Name: Détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Découvrez une méthode robuste pour détecter et isoler les corps apoptotiques avec une pureté élevée en utilisant la cytométrie en flux et la centrifugation différentielle. Ce protocole permet d'étudier les mécanismes cellulaires de l'apoptose.

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Cela a fonctionné a été pris en charge par des subventions de santé nationale et Conseil de recherches médicales (GNT1125033 et GNT1140187) et Australian Research Council (DP170103790) à I.K.H.P.

1. l’induction de l’apoptose
<ol><li>Centrifuger les échantillons de cellules à 300 g pendant 5 min et jeter le surnageant pour enlever les débris de cellules préexistantes. Remarque : Lorsque vous utilisez les cellules adhérentes, cellules des graines à l’avance et laver avec 1 x solution tamponnée au phosphate (PBS) avant l’induction de l’apoptose.</li>
	<li>Déterminer le nombre de cellules et de prélever des cellules. Remarque : Selon l’isolement après test, nous recommandons un numéro de cellulaire de départ d’au moins 1 x 107 cellules.</li>
	<li>Resuspendre dans les médias (respectif milieu contenant du sérum de veau foetal de 10 % (vol/vol), 50 UI/mL de pénicilline, 50 µg/mL de mélange de streptomycine) pour une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Aliquote ~ 2 x 106 cellules / puits d’une plaque 6 puits.</li>
	<li>Pour induire l’apoptose, retirez le couvercle de la plaque et irradier les cellules à 150 mJ/cm2 , à l’aide d’un irradiateur UV. Cela devrait prendre environ 30-60 s. Remarque : Avant l’irradiation, assurez-vous que ~0.5 x 106 cellules sont conservées pour le contrôle de cellule « Broussaille ». Remarque : L’apoptose peut également être induite via d’autres méthodes telles qu’anti-SAF ou sérum famine6.</li>
	<li>Incuber à 37° C, 5 % de CO2 pour 2 à 8 heures, selon la lignée cellulaire.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope optique haut banc, visualiser les cellules afin de confirmer la présence d’apoptose morphologies, telles que blebbing et apoptopodia formation ApoBD formation. Remarque : 40 X grossissement est suffisant</li>
	<li>À l’aide d’une pipette P1000, pipette et prélever des échantillons de l’apoptose.</li>
	<li>Laver la plaque avec du PBS 1 x et se combinent avec l’échantillon restant afin d’assurer un rendement maximal.</li>
	<li>Frais virés ~1/10th pour « Tout Apoptotic l’échantillon » (de Windows WAS) contrôler.</li>
	<li>Recueillir l’échantillon « Non traitée ».</li>
	<li>Centrifuger les échantillons WAS tant broussaille à 3 000 x g pendant 6 min.</li>
	<li>Remettre en suspension dans 1 mL de PBS 1 x et mis de côté sur la glace.</li>
	<li>Pour ApoBD isolement, continuent à chaque étape 2 ou 3 avec l’échantillon restant d’apoptotic.</li>
</ol>2. ApoBD Isolation via FACS
<ol><li>Centrifuger l’ensemble de l’échantillon à 3 000 x g pendant 6 min.</li>
	<li>Enlever la majorité du liquide surnageant sans déranger le culot.</li>
	<li>Remettre en suspension dans une solution colorante contenant 1 mL de tampon de liaison x A5 1, 75 µL de A5-FITC et 2 µL de TO-PRO-3 par 1 x 107 cellules.</li>
	<li>Incuber les échantillons dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter 1 à 2 mL de tampon de liaison 1 x A5 et centrifuger échantillon à 3 000 x g pendant 6 min enlever tache excédentaire. Remarque : Pour les populations de cellules mixtes ou des échantillons de tissus, effectuer un anticorps coloration étape en utilisant une combinaison de marqueurs spécifiques à un type de cellule dans 1 tampon de liaison x A5 et incuber sur la glace pendant 20 min (ou selon le protocole du fabricant) avant la centrifugation à 3 000 x g pendant 6 min.</li>
	<li>Resuspendre le culot d’échantillon dans 3 mL de tampon de FACS (PBS 1 x, 1 tampon de liaison x A5, 10 % FSC, 2 mM EDTA) par 1 x 107 cellules.</li>
	<li>Filtrer à travers un tamis de cellule 70 µm dans un fond rond, tube en polypropylène (cytométrie en flux) et conserver les échantillons sur la glace et dans l’obscurité.</li>
	<li>Allumez la machine FACS et effectuer standard mis en place à l’aide d’une buse de 100 µm, effectuer le délai de chute et assurer un flux stable.</li>
	<li>Charger l’échantillon, puis affectez-lui ~ 1000 événements/s de vitesse d’acquisition.</li>
	<li>Ajuster la FSC, SSC, APC (a-PRO-3) et des tensions FITC (A5) et positionner les événements dans les parcelles de FACS pour s’assurer que les populations peuvent être clairement séparées.</li>
	<li>Enregistre les 20 000 événements.</li>
	<li>Mettre en place une stratégie de blocage que dans la partie 4.</li>
	<li>Dans la disposition de la sorte, ajouter la dernière porte de ApoBD que la population de tri désirée.</li>
	<li>Commencer à acquérir de l’échantillon et effectuer une sorte de test en recueillant 5 000-10 000 ApoBDs dans un nouveau tube contenant ~ 250 µL de tampon de FACS.</li>
	<li>Effectuer un système de retour de chasse et charge tri ApoBDs.</li>
	<li>Acquérir et enregistrer test-tri ApoBDs.</li>
	<li>Vérifiez que la pureté de ApoBD est ~ 99 % en comparant FSC (axe y) vs A5 (événements de l’axe des abscisses). NOTE : A5 coloration peut réduire légèrement lors de ré-analyser les échantillons en raison de laser de blanchiment.</li>
	<li>Lorsqu’on atteint haute pureté, charger l’échantillon original et continuer jusqu'à ce que le nombre désiré de ApoBDs a été obtenu de tri. Remarque : Si nécessaire, double tri peut être effectuée afin d’isoler en même temps ApoCells et ApoBDs. Remarque : Lors du tri sur une longue période de temps, nous recommandons d’incubation le tube de prélèvement à 4 ° C.</li>
	<li>Une fois que le tri est terminé, recueillir une petite portion de post-tri ApoBDs, trier après ApoCells, broussaille et WAS pour valider l’apoptose et confirmer post-tri pureté. Remarque : Bien que le tri test et pureté post-tri ne devraient pas significativement, c’est basé sur les paramètres de flux et de la stabilité.</li>
</ol>3. ApoBD Isolation par Centrifugation différentielle
<ol><li>Centrifuger l’échantillon apoptotic restant à 300 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Récupérer le surnageant, en laissant environ 500 µL pour ne pas perturber le culot cellulaire et ajouter dans un nouveau tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Retirer le reste 500 µL et Resuspendre le culot dans 2 mL de PBS 1 x (ce qui représente la « fraction enrichie en ApoCell ».</li>
	<li>Centrifuger le liquide surnageant collecté pendant 20 min à 3 000 g.</li>
	<li>Recherchez une boulette et retirer délicatement le surnageant (le surnageant peut contenir de petites vésicules extracellulaires, y compris des microvésicules et exosomes).</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS 1 x (ce qui représente la fraction enrichie « ApoBD »)</li>
	<li>Collecter 100 µL de chaque viabilisé, les WAS, enrichie en ApoCell et les échantillons enrichis ApoBD dans un nouveau fond rond, tube de polystyrène (cytométrie en flux).</li>
	<li>Ajouter 100 µL de tache contenant 2 x A5 tampon de liaison au 1/100 A5-FITC et 1 : 1 000 a-PRO-3</li>
	<li>Incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Analyser des échantillons par cytométrie en flux, à l’aide de la stratégie de blocage comme décrit ci-dessus pour valider la succès induction de l’apoptose et la pureté de la fraction enrichie en ApoBD.</li>
</ol>4. cytométrie Gating stratégie
<ol><li>Plot TO-PRO-3 (axe y) contre FSC (axe x) pour séparer les cellules nécrotiques (a-PRO-3élevé) de tous les autres événements non-perméabilisées (a-PRO-3faible ou intermédiaire).</li>
	<li>Sélectionnez tous les événements non-perméabilisées et tracer les SSC contre A5. Porte deux populations dont la population (P1), SSCintermédiaire/haut, A5faible ou intermédiaire piles 1 et 2 (P2), tous les autres événements.</li>
	<li>Dans P2, plot TO-PRO-3 contre A5 et sélectionnez événementsintermédiaires/haut A5 d’exclure tous les débris cellulaires.</li>
	<li>Sélectionnez tous les événements positifs de l’A5 et tracer FSC contre A5. Séparer (FSCfaible) ApoBDs de ApoCells (moyen/hautFSC). Remarque : Lors de l’ouverture de porte ApoBDs pour ApoBD d’isolation via l’approche axée sur les FACS, nous recommandons une dernière étape en sélectionnant ApoBDs et comparant a-PRO-3 en A5, tous les événements. Cela garantit que la porte de tri finale utilise fluorescence plutôt que des paramètres FSC/SSC.</li>
	<li>Pour l’analyse des cellules viables, sélectionnez P1, puis effectuez l’une des deux stratégies de blocage. Pour une analyse générale de cellules viables, intrigue FSC contre A5 et sélectionner toutes les cellules demoyen/haut FSC, donc enlever les débris de cellules restants. Sinon, pour une analyse approfondie, des cellules viables peuvent être séparés du A5– ApoCells précoce et en a-PRO-3 contre FSC. Select TO-PRO-3faible, cellules viables de la FSCintermédiaire/haut et TO-PRO-3intermédiaire, FSCintermédiaire/haut A5– ApoCells précoce.</li>
</ol>

<ol><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+the+Dying%3A+Mechanisms+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions.</a> Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).</li>
<li>Tixeira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+morphologic+features+and+products+of+cell+disassembly+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%3A+An+International+Journal+on+Programmed+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis.</a> Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).</li>
<li>Sebbagh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-mediated+cleavage+of+ROCK+I+induces+MLC+phosphorylation+and+apoptotic+membrane+blebbing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing.</a> Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).</li>
<li>Coleman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+blebbing+during+apoptosis+results+from+caspase-mediated+activation+of+ROCK+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I.</a> Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+generating+extracellular+vesicles+during+apoptosis+via+a+beads-on-a-string+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure.</a> Nature Communications. 6, 7439(2015).</li>
<li>Poon, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+link+between+an+antibiotic%2C+pannexin+channels+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis.</a> Nature. 507, 329-334 (2014).</li>
<li>Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+microtubules+in+apoptotic+chromatin+dynamics+and+cellular+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation.</a> Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).</li>
<li>Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+basic+biological+phenomenon+with+wide-ranging+implications+in+tissue+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.</a> British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).</li>
<li>Witasp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+over+troubled+water%3A+milk+fat+globule+epidermal+growth+factor+8+promotes+human+monocyte-derived+macrophage+clearance+of+non-blebbing+phosphatidylserine-positive+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells.</a> Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).</li>
<li>Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinase+regulates+fragmentation+and+phagocytosis+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells.</a> Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).</li>
<li>Holmgren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+transfer+of+DNA+by+the+uptake+of+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies.</a> Blood. 93, 3956-3963 (1999).</li>
<li>Zernecke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-126+by+apoptotic+bodies+induces+CXCL12-dependent+vascular+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection.</a> Science Signaling. 2, ra81(2009).</li>
<li>Schiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigens+are+translocated+into+small+apoptotic+bodies+during+early+stages+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis.</a> Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).</li>
<li>Elamin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+the+Sonic+Hedgehog+signaling+pathway+and+triggers+apoptosis+in+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells.</a> Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).</li>
<li>Sagulenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIM2+and+NLRP3+inflammasomes+activate+both+apoptotic+and+pyroptotic+death+pathways+via+ASC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles%3A+apoptotic+bodies%2C+microvesicles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Turiak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+thymocyte-derived+microvesicles+and+apoptotic+bodies+in+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice.</a> Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).</li>
<li>Berda-Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation+of+endothelial+cell-derived+apoptotic+bodies+is+mediated+by+interleukin-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).</li>
<li>Lleo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomics%3A+identification+of+unique+protein+profiles+of+apoptotic+bodies+from+biliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells.</a> Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cell+type-specific+apoptotic+bodies+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting.</a> Scientific Reports. 7, 39846(2017).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+contents+and+cell+origins+of+apoptotic+bodies+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7, 14444(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Depuis sa première description dans les années 1950, le domaine de l’apoptose a progressé nettement, devenir un domaine de recherche important. Malgré l’intérêt général et des efforts considérables, certains aspects de l’apoptose, en particulier la formation d’ApoBDs, n’ont pas été bien étudiés en raison de l’absence de méthodologies appropriées. Citons notamment la limitation dans le suivi de la progression de l’apoptose et de la formation de ApoBD simultanément à l’aide de la cytométrie en flux traditionnels analyse A5...

L’apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, bien étudiée est nécessaire pour maintenir l’homéostasie physiologique et éliminer les cellules potentiellement nocifs dans le corps humain1. Après l’induction de l’apoptose, cellules apoptotiques (ApoCells) peuvent subir une série de changements morphologiques et démonter dans petites vésicules membranaires appelées ApoBDs. Dans l’ensemble, ce processus est connu comme le démontage de cellules apoptotiques et peut être divisé en 3 étapes distinctes, basées sur la morphologie2,3. Étape 1 (membrane plasmique blebbing) se caractérise par la formation de structures ressemblant à des ballons sur la surface des cellules appelées bulles4,5. Étape 2 (formation de protrusion apoptotiques) comprend la formation de protrusions membranaires longue comme apoptopodia, apoptopodia-perles et microtubules pointes6,7,8. Enfin, étape 3 (formation ApoBD) comprend la fragmentation des protubérances apoptotic et/ou ApoCells pour générer ApoBDs6,9. Résultats antérieurs ont suggéré un rôle de ApoBDs en facilitant le dégagement de cellules apoptotiques et médiation communication intercellulaire. Par exemple, il est proposé que la fragmentation d’un ApoCell en ApoBDs peut produire des petits morceaux de « petits » qui pourrait être facilement enlevés en entourant les phagocytes2,10,11. En outre, ApoBDs pourrait contenir une série de molécules comme l’ADN, l’ARN et des protéines qui peuvent être victimes de la traite aux cellules environnantes afin de faciliter la communication de cellule-cellule12,13,14. Pour fonctionnellement étudier ces processus, il est essentiel de confirmer trois paramètres clés, y compris (i) la validation d’induction de l’apoptose et de la formation de ApoBD, (ii) l’isolement du ApoBDs et (iii) la confirmation de la pureté de la ApoBD.
Auparavant, un certain nombre de méthodes, y compris cytométrie de flux et de microscopie électronique ont été utilisé pour étudier l’apoptose et ApoBDs15,16,17,18. Cependant, ApoBD détection et quantification sont souvent difficiles, voire négligé. Par exemple, l’apoptose plus couramment utilisé d’axée sur la cytométrie en flux dosage emploie annexine V (A5, une protéine qui se lie l’externalisés ' manger-me' signal phosphatidylsérine (PtdSer)) et l’acide nucléique stain (PI) de l’iodure de propidium19. Cependant, en utilisant cette combinaison universelle tache, analyse suppose qu’il y a seulement trois types de sous-ensembles de cellules (cellules viables, ApoCells et cellules nécrosées) dans l’échantillon. En outre, bien que considéré comme « un étalon-or » par de nombreux chercheurs de l’apoptose, des analyses de cytométrie en flux et l’analyse ultérieure des données exclut souvent ApoBDs par une première étape de blocage en sélectionnant les événementsintermédiaires-haute FSC/SSC. Par conséquent, nous avons récemment mis au point un essai de cytométrie en flux roman A5 et TO-PRO-3, une autre tache d’acides nucléique qui peut être sélectivement absorbé par la caspase 3/7-activé pannexine 1 (PANX1) canaux7,20. Comme les caspases induite par 3 PANX1 activation précède PtdSer exposition aux premiers stades de l’apoptose, TO-PRO-3 taches différentiellement apoptotiques et nécrotiques cellules. En outre, cette approche combinée avec notre roman gating stratégie inclut des événements tout acquis au cours de l’analyse des données et ainsi, six des sous-ensembles de cellule/particule sont identifiés, notamment : (i) des cellules viables (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5faible , TO-PRO-3faible), (ii) A5– ApoCells précoce (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5basse, TO-PRO-3intermédiaire), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5haute , TO-PRO-3intermédiaires), les cellules nécrotiques (iv) ou ApoCells fin (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5haute, TO-PRO-3élevé), (v) ApoBDs (FSC/SSCfaible, A5intermédiaire, TO-PRO-3faible / intermédiaires) et (vi) débris (FSC/SSCfaible, A5basse, TO-PRO-3bas)20. Notre approche met l’accent sur l’importance d’analyser tous les sous-ensembles de cellules/particules et, plus important encore, la séparation des ApoBDs des cellules et des débris de20. Ainsi, cette approche montre une technique efficace pour valider l’induction de l’apoptose et ApoBD formation en même temps.
Traditionnellement, les ApoBDs ont été isolés par le biais de diverses méthodes de centrifugation différentielle par laquelle ApoBDs peut être séparé de cellules ou d’autres vésicules extracellulaires basés sur la densité. Cependant, ces méthodes de centrifugation sont souvent limités par la pureté de la ApoBD faible, absence d’une étape de quantification pour confirmer la pureté de l’échantillon, et/ou incapacité à séparer les cellules spécifiques au type ApoBDs17,21,22. Par conséquent, nous avons récemment développé deux approches, une base de FACS et une nouvelle approche axée sur la centrifugation différentielle peut être couplée à notre méthode de cytométrie en flux précédemment établie pour valider l’induction de l’apoptose et échantillon de pureté23. ApoBD isolation grâce à notre approche axée sur les FACS peut enrichir ApoBDs jusqu'à 99 % de pureté et peut être couplée avec une variété d’anticorps spécifiques à un type cellulaire à isoler ApoBDs des populations de cellules mixtes, les échantillons de tissus et les fluides corporels,23. En outre, notre approche révisée de centrifugation différentielle démontre une méthode efficace pour isoler ApoBDs à > 90 % pureté23.
Dans cet article, nous décrivons en détail notre procédure expérimentale afin de valider l’induction de l’apoptose et détecter et quantifier la formation ApoBD. Les flux de travail de ApoBD d’isolation à l’aide de méthodes centrifugation différentielles et axés sur les FACS est également élaborés et comparés. Les données représentatives démontrent que la méthodologie décrite fournit un outil de pointe efficace pour de futures études de ApoBD.

<table><tbody><tr><td>Cellules, par exemple monocytes humains THP-1 en culture (numéro de clone : TIB-202)</td><td>ATCC-RPMI</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Mélange pénicilline-streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FSC</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>BD </td><td></td> Bioscience-TO-PRO-3 <td></td></tr><tr><td>iodure</td><td>Life Technologies</td><td>T3605</td><td>TO-PRO-3 peut provoquer des irritations cutanées, oculaires et respiratoires. Évitez tout contact direct.</td></tr><tr><td>10x Tampon de liaison Annexine V</td><td>BD Bioscience</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001710526</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger (15 mL)</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tube à microcentrifuger (1,5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture tissulaire (37 &deg ; C, 5 % CO2)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III Cytomètre en flux, configuré avec deux lasers pour la détection FITC et APC</td><td>Cytomètre en flux BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Canto II, configuré avec deux lasers pour la détection FITC et APC</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Diva 6.1.1 logiciel</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel FlowJo 8.8.6</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Corps apoptotiques (ApoBDs), les microvésicules et les exosomes sont les principaux membres de la famille de vésicule extracellulaire, avec ApoBDs étant un des plus grand type. Il a été proposé que les ApoBDs peuvent aider clairance cellulaire ainsi que communication intercellulaire via trafic biomolécules. Les approches conventionnelles utilisées pour l’identification et l’isolement des ApoBDs sont souvent limités par l’absence de quantification précise et pureté de l’échantillon faible. Nous décrivons ici un flux de travail pour confirmer l’induction de l’apoptose, valider la formation ApoBD et isoler ApoBDs à haute pureté. Aussi nous décrire et comparer cellule activée par fluorescence triant (FACS) et les approches de centrifugation différentielle basée à isoler ApoBDs. En outre, la pureté des ApoBDs isolées sera confirmée en utilisant un préalablement établir écoulement cytometry-base coloration et méthode d’analyse. Pris ensemble, à l’aide de l’approche décrite, THP-1 monocyte apoptose et apoptose cellulaire démontage a été induite et validé, et ApoBD provenant des monocytes THP-1 ont été isolés à une pureté de 97 à 99 %.

En utilisant la procédure décrite ici, apoptose des monocytes THP-1 a été induite et ApoBDs ont été détectés et isolés via une base de FACS ou une approche de centrifugation différentielle (Figure 1). Tout d’abord, l’apoptose a été induite par l’irradiation UV et échantillons ont été prélevés après 2-3 h d’incubation quand exposé de cellules apoptotiques morphologies, incluant blebbing, formation de protrusion membranaire apoptotic et la génération de ApoBDs<...

Un flux de travail par écoulement cytometry ou prime de centrifugation est conçu pour détecter, quantifier et isoler les corps apoptotiques d’un échantillon d’apoptotic à haute pureté.

Détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

L’objectif global de ce protocole est de détecter et d’isoler les corps apoptotiques à une grande pureté. Les corps apoptotiques sont un type de vésicules extracellulaires générées pour aider à l’induction de l’hématose. Ils constituent le plus grand type de famille physique extracellulaire, allant généralement d’un à cinq micromètres de diamètre.Il devient maintenant évident que les corps apoptotiques peuvent aider les processus cellulaires, tels que la clairance cellulaire apoptotique et la communication intracellulaire. Par conséquent, le développement d’une méthodologie précise pour détecter, quantifier et isoler les corps apoptotiques est essentiel pour la personnalisation de leurs fonctions et mécanismes. Dans cette série de recherches, nous allons vous montrer comment détecter, quantifier et isoler les corps apoptotiques à partir d’échantillons apoptotiques.Partie A, l’induction de l’apoptose. Pour induire l’apoptose dans les lignées cellulaires, telles que les monocytes THB1, commencez par collecter les cellules. Comptez les cellules et collectez environ 10 millions de cellules ou au besoin.Nous recommandons 10 millions pour l’analyse des corps apoptotiques. Allouer deux mi

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Une méthode précise pour l'évaluation de la mort cellulaire est décrite. Le protocole améliore conventionnels annexine V / iodure de propidium (PI) des protocoles, qui affichent jusqu'à 40% de faux positifs des événements dans des lignées cellulaires et cellules primaires à partir d'un large éventail de modèles animaux.

Mise à jour annexine V / propidium Assay apoptose iodure permettant une évaluation précise de la mort cellulaire

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Surveillance clivées activité caspase-3 et l&#39;apoptose des cellules immortalisées oligodendrocytaires utilisant imagerie des cellules vivantes et de Cleaveable fluorogénique-dye substrats suivants dépolarisation de la membrane de potassium induite par

Dans cette vidéo, le test TUNEL est effectué pour détecter la présence de cellules apoptotiques dans un échantillon. L'étude consiste à utiliser une ADN polymérase spéciale - la désoxynucléotidyl transférase terminale - qui catalyse l'ajout de dUTP marqués à l'extrémité 3' de l'ADN fragmenté, qui peut être observé et identifié au microscope à fluorescence.

Marquage dUTP Nick médié par la transférase terminale - Essai TUNEL : une méthode in situ pour détecter la fragmentation de l’ADN dans les cellules apoptotiques

Dans cette vidéo, nous démontrons le test d’efférocytose pour étudier la clairance des cellules apoptotiques à l’aide de la microscopie confocale. L’efférocytose est un processus en plusieurs étapes où les cellules apoptotiques sont englouties par des phagocytes et dégradées dans des vésicules appelées efférosomes. Ce protocole fournit une méthode pour visualiser les parties internalisées et non internalisées des cellules apoptotiques individuelles et quantifier l’efférocytose.

Dosage de l’efférocytose à cellules fixes : méthode d’étude de l’absorption efférocytaire des cellules apoptotiques par les macrophages à l’aide de la microscopie à fluorescence

Le terme anastase fait référence au phénomène dans lequel les cellules mourantes inversent un processus de suicide cellulaire à un stade avancé, se réparent elles-mêmes et finissent par survivre. Nous démontrons ici des protocoles de détection et de suivi des cellules qui subissent une anastase.

Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

Ici, nous présentons un protocole pour la détermination des événements de signalisation intracellulaire induits dans les cellules viables par l’interaction physique avec des cellules mortes ou mourantes adjacentes. Le protocole se concentre sur les événements de signalisation induits par la reconnaissance des cellules mortes par le biais du récepteur, par opposition à leur absorption phagocytaire ou à la libération de médiateurs solubles.

Identification des événements intracellulaires de signalisation induite dans les cellules viables par interaction avec les cellules voisines Subissant la mort cellulaire apoptotique

Efferocytosis, la suppression phagocytaire des cellules apoptotiques, est nécessaire pour maintenir l’homéostasie et est facilitée par les récepteurs et les voies de signalisation qui permettent la reconnaissance, d’une durée et l’internalisation des cellules apoptotiques. Ici, nous présentons un protocole de microscopie de fluorescence pour la quantification de l’efferocytosis et l’activité des voies de signalisation d’efferocytic.

Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules apoptotiques de cancer du sein par un tri de fluorescence-lancée de cellules et plus détecter le passage de cellules non souches du cancer du sein de cellules de cellules souches-comme pour le cancer du sein après le renversement de l’apoptose par cytométrie en flux.

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

Ici, nous présentons un protocole pour préparer les thymocytes apoptotiques et les macrophages péritonéaux et analyser l’efficacité de l’effocytose et le blocage spécifique par inhibiteur de l’engloutement des thymocytes apoptotiques. Ce protocole a une application large dans le dégagement de cellules-médiation d’autres particules y compris les billes artificielles et les bactéries.

Analyse expérimentale de l’Engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages

L’apoptose peut être caractérisée par l’analyse cytométrique en flux de biomarqueurs apoptotiques précoces et tardifs. La lignée cellulaire du cancer du col de l’utérus, SiHa, a été analysée pour les biomarqueurs de l’apoptose après un traitement avec l’actinomycine D à l’aide d’un cytomètre de flux de paillasse.

Analyse cytométrique en flux de biomarqueurs apoptotiques dans les cellules cancéreuses SiHa traitées à l’actinomycine D

Ici, un flux de travail expérimental est présenté qui permet la détection du traitement de la caspase-8 directement au niveau du complexe de signalisation induisant la mort (DISC) et détermine la composition de ce complexe. Cette méthodologie a de vastes applications, allant du démêlage des mécanismes moléculaires des voies de mort cellulaire à la modélisation dynamique des réseaux d’apoptose.

Mesure de la composition du complexe de signalisation induisant la mort CD95 et traitement de la procaspase-8 dans ce complexe

Découvrez une méthode robuste pour détecter et isoler les corps apoptotiques avec une pureté élevée en utilisant la cytométrie en flux et la centrifugation différentielle. Ce protocole permet d'étudier les mécanismes cellulaires de l'apoptose.

Détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté

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