Name: Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Découvrez la purification anaérobie de protéines et la caractérisation cinétique de DesB dioxygénase à l'aide d'une électrode à oxygène. Cette méthode permet de maintenir l'activité enzymatique des protéines sensibles à l'oxygène.

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Nous tenons à remercier le Dr Camille Keller de l’Université wesleyenne pour le support technique. Merci professeur Lindsay D. Eltis et Jenna K. Capyk de l’Université de la Colombie-Britannique, ainsi que Christian Whitman de l’Université du Texas à Austin, pour leurs conseils concernant les méthodes de purification des protéines anaérobie et l’utilisation d’un O2 -électrode sensible.

Les auteurs ont pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Les étapes critiques dans l’obtention de protéines DesB active purifiée impliquent la formation et le maintien du site actif réduit Fe (II) de l’enzyme. Ainsi, corriger les performances de l’induction, la purification, la concentration, et dessalement étapes sont essentielles à l’obtention d’enzyme active avec succès. Induire l’expression de la protéine en présence de 1 mM de sulfate d’ammonium ferreux assure que Fe (II) est correctement incorporé dans le site actif du DesB. Cette méthode s’inspire des études comme celle...

Les enzymes qui utilisent le fer ou autres métaux pour activer l’oxygène sont souvent sensibles à l’inactivation au cours du processus de purification en raison de leur éloignement de l’environnement réducteur d’une cellule. Par conséquent, ces protéines doivent servir de lysats cellulaires, être soumis à des agents réducteurs externes ou être purifiés par voie anaérobie pour s’assurer qu’ils ont une activité enzymatique optimale1,2,3,4. Pour ces enzymes qui sont sensibles à l’oxygène (enzymes contenant du fer plus précisément), effectuer toutes les étapes de purification et caractérisation tout en maintenant des conditions anaérobies est nécessaire pour caractériser complètement à eux. Cela a conduit les chercheurs à élaborer des montages tout laboratoire dans l’enceinte des chambres anaérobies d’études allant de l’expression de la protéine par cristallographie5,6,7,8 .
Dans les présentes, nous rapportons les méthodes d’épuration anaérobie et caractérisation cinétique de l’enzyme DesB à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. DesB est une dioxygénase gallate de la bactérie Sphingobium SP. souche SYK-6 qui est lié à LigAB, une dioxygénase protocatecuate partir du même organisme. Les deux enzymes appartiennent à la superfamille des dioxygénase (DGPAM) protocatéchuate de type II qui n’a pas été étudiée date9, probablement en partie due à des enzymes de cette superfamille sont sensibles à l’inactivation quand purifié à l’aide de la norme aérobique méthodes de purification des protéines. Puisque certains enzymes DGPAM affichent promiscuité de substrat, tandis que d’autres sont spécifiques à substrat2,10, plus loin la caractérisation de cette superfamille est nécessaire d’identifier les déterminants de la spécificité. Comme a été observée dans plusieurs enzymes super-familles11,12,13,14,15, petites molécules peuvent modifier l’activité par l’intermédiaire de l’inhibition compétitive directe ou la liaison de molécules à séparer les poches allostériques qui provoque une augmentation ou diminution de l’activité enzymatique16. Alors que la cinétique seul ne peut pas différencier l’emplacement de la reliure d’un modulateur, l’amplitude d’un changement d’activité est important pour comprendre les effets. En tant que telles, méthodes de caractérisation cinétique du DesB native et son activité en présence de 4-nitrocathécol (4NC), un composé utilisé couramment pour caractériser et inhiber dioxygénase enzymes2,17, 18, sont indiqués.
DesB est capable de décomposer gallate, un composé, via une réaction de dioxygénase (EDO) extradiol dans quel anneau ouverture est catalysée par l’oxygène comme l’un des substrats10,19d’aromatique dérivés de la lignine. Cette réaction enzymatique se produit dans le cadre de la décomposition de la lignine, un hétéropolymère aromatique se trouvée dans la paroi cellulaire des plantes. La lignine peut être dépolymérisée, produisant une variété de composés aromatiques qui peut être subdivisée en métabolites central3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygénases (EDO) catalysent un anneau ouverture réaction dihydroxylé de composés aromatiques, où clivage se trouve en bordure d’un diol métal coordonnés ; en revanche, intradiol dioxygénases clivent les composés aromatiques analogues entre les deux groupes hydroxyle (Figure 1). ADE, comme de nombreux autres métalloenzymes, ont un centre métallique divalent pour coordination Fe (II) composé d’un deux-histidine, un-carboxylate triade9,34,35. Ces métalloenzymes devient oxydés, par autooxydation ou axée sur le mécanisme d’inactivation, alors que l’enzyme est rendu inactif2,36,37,38.
Dans les procédures expérimentales décrites dans ce manuscrit, nous utilisons le DesB, un membre de la superfamille DGPAM de la bactérie Sphingobium SP SYK-6, à catalyser l’apport d’oxygène à travers la liaison de C4-C5 de gallate d’Epigallocatechin (Figure 2 a). La régiochimie de ce clivage est analogue à LigAB, qui est une protocatéchuate-4,5-dioxygénase (Figure 2 b). Jusqu’ici, enquêtes de cette dioxygénase gallate n’incluent aucun signalement de composés qui inhibent le DesB10,19,,39. Avec l’utilisation des méthodes de purification aérobie, DesB a manifesté une activité variable, alors qu’avec l’utilisation de méthodes anaérobies, nous avons pu obtenir régulièrement les protéines à activité reproductible. Les études cinétiques décrites ici montrent les méthodes d’épuration anaérobie du DesB, caractérisation cinétique de la réaction du DesB avec gallate et l’inhibition du DesB par 4-nitrocathécol (4NC).

<table><tbody><tr><td>Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranodise</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>N,N’tétraméthyl-éthylènediamine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Résine amylose à haut débit</td><td>New England Biolabs</td><td>E8022S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) cellules Escherichia coli compétentes</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>L-cystéine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>acide gallique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>4-nitrocatéchol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N15553</td><td></td></tr><tr><td>Ferreux sulfate d’ammonium</td><td>Mallinckrodt</td><td>5064</td><td></td></tr><tr><td>Dithionite de sodium</td><td>Alfa Aesar</td><td>33381-22</td><td></td></tr><tr><td>bouteilles de sérum de blé</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-406G</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Acrodisc PF Seringue Filtre avec membrane Supor</td><td>Pall Corportation</td><td>4187</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Amicon Concentrateur de cellules agitées</td><td>EMD Millipore</td><td>UFSC40001</td><td></td></tr><tr><td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa filtre à membrane cellulosique reconstituée</td><td>EMD Millipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 colonne de salage grossier</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0033-01</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Flacons à sertir</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-38</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus Unité de contrôle d’électrode</td><td>Hansatech Instruments</td><td>OXYG1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’électrode d’oxygène</td><td>Hansatech Instruments</td><td>DW1</td><td></td></tr><tr><td>Disque d’électrode</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0.0125 mmX25mm) Bobine de 30m</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage d’électrodes</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S16</td><td></td></tr><tr><td>Papier d’espacement</td><td>Zig Zag</td><td>disponible dans n’importe quelle station-service</td><td></td></tr><tr><td>He-series Dri-Lab</td><td>boîte à gants Vacuum/Atmospheres Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HE-493 Dri-Train</td><td>Vacuum/Atmospheres Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatule en acier inoxydable micro-conique à double extrémité</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td><td>Fisher Scientific</td><td>k420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu ; L, modèle 701 N SYR, cimenté NDL 26s ga, 2 po, point stlye 2 seringue</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420401-1505</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex-C5 homogénéisateur haute pression</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-PER Réactif complet d’extraction de protéines bactériennes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89821</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme à partir d’un blanc d’œuf de poule</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12650-88-3</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7177-48-2</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>de sodiumFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G46-500</td><td></td></tr></tbody></table>

purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’inhibition et l’activité desb dioxygenase

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Les protéines sensibles à l’oxygène, y compris ces enzymes qui utilisent l’oxygène comme substrat, peuvent ont réduit stabilité lorsque purifiée à l’aide de méthodes traditionnelles de purification aérobie. Ce manuscrit montre les détails techniques impliqués dans le processus de purification anaérobie, y compris la préparation des tampons et réactifs, les méthodes de chromatographie sur colonne dans une boîte à gants et le dessalement de la protéine avant cinétique. Également décrites sont les méthodes pour la préparation et à l’aide d’une électrode à oxygène pour effectuer la caractérisation cinétique d’une enzyme utilisant l’oxygène. Ces méthodes sont illustrées à l’aide de l’enzyme dioxygénase DesB, une dioxygénase gallate de la bactérie Sphingobium SP. souche SYK-6.

L’analyse de gel SDS-PAGE des différentes fractions de purification de la construction de fusion DesB-maltose binding protein (MBP) (Figure 3) est présentée. Le gel révèle que la protéine est pure (MW = 91,22 kDa), à l’exception de la présence du DesB (MW = 49.22 kDa) et domaine de protéine MBP (42 kDa) clivé les uns des autres. Fractions E2 et E3 ont été sélectionnés pour la concentration (étape 4.2).
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Nous présentons ici un protocole pour la purification de protéine anaérobie, la concentration de protéines anaérobie et ultérieure caractérisation cinétique à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. La méthode est illustrée à l’aide de l’enzyme DesB, une enzyme dioxygénase qui est plus stable et plus active lorsque purifié et stockées dans un environnement anaérobie.

Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Cette méthode est conçue pour répondre aux questions clés dans le domaine de la biochimie inorganique, sur la façon de maintenir l’activité enzymatique dans les protéines qui contiennent des métaux sensibles à l’oxygène. Le principal avantage de cette technique est qu’elle vous aide à visualiser les façons dont vous pouvez maintenir le métal d’une protéine dans son état réduit. En général, les personnes nouvelles à cette technique auront du mal parce qu’il est difficile d’entretenir les matériaux et les réagéteurs pour être complètement anaérobie.24 heures après avoir induisant l’expression de protéine, recueillez les cellules par centrifugation, et résuspendez la pastille bactérienne de cellules dans 20 millilitres de tampon de colonne d’amylose par 1.5 litres de croissance. Ajouter un milligramme de lysozyme à la suspension cellulaire et remuer les cellules pendant 20 minutes sur la glace. À la fin de l’incubation, lyse la solution cellulaire résuspendue par homogénéisation à haute pression avec trois à cinq passages à environ 15 000 psi, et transférer la protéine dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres.Rincer l’espace libre avec de l’azote pendant une minute, et centrifuger

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