Fabrication d’un Hydrogel de dérivés de matrice extracellulaire rein Cortex

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des biomatériaux, telles que la façon dont les interactions de matrice cellulaire affectent le sulfate. Le principal avantage de cette technique est qu’elle génère le premier matériau qui reflète avec précision les micro-environnements biochimiques du cortex rénal indigène. Tapisser une capuche de culture tissulaire d’un sous-coussin.

Placez un bécher d’un litre contenant une barre d’agitation, un plat stérile de culture de tissu de 150 millimètres, et le rein entier dans le capot. Remplissez le bécher avec 500 millilitres de solution SDS à 1%. Placez le rein dans le plat stérile de culture des tissus.

Retirer toute la graisse périrénale en se rasant légèrement autour de la capsule rénale à l’intérieur d’un scalpel. Ensuite, faire une incision peu profonde de huit à 10 centimètres à travers l’extrémité supérieure du rein, pour briser ouvrir la capsule rénale sans endommager le tissu du cortex sous-jacent. Utilisez deux pinces d’hémostat pour enlever la capsule rénale en l’épluchant loin du tissu du cortex.

Couper le rein en deux le long du plan coronal en utilisant le scalpel le long du côté latéral du rein. Isoler le tissu du cortex des deux moitiés en découpant la région médullaire avec le scalpel. Ensuite, couper le tissu du cortex en morceaux en cubes de 0,5 centimètre, et enlever tous les grands vaisseaux visibles.

Pour isoler la matrice extracellulaire du rein, placez le tissu du cortex en dés dans le bécher contenant la solution SDS. Couvrir le bécher de papier d’aluminium autoclavé et le placer sur une plaque de remue-remous à environ 400 RPM, à l’extérieur du capot de culture tissulaire. Après 24 heures d’agitation, amener le bécher dans une hotte de culture tissulaire.

Ajouter une passoire stérile à cellules de 40 microns faite de maille de nylon. Et puis, remplissez un bécher séparé de 1000 millilitres avec 200 millilitres d’eau de Javel, et placez-le dans le capot de culture tissulaire. Disposer de la solution SDS par la passoire cellulaire, dans le bécher contenant de l’eau de Javel.

Pipet toute solution SDS restante, jusqu’à ce que seuls les tissus décellulaires et la passoire cellulaire restent dans le bécher. Laissez la passoire cellulaire dans le bécher et ajoutez 500 millilitres de solution SDS fraîche. Couvrir le bécher avec la même feuille d’aluminium et placer sur une plaque de remue-glace à la même vitesse qu’auparavant.

Après la décellularisation et le lavage, transférer le tissu décellulaire, appelé ECM rénal à partir de ce point, dans un tube conique autoportant de 30 millilitres. Et remplissez-le avec de l’eau de qualité de culture cellulaire, jusqu’à ce que tout le tissu soit submergé. Tout d’abord, utilisez un homogénéisateur tissulaire pour homogénéiser l’ECM rénal dans le tube conique pendant deux minutes, jusqu’à ce qu’une solution opaque sans morceaux visibles d’ECM soit obtenue.

Ensuite, submergez le tube conique contenant l’ECM rénal dans de l’azote liquide jusqu’à ce que l’ébullition entourant le tube ne persiste plus. Conservez l’ECM rénal à moins quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour lyophiliser le tissu décellularisé congelé, relâchez légèrement le bouchon du tube conique pour permettre l’échange de gaz et placez le tube dans une machine de lyophilisation.

Lyophiliser le rein ECM pendant trois jours, ou jusqu’à ce qu’il ressemble à une fine poudre blanche. Pour digérer chimiquement et solubiliser le gel, ajouter la pepsine gastrique porcine soigneusement pesée, et 0,01 acide chlorhydrique normal à une vile scintillation contenant une barre de remue-glace. Remuer à environ 500 RPM, jusqu’à ce que toute la pepsine soit dissoute.

Ensuite, transférer le rein lyophilisé ECM à la scintillation vile et laisser la solution sur une plaque de remous à environ 500 RPM pendant trois jours pour faire le rein stock ECM hydrogel. Dans une hotte de culture tissulaire, pipet les volumes requis de médias de culture cellulaire, un hydroxyde de sodium normal et M199 supplément, dans un stérile 30 millilitres tube conique autoportant. Mélanger la solution neutralisante de reagent avec une micro spatule.

Utilisez une seringue stérile d’un millilitre pour transférer le volume approprié d’hydrogel ECM de rein de stock à la solution neutralisante de reagent. Utilisez une micro spatule pour mélanger doucement la solution jusqu’à ce qu’une solution hydrogel homogène soit obtenue. Évitez d’introduire des bulles d’air en remuant lentement et doucement.

Pour incorporer des cellules dans le rein ECM hydrogel, résuspendez trois cent mille cellules dans 10 microlitres de milieu pour chaque hydrogel. Pipet 10 microlitres de suspension cellulaire dans le gel final ecm rein. Remuer la solution à l’aide d’une micro spatule jusqu’à ce que les cellules soient réparties uniformément.

Utilisez une seringue d’un millilitre pour remplir le dispositif de culture cellulaire désiré avec le rein ECM hydrogel. Laissez le gel se fixer à 37 degrés Celsius pendant une heure avant de transférer ou de placage les cellules sur le rein ECM dans le dispositif de culture cellulaire. L’analyse du tissu décellulaire de cortex par spectrométrie de masse, a indiqué la présence des protéines liées au lamina de basilic, avec le collagène-IV et le collagène-I étant les plus fortement représentés.

Les chaînes Collagène-IV, A1 et A2, omniprésentes dans toutes les membranes du sous-sol, ont été conservées. Des chaînes de collagène-IV, D’A3 et d’A5, présentes seulement dans les membranes de sous-sol du glomerulus, ont également été détectées. Des formes communes d’iso de Laminins et de Collagène-I ont été également détectées.

Les cellules endothéliales microvasculaires péritubulaires de rein humain, ou HKMECs, cultivés sur le collagène-I, l’ECM de rein, et un gel de mélange 1:1, ont montré des différences dans le phénotype. HKMECs cultivés sur Collagène-I, affiché uniforme CD31 expression, vu en rouge. Tandis que les HKMECs ont cultivé sur les deux gels contenant l’ECM de rein, ont montré l’expression réduite de CD31 dans les distributions inégales.

Le type de matrice ne semble pas affecter l’expression vwf, montrée en vert. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’homogénéiser complètement le tissu décellulaire de cortex de rein. En outre, lorsque vous mélangez le gel avec des reagents neutralisants, éviter l’introduction de bulles d’air.

Les micro-systèmes physiologiques permettent l’étude de la fonction des organes en laboratoire contrôlé. La création de tels systèmes nécessite la mise en œuvre de cellules, de matrices et de stimuli. L’hydrogel kECM fabriqué ici, nous permettra d’étudier ces systèmes qui récapitulent les micro-environnements rénaux.