire cellulaire avec 1 millilitre de milieu basal PGCLC humain préchauffé, et répétez le lavage cinq fois. Placez un tube conique frais de 50 millilitres sur la passoire cellulaire, de sorte que la passoire cellulaire est maintenant positionnée côté droit vers le haut dans le nouveau tube. Inversez rapidement la passoire cellulaire avec le nouveau tube, qui positionnera les ER sous la membrane de la passoire cellulaire.Ajouter 18 millilitres de PGCLC humain préchauffé à la membrane de la passoire cellulaire pour recueillir les ER dans le tube conique. Ensuite, plaque 3 millilitres par puits de la suspension des È dans les puits d’une plaque à faible fixation de six puits. Placez la plaque sur un rocker en mouvement de scie à scie dans un incubateur à trois gaz, et réglez soigneusement la vitesse de basculement à environ 20 tours par minute.Le septième au 13e jour de l’expérience, préparez fraîchement 20 millilitres de PGCLC humain milieu complet chaque jour. Retirez la plaque du rocker, ce qui fera couler les EB au fond des puits. Retirer l’ancien milieu sans sécher les ER de sorte qu’environ 0,2 millilitres de vieux milieu reste dans chaque puits.Ajouter 3 millilitres par puits de pgclc humain frais milieu complet, après avoir enlevé l’ancien milieu tous les jours. Pour identifier les PGCLCs humains comme cellules oct4-positives, récoltez les EBs à un tube de microcentrifugeuse à faible liaison de 1,5 millilitre. Laissez les ER couler vers le bas à température ambiante et jetez le milieu.Rincer les ER avec du froid glacial 1X PBS. Après avoir enlevé le PBS, incuber les È dans 1 millilitre de froid glacé 1% de poids en volume d’azide de sodium dans PBS sur la glace pendant cinq minutes. Laissez les EBs couler au fond à température ambiante.Après avoir jeté le surnatant, rincer les ER avec du PBS glacé. Décongeler 200 microlitres de protéines matricielles extracellulaires sur la glace. Ajouter la protéine au tube contenant des ER.Laissez le tube à température ambiante pendant environ 10 minutes, jusqu’à ce que le gel soit solidifié et que les EB soient intégrés. Pour fixer les EBs, ajouter 1 millilitre de formaldéhyde de 4% dans PBS au tube, et incuber à température ambiante pendant 15 minutes avec un basculement doux. Après cela, jetez le formaldéhyde et rincez les ER une fois avec du PBS glacé.Ajouter 1 millilitre de 70 % d’éthanol. Conserver à 70 % d’éthanol à 4 degrés Celsius jusqu’à une semaine ou procéder au traitement avec un protocole FFPE standard. La densité cellulaire et même la distribution des cellules sur chaque puits sont critiques.Les CISP humains en 2 millilitres de Y27632 complété moyen par puits d’une plaque de six puits, atteignent 20 à 30% confluency après 24 heures. Après une culture supplémentaire de 24 heures dans le milieu mTeSR1, en l’absence de Y27632, les cellules se sont agrégées et ont formé des colonies, occupant environ 30% de la zone de croissance. Après 24 heures de culture dans le milieu de reprogrammation 4i, les cellules ont atteint la confluence.Après 24 heures supplémentaires de culture dans le milieu 4i, les cellules sont devenues plus densément emballées. Après une incubation de 24 heures dans des microwells dans le milieu de reprogrammation de 4i, les cellules ont formé des EBs avec leur contour circulaire visible à 24 à 30 heures après inoculation. Les È maintenus dans le milieu humain de PGCLC, dans des conditions nonadherent de basculement, ont maintenu leur forme sphérique sans agrégation après 24 heures.Après 192 heures, les ER étaient plus grands, maintenant la même morphologie. Après 5 jours, les cellules ont émergé en tant qu’OCT4 exprimant des cellules à la surface des EBs, augmentant leur nombre après 8 jours. Les cellules de la suspension à cellule unique des PGCLCs humains ont été enrichies en cellules CD38-positives par FACS.Les cellules qui n’expriment pas le CD38 étaient un contrôle négatif. Pour éviter la contamination, les portes FACS CD38-positives et CD38-négatives ont été séparées par une large marge. Tout en essayant cette procédure, il est important de suivre le comptage exact des cellules et les calendriers de changement moyen.Omettre le changement moyen ne sera-ce qu’un seul jour, ou réduire le volume de ce milieu à n’importe quelle étape, peut causer la mort massive de cellules. La vitesse de la culture de basculement des corps embryoïdes doit être soigneusement optimisée.

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Developmental Biology

Biologie du développement

Génération induites pluripotentes (cellules souches iPSC) lignes produit des lignes de différentes potentiel de développement, même quand ils passent des tests standard pour la pluripotence. Nous décrivons ici un protocole de produire des souris provenant entièrement de iPSCs, qui définit les lignes iPSC comme possédant la pluripotence...

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Ici, nous montrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de 3-4 ml de sang périphérique en utilisant un vecteur lentiviral unique reprogrammation. La reprogrammation des cellules sanguines facilement disponibles promet d'accélérer l'utilisation des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche.

Génération de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Cette vidéo démontre le processus de différenciation des corps embryoïdes (EB) en agrégats neuroépithéliaux et leur division ultérieure en cellules neuronales et gliales. Cette méthode permet de générer efficacement des cellules neuronales et gliales in vitro, qui servent de systèmes d’essai pour les tests de toxicité ainsi que pour l’évaluation des différentes voies impliquées dans la neurotoxicité.

Génération de neurones et de cellules gliales à partir de corps embryoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Cette vidéo démontre la transformation de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) en organoïdes cérébraux sphériques. En utilisant des inhibiteurs spécifiques, les hPSC sont guidées pour se différencier vers une lignée neuronale, formant des colonies neuroectodermiques. Des facteurs de croissance spéciaux sont alors introduits, qui encouragent l’auto-organisation et la prolifération des colonies, conduisant finalement à la formation d’organoïdes cérébraux sphériques.

Génération de sphéroïdes à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la génération efficace d’iPSC sans intégration à partir de cellules sanguines périphériques humaines adultes. Grâce à l’utilisation de quatre vecteurs épisomaux basés sur oriP/EBNA pour exprimer les facteurs de reprogrammation, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 et SOX2, des milliers de colonies d’iPSC peuvent être obtenues à partir de 1 mL de sang périphérique.

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Ce protocole décrit la reprogrammation des primaires amniotique fluide et membrane de cellules souches mésenchymateuses sur les cellules souches pluripotentes induites en utilisant une approche épisomiques sans intégration dans des conditions totalement chimiquement définies. Les procédures d’extraction, la culture, la reprogrammation et la caractérisation des cellules souches pluripotentes induites qui en résulte par une méthodologie rigoureuse sont reprises.

Reprogrammation du liquide amniotique primaire et cellules de Membrane de pluripotence dans des Conditions sans Xeno

La dérivation robuste des cellules de la tige pluripotente induite par l'homme (hiPS) a été réalisée en utilisant une reprogrammation médiée par vecteur de virus Sendai non-intégrant (SeV) des fibroblastes dermiques. La maintenance cellulaire de hiPS et l'expansion clonale ont été réalisées en utilisant des conditions de culture sans xénon et chimiquement définies avec une matrice recombinante de la laminine humaine 521 (LN-521) et un milieu E8 (E8) essentiel.

Intégration de la dérivation libre de cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme à l&#39;aide de Laminin 521 Matrix

Nous présentons un protocole pour la reversion chimique efficace, rapide et en vrac de classiques pluripotentes humaines lineage-amorcé des cellules souches (hPSC) dans un état de préimplantation épiblaste comme pluripotentes naïve epigenomically stable. Cette méthode se traduit par l’expression des gènes de lignée-amorcé une baisse et une amélioration marquée dans la différenciation multilignée dirigée à travers un vaste répertoire des lignes classiques hPSC.

Réversion chimique des cellules souches pluripotentes humaines classiques à un état semblable au naïf avec une puissance améliorée de différenciation multilignée

L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles de dériver l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) en utilisant différentes tailles de corps embryoïdes.

Découlant épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de souches pluripotentes induites (iPS) de différentes tailles de corps embryoïdes

Ce manuscrit fournit une procédure étape par étape pour la dérivation et la maintenance des kératinocytes humains à partir de cheveux épilés et la génération ultérieure de cellules souches pluripotentes humaines induites par intégration (hiPSC) sans intégration par des vecteurs épisomiques.

Génération de l&#39;intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Découvrez la génération de cellules germinales primordiales humaines à partir de cellules iPSC en 13 jours. Cette méthode permet d'étudier la toxicité germinale et l'intégrité génomique in vitro.

Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes (Vidéo) | JoVE Journal

Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes

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