Name: Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Découvrez la purification anaérobie de protéines et la caractérisation cinétique de DesB dioxygénase à l'aide d'une électrode à oxygène. Cette méthode permet de maintenir l'activité enzymatique des protéines sensibles à l'oxygène.

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Nous tenons à remercier le Dr Camille Keller de l’Université wesleyenne pour le support technique. Merci professeur Lindsay D. Eltis et Jenna K. Capyk de l’Université de la Colombie-Britannique, ainsi que Christian Whitman de l’Université du Texas à Austin, pour leurs conseils concernant les méthodes de purification des protéines anaérobie et l’utilisation d’un O2 -électrode sensible.

Les auteurs ont pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Les étapes critiques dans l’obtention de protéines DesB active purifiée impliquent la formation et le maintien du site actif réduit Fe (II) de l’enzyme. Ainsi, corriger les performances de l’induction, la purification, la concentration, et dessalement étapes sont essentielles à l’obtention d’enzyme active avec succès. Induire l’expression de la protéine en présence de 1 mM de sulfate d’ammonium ferreux assure que Fe (II) est correctement incorporé dans le site actif du DesB. Cette méthode s’inspire des études comme celle...

Les enzymes qui utilisent le fer ou autres métaux pour activer l’oxygène sont souvent sensibles à l’inactivation au cours du processus de purification en raison de leur éloignement de l’environnement réducteur d’une cellule. Par conséquent, ces protéines doivent servir de lysats cellulaires, être soumis à des agents réducteurs externes ou être purifiés par voie anaérobie pour s’assurer qu’ils ont une activité enzymatique optimale1,2,3,4. Pour ces enzymes qui sont sensibles à l’oxygène (enzymes contenant du fer plus précisément), effectuer toutes les étapes de purification et caractérisation tout en maintenant des conditions anaérobies est nécessaire pour caractériser complètement à eux. Cela a conduit les chercheurs à élaborer des montages tout laboratoire dans l’enceinte des chambres anaérobies d’études allant de l’expression de la protéine par cristallographie5,6,7,8 .
Dans les présentes, nous rapportons les méthodes d’épuration anaérobie et caractérisation cinétique de l’enzyme DesB à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. DesB est une dioxygénase gallate de la bactérie Sphingobium SP. souche SYK-6 qui est lié à LigAB, une dioxygénase protocatecuate partir du même organisme. Les deux enzymes appartiennent à la superfamille des dioxygénase (DGPAM) protocatéchuate de type II qui n’a pas été étudiée date9, probablement en partie due à des enzymes de cette superfamille sont sensibles à l’inactivation quand purifié à l’aide de la norme aérobique méthodes de purification des protéines. Puisque certains enzymes DGPAM affichent promiscuité de substrat, tandis que d’autres sont spécifiques à substrat2,10, plus loin la caractérisation de cette superfamille est nécessaire d’identifier les déterminants de la spécificité. Comme a été observée dans plusieurs enzymes super-familles11,12,13,14,15, petites molécules peuvent modifier l’activité par l’intermédiaire de l’inhibition compétitive directe ou la liaison de molécules à séparer les poches allostériques qui provoque une augmentation ou diminution de l’activité enzymatique16. Alors que la cinétique seul ne peut pas différencier l’emplacement de la reliure d’un modulateur, l’amplitude d’un changement d’activité est important pour comprendre les effets. En tant que telles, méthodes de caractérisation cinétique du DesB native et son activité en présence de 4-nitrocathécol (4NC), un composé utilisé couramment pour caractériser et inhiber dioxygénase enzymes2,17, 18, sont indiqués.
DesB est capable de décomposer gallate, un composé, via une réaction de dioxygénase (EDO) extradiol dans quel anneau ouverture est catalysée par l’oxygène comme l’un des substrats10,19d’aromatique dérivés de la lignine. Cette réaction enzymatique se produit dans le cadre de la décomposition de la lignine, un hétéropolymère aromatique se trouvée dans la paroi cellulaire des plantes. La lignine peut être dépolymérisée, produisant une variété de composés aromatiques qui peut être subdivisée en métabolites central3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygénases (EDO) catalysent un anneau ouverture réaction dihydroxylé de composés aromatiques, où clivage se trouve en bordure d’un diol métal coordonnés ; en revanche, intradiol dioxygénases clivent les composés aromatiques analogues entre les deux groupes hydroxyle (Figure 1). ADE, comme de nombreux autres métalloenzymes, ont un centre métallique divalent pour coordination Fe (II) composé d’un deux-histidine, un-carboxylate triade9,34,35. Ces métalloenzymes devient oxydés, par autooxydation ou axée sur le mécanisme d’inactivation, alors que l’enzyme est rendu inactif2,36,37,38.
Dans les procédures expérimentales décrites dans ce manuscrit, nous utilisons le DesB, un membre de la superfamille DGPAM de la bactérie Sphingobium SP SYK-6, à catalyser l’apport d’oxygène à travers la liaison de C4-C5 de gallate d’Epigallocatechin (Figure 2 a). La régiochimie de ce clivage est analogue à LigAB, qui est une protocatéchuate-4,5-dioxygénase (Figure 2 b). Jusqu’ici, enquêtes de cette dioxygénase gallate n’incluent aucun signalement de composés qui inhibent le DesB10,19,,39. Avec l’utilisation des méthodes de purification aérobie, DesB a manifesté une activité variable, alors qu’avec l’utilisation de méthodes anaérobies, nous avons pu obtenir régulièrement les protéines à activité reproductible. Les études cinétiques décrites ici montrent les méthodes d’épuration anaérobie du DesB, caractérisation cinétique de la réaction du DesB avec gallate et l’inhibition du DesB par 4-nitrocathécol (4NC).

<table><tbody><tr><td>Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranodise</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>N,N’tétraméthyl-éthylènediamine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Résine amylose à haut débit</td><td>New England Biolabs</td><td>E8022S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) cellules Escherichia coli compétentes</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>L-cystéine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>acide gallique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>4-nitrocatéchol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N15553</td><td></td></tr><tr><td>Ferreux sulfate d’ammonium</td><td>Mallinckrodt</td><td>5064</td><td></td></tr><tr><td>Dithionite de sodium</td><td>Alfa Aesar</td><td>33381-22</td><td></td></tr><tr><td>bouteilles de sérum de blé</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-406G</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Acrodisc PF Seringue Filtre avec membrane Supor</td><td>Pall Corportation</td><td>4187</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Amicon Concentrateur de cellules agitées</td><td>EMD Millipore</td><td>UFSC40001</td><td></td></tr><tr><td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa filtre à membrane cellulosique reconstituée</td><td>EMD Millipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 colonne de salage grossier</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0033-01</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Flacons à sertir</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-38</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus Unité de contrôle d’électrode</td><td>Hansatech Instruments</td><td>OXYG1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’électrode d’oxygène</td><td>Hansatech Instruments</td><td>DW1</td><td></td></tr><tr><td>Disque d’électrode</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0.0125 mmX25mm) Bobine de 30m</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage d’électrodes</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S16</td><td></td></tr><tr><td>Papier d’espacement</td><td>Zig Zag</td><td>disponible dans n’importe quelle station-service</td><td></td></tr><tr><td>He-series Dri-Lab</td><td>boîte à gants Vacuum/Atmospheres Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HE-493 Dri-Train</td><td>Vacuum/Atmospheres Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatule en acier inoxydable micro-conique à double extrémité</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td><td>Fisher Scientific</td><td>k420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu ; L, modèle 701 N SYR, cimenté NDL 26s ga, 2 po, point stlye 2 seringue</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420401-1505</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex-C5 homogénéisateur haute pression</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-PER Réactif complet d’extraction de protéines bactériennes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89821</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme à partir d’un blanc d’œuf de poule</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12650-88-3</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7177-48-2</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>de sodiumFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G46-500</td><td></td></tr></tbody></table>

purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’inhibition et l’activité desb dioxygenase

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Les protéines sensibles à l’oxygène, y compris ces enzymes qui utilisent l’oxygène comme substrat, peuvent ont réduit stabilité lorsque purifiée à l’aide de méthodes traditionnelles de purification aérobie. Ce manuscrit montre les détails techniques impliqués dans le processus de purification anaérobie, y compris la préparation des tampons et réactifs, les méthodes de chromatographie sur colonne dans une boîte à gants et le dessalement de la protéine avant cinétique. Également décrites sont les méthodes pour la préparation et à l’aide d’une électrode à oxygène pour effectuer la caractérisation cinétique d’une enzyme utilisant l’oxygène. Ces méthodes sont illustrées à l’aide de l’enzyme dioxygénase DesB, une dioxygénase gallate de la bactérie Sphingobium SP. souche SYK-6.

L’analyse de gel SDS-PAGE des différentes fractions de purification de la construction de fusion DesB-maltose binding protein (MBP) (Figure 3) est présentée. Le gel révèle que la protéine est pure (MW = 91,22 kDa), à l’exception de la présence du DesB (MW = 49.22 kDa) et domaine de protéine MBP (42 kDa) clivé les uns des autres. Fractions E2 et E3 ont été sélectionnés pour la concentration (étape 4.2).
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Nous présentons ici un protocole pour la purification de protéine anaérobie, la concentration de protéines anaérobie et ultérieure caractérisation cinétique à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. La méthode est illustrée à l’aide de l’enzyme DesB, une enzyme dioxygénase qui est plus stable et plus active lorsque purifié et stockées dans un environnement anaérobie.

Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Cette méthode est conçue pour répondre aux questions clés dans le domaine de la biochimie inorganique, sur la façon de maintenir l’activité enzymatique dans les protéines qui contiennent des métaux sensibles à l’oxygène. Le principal avantage de cette technique est qu’elle vous aide à visualiser les façons dont vous pouvez maintenir le métal d’une protéine dans son état réduit. En général, les personnes nouvelles à cette technique auront du mal parce qu’il est difficile d’entretenir les matériaux et les réagéteurs pour être complètement anaérobie.24 heures après avoir induisant l’expression de protéine, recueillez les cellules par centrifugation, et résuspendez la pastille bactérienne de cellules dans 20 millilitres de tampon de colonne d’amylose par 1.5 litres de croissance. Ajouter un milligramme de lysozyme à la suspension cellulaire et remuer les cellules pendant 20 minutes sur la glace. À la fin de l’incubation, lyse la solution cellulaire résuspendue par homogénéisation à haute pression avec trois à cinq passages à environ 15 000 psi, et transférer la protéine dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres.Rincer l’espace libre avec de l’azote pendant une minute, et centrifuger la cellule lysate pour enlever les débris insolubles. Transférer le supernatant sur au moins un tube de 50 millilitres et capuchonner le lysate à l’aide d’un septum en caoutchouc. À l’aide d’une aiguille de calibre 20, bullez lentement le gaz azoté à travers la solution pendant deux minutes pour déplacer l’oxygène.Ensuite, enveloppez le septum avec du film de paraffine, fixez le parafilm avec du fil de cuivre et placez le supernatant dans la boîte à gants avec les matériaux de la colonne. Lorsque le solvant se trouve juste au-dessus du lit en résine, dans une colonne d’amylose préparée précédemment, chargez 50 millilitres de protéines supernatant sur la colonne, recueillant le débit en fractions de cinq millilitres sous azote modérément pressurisé à environ cinq millilitres par minute. Lorsque tout le flux a été élucidé, lavez la colonne avec trois autres volumes de colonne de tampon de colonne d’amylose.Ajouter cinq CV de tampon d’élitution, puis collecter manuellement des fractions de trois millilitres dans des tubes à essai en verre sous azote modérément pressurisé. Testez les solutions pour la présence d’oxygène avec du sulfate d’ammonium ferreux et du dithiothreitol. La solution deviendra bleu foncé ou noir si l’oxygène est présent, comme le tube sur la droite.La présence d’oxygène se traduira par une protéine purifiée à faible activité catalytique. Les solutions avec un minimum d’oxygène présent seront la lavande ou bleu clair couleur translucide, comme le tube sur la gauche. Ensuite, utilisez une ligne d’azote externe pour pressuriser la chambre cellulaire agitée et concentrez la protéine à 50 millilitres à une vitesse d’agitation modérée à deux reprises.Ensuite, concentrez la protéine à 10 millilitres et filtrez la protéine concentrée à l’aide d’un filtre à seringues de 0,45 micromètre-pore. Aliquot 150 microlitres de protéines en tubes individuels de réaction en chaîne de polymése de 200 microlitres. Ensuite, retirez les aliquots plafonnés de la boîte à gants pour obtenir un gel immédiat par flash dans l’azote liquide et le stockage à moins 80 degrés Celsius.Pour le desalting DesB, ajoutez d’abord trois millilitres de gel de desalage grossier Sephadex G-25 à une colonne de borosilicate de neuf millilitres, et lavez la colonne avec deux volumes de colonne de tampon de desalte dégazé. Lorsque le DesB a décongelé, chargez la protéine purifiée sur la colonne au moyen d’un processus contrôlé par gravité et jetez le débit avant d’écouler trois gouttes de protéines dans chacun des 12 flacons, avec environ cinq millilitres de tampon de desalage. Pour préparer l’électrode d’oxygène, utilisez des ciseaux pour couper un environ 1,5 pouce carré de papier espaceur, et couper de petits triangles sur chaque face du carré, avec des fentes dans les coins pour faciliter l’emballage de l’électrode.Ajouter cinq gouttes d’une solution de chlorure de potassium à 50% sur la rainure d’anode argentée de l’électrode, et connecter les gouttes afin qu’elles forment un anneau continu de solution. Ajouter deux gouttes de la solution de chlorure de potassium au sommet de l’électrode de platine, et placer soigneusement le papier espaceur sur le dessus de l’électrode de platine, lissant le papier de l’espaceur de sorte qu’il n’y ait pas de bulles d’air. Coupez un morceau d’environ deux pouces de long de la membrane PTFE S4 de 30 m, et placez-le sur le papier de l’espaceur, en enlevant les bords de la membrane afin qu’ils soient alignés avec l’anneau externe de l’électrode.À l’aide d’un applicateur o-ring, poussez un petit anneau O sur l’électrode pour fixer le papier et la membrane de l’espaceur sur l’électrode, et placez un plus grand anneau O sur la rainure circulaire de l’électrode, en prenant soin qu’il n’y ait pas de membrane en dessous. Faites glisser la chambre supérieure de l’électrode sur la base et vissez les deux morceaux ensemble. Placez l’électrode assemblée sur sa base et connectez l’électrode au système de surveillance.Pour déterminer le taux de réaction enzymatique, utilisez une électrode de type Clark sensible à l’oxygène, avec intégration informatique pour mesurer la consommation d’oxygène via l’unité de contrôle des électrodes. Ajouter un millilitre de tampon Tris dans le volume approprié de substrat à la chambre d’électrode, et remuer la solution pendant 10 secondes. Après 10 secondes, sceller lentement la chambre avec le piston, et visser le haut vers le bas.Utilisez un tissu propre pour absorber l’excès de liquide qui est déplacé de la chambre, et permettre à l’électrode d’équilibrer où elle peut produire une mesure stable de la concentration d’oxygène dans la solution pendant au moins une minute. Ensuite, utilisez une seringue étanche au gaz de 10 microlitres pour ajouter environ un microlitre d’enzyme à la chambre d’électrode à travers le piston, et recueillir les données de taux. Lorsque toute la concentration d’un substrat donné a été recueillie, utilisez un tube en plastique relié à un flacon sous vide latéral pour vider la chambre d’électrode et rincez la chambre à plusieurs reprises pendant quatre à six cycles avec de l’eau.Ensuite, installez la solution dans l’électrode comme il vient de le démontrer, en utilisant une nouvelle concentration de substrat. L’analyse du gel SDS-PAGE des fractions individuelles de la purification de la construction de fusion protéique liant DesB-maltose révèle l’isolement d’un produit protéique pur, mis à part la présence de produits de domaine protéiques liants DesB et maltose qui se fendaient les uns des autres. Une fois que toutes les mesures cinétiques ont été prises, l’activité de DesB avec gallate, par exemple, peut être obtenue en mesurant le taux de consommation d’oxygène dans différentes concentrations de gallate.Inversement, le taux d’inhibition de DesB avec quatre nitrocatechol peut être déterminé en observant la réduction du taux de consommation d’oxygène de DesB avec gallate d’un millimolaire en présence de concentrations variables de quatre nitrocatechol, indiquant, par exemple, que le quatre-nitrocatechol inhibe la consommation d’oxygène et donc la réaction des DesB. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’étude des enzymes de dioxygénase ferreux-dépendantes, elle peut être appliquée à d’autres systèmes, tels que d’autres métalloenzymes. N’oubliez pas que travailler dans une boîte à gants peut être difficile, alors prenez soin de ne pas vous précipiter tout en exécutant cette technique.

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