Name: Fabrication d’anisotrope polymères artificiels cellules présentatrices d’Activation des cellules T CD8 + (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Découvrez la fabrication de cellules présentatrices d'antigènes artificielles anisotropes en PLGA pour activer les lymphocytes T CD8+. Cette méthode permet un contrôle indépendant de la taille et de la forme des particules biomimétiques.

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EBA (DGE-1746891) et KRR (DGE-1232825) remercie le programme de bourses de recherche diplômés NSF pour prise en charge. RAM Merci le National Research Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) et les récompenses de réalisation pour les bourses scientifiques College pour le soutien. Les auteurs remercient les NIH (R01EB016721 et R01CA195503), les recherches pour prévenir la cécité James et Carole Free Catalyst Award et l’Institut de Bloomberg-Kimmel JHU pour immunothérapie des cancers pour la prise en charge.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Johns Hopkins.
1. fabrication de particules PLGA sphériques de taille ajustable
<ol><li>Préparation des matériaux pour la synthèse de la particule<ol>
<li>Préparer la solution à 5 % p/p d’alcool polyvinylique (PVA).<ol>
<li>Ajouter 500 mL d’eau désionisée de (DI) dans un erlenmeyer avec une barre magnétique remuer et placer sur la plaque chauffante agitateur à 500 tr/min et moniteur de température avec thermomètre. Couvrir la fiole avec du papier d’aluminium pour éviter l’évaporation.</li>
			<li>Lorsque la température de l’eau atteint environ 70 ° C, ajouter 25 g total de PVA par petits lots au fil du temps, en attente de PVA de dissoudre avant d’ajouter plus.</li>
			<li>Une fois tous les PVA est dissous (généralement 30 à 60 min), laisser filtre cool et stérile de solution. Conserver à 4 ° C pour une utilisation future.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer la solution de casting de film de 10 % p/p PVA et 2 % w/w glycérol.<ol>
<li>Verser 500 mL de l’eau distillée dans un erlenmeyer avec une barre magnétique remuer. Ajoutez 8 mL de glycérol à température ambiante et mélanger par trituration.</li>
			<li>Placer le ballon sur plaque chauffante agitateur à 500 tr/min et moniteur de température avec le thermomètre. Couvrir la fiole avec du papier d’aluminium pour éviter l’évaporation.</li>
			<li>Lorsque la température de la solution atteint environ 70 ° C, ajouter 50 g total de PVA par petits lots au fil du temps, en attente de PVA de dissoudre avant d’ajouter plus.</li>
			<li>Une fois tous les PVA est dissous (généralement 60 min), laisser le filtre cool et stérile de solution en utilisant un système de filtre à vide flacon avec une porosité de 0,22 μm. Conserver à température ambiante pour une utilisation future.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer une solution PVA 50 mL 1 % w/w. Ajouter 40 mL de l’eau distillée et 10 mL de solution PVA de 5 % (fabriquée en 1.1.1) dans un bécher de 100-150 mL.</li>
		<li>Préparer une solution PVA 100 mL 0,5 % p/p. Ajoutez 90 mL de l’eau distillée et 10 mL de solution PVA de 5 % dans un bécher de 150 à 250 mL.</li>
		<li>Ajouter une barre d’agitation magnétique 0,5 % solution PVA et les introduire dans une hotte chimique sur une plaque d’agitation à température ambiante à 500 tr/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthèse de microparticules<ol>
<li>Peser 100 mg de poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) dans un flacon à scintillation et les dissoudre dans 5 mL de dichlorométhane (DCM). Vortex pour dissoudre la PLGA.</li>
		<li>Placez homogénéisateur dans la solution PVA de 1 % de 50 mL de sorte que l’homogénéisateur est aussi proche de la base du gobelet que possible sans le toucher. Homogénéisateur et régler à la vitesse désirée — 3 200 tr/min pour les particules de diamètre 5 μm, 5 000 tr/min pour 3 μm, 15 000 t/mn pour 1 μm (augmentant l’homogénéisation vitesse diminue la taille des particules). Une fois à la vitesse désirée, ajouter la solution PLGA dans le bécher et homogénéiser pendant 1 minute.</li>
		<li>Après homogénéisation, verser le 1 % PVA, solution au moyen de microparticules PLGA dans la solution PVA 100 mL 0,5 % sur une assiette pour mélanger et remuer pendant au moins 4 heures pour l’évaporation des solvants dans une hotte chimique.</li>
		<li>Laver les particules 3 fois dans l’eau distillée.<ol>
<li>Verser la solution de la particule dans tubes conique de 50 mL et centrifuger à 3000 x g pendant 5 minutes. Versez surnageant, ajouter environ 20 mL de l’eau distillée.</li>
			<li>Remettre en suspension les particules au vortex. Une fois remis en suspension, remplissez les tubes coniques à 50 mL avec de l’eau distillée.</li>
			<li>Lavez à nouveau de la même façon deux fois plus.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthèse de nanoparticules<ol>
<li>Peser 200 mg de PLGA dans un flacon à scintillation et dissoudre dans 5 mL de DCM. Vortex pour dissoudre la PLGA.</li>
		<li>Mettre un bécher avec 50 mL de solution de PVA 1 % dans le récipient rempli de glaçons. Placer la sonde sonicateur dans le bécher au plus près le bas que possible sans toucher. Commencer la sonication et immédiatement ajouter PLGA solution dans le bécher. Laisser agir avec une puissance de 12 W pendant 2 minutes pour générer des nanoparticules avec un diamètre approximatif de 200 nm.</li>
		<li>Après la sonication, verser le 1 % PVA, solution de nanoparticules PLGA dans une solution PVA 100 mL 0,5 % sur une assiette pour mélanger et remuer pendant au moins 4 heures pour l’évaporation des solvants dans une hotte chimique.</li>
		<li>Verser la solution de particules dans les tubes coniques de 50 mL et centrifuger à 3 000 x g pendant 5 minutes pour éliminer les microparticules. Éliminer le surnageant et versez dans des tubes à centrifuger haute vitesse.</li>
		<li>Laver les particules 3 fois avec l’eau distillée. Centrifuger à 40 000 x g pendant 15 minutes. Versez sur le surnageant et remettre en suspension dans l’eau distillée au vortex. Lavez à nouveau de la même façon deux fois plus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fabrication de particules polymères de forme accordable
<ol><li>Après avoir lavé les particules PLGA trois fois, remettre en suspension les particules dans environ 1 mL de l’eau distillée. Ajouter la solution de casting de film de particules pour la concentration de la particule finale des particules de 2,5 mg/mL.</li>
	<li>Pipetter, la suspension de particules en portions de 10 mL dans les plats de Pétri rectangulaire 75 x 50 mm pour les étirements unidimensionnel ou en aliquotes de 15 mL en plats de Pétri carré 100 x 100 mm pour deux dimensions qui s’étend. Enlever les bulles soit la pipette ou bulles poussant sur le côté et laisser sécher pendant la nuit dans une hotte chimique films.</li>
	<li>Une fois que les films sont secs, enlever les films de vaisselle en plastique avec des pincettes et couper les bords des films avec des ciseaux. Enregistrer les bords dans un tube conique de 50 mL à utiliser sous forme de particules sphériques.<ol>
<li>Charger un film sur la couche mince automatisé qui s’étend du dispositif par le montage d’un film dans des blocs d’aluminium. Pour 1D étirement, monter le film dans des blocs d’aluminium d’un axe de la civière (Figure 2) en plaçant les deux bords courts du film entre deux morceaux de caoutchouc néoprène. À l’aide d’une clé Allen, visser les poignées métalliques sur le dessus de caoutchouc pour maintenir le film en place. Pour les étirements 2D, monter quatre bords sur quatre blocs d’aluminium s’étirer sur les deux axes (Figure 2).</li>
		<li>Mesurer et noter la longueur du film entre les blocs d’aluminium sur un axe pour les étirements 1D ou les deux axes pour les étirements 2D. Calculer la distance nécessaire d’étirer le film dans une ou deux directions en fonction désirée pli-stretch.</li>
		<li>Placez l’appareil d’étirement film-chargé dans un four à 90 ° C et ramener le film à température pendant 10 minutes. Placer un grand bécher dans le four avec un peu d’eau.</li>
		<li>Film étirable.</li>
		<li>Lors de l’étirement est terminée, retirer l’appareil qui s’étend du four et laisser le refroidir de film à température ambiante pendant 20 minutes.</li>
		<li>Pour 1D étirement, couper le film hors de l’appareil qui s’étend sur les bords. Pour les étirements 2D, couper dehors et enregistrer le centre carré de film qui est étiré uniformément sur les deux axes. Placer les films dans des tubes coniques avec 2 films par tube et jeter le reste du film.</li>
		<li>Ajouter environ 25 mL de l’eau distillée à chaque tube à fond conique et vortex jusqu'à ce que les films sont dissous.</li>
		<li>Une fois que les films sont des particules dissoutes, laver 3 fois avec l’eau distillée.<ol>
<li>Pour les microparticules, remplir des tubes coniques à 50 mL et centrifuger à 3000 x g pendant 5 minutes, déverser du liquide surnageant, ajouter environ 20 mL de l’eau distillée et vortex pour remettre en suspension les particules.</li>
			<li>Pour les nanoparticules, particules de transfert pour tubes de centrifugeuse de haute vitesse et centrifuger à 40 000 x g pendant 15 minutes, versez surnageant, ajouter environ 20 mL de l’eau distillée et vortex pour remettre en suspension les particules.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Après le troisième lavage, remettre en suspension des particules dans environ 1 mL de l’eau distillée. Noter le poids du tube microcentrifuge et ajouter des particules dans le tube. Congeler des particules dans un congélateur à-80 ° C pendant 1 heure ou congélation flash dans l’azote liquide. Une fois congelé, lyophiliser particules durant la nuit.</li>
		<li>Une fois lyophilisé, peser des particules dans le tube de microcentrifuge et soustraire le poids enregistré du tube vide pour déterminer le poids des particules lyophilisés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. surface Protein conjugaison pour créer des cellules présentatrices de l’antigène artificiel
<ol><li>Préparer 2-(N-Morpholino) tampon d’ethanesulfonic acide (MES). Préparer une solution de 0,1 M de MES dans l’eau et ajuster le pH à 6.0 par titrage avec 1M d’hydroxyde de sodium (NaOH).</li>
	<li>Resuspendre lyophilisée PLGA/PBAE micro/nanoparticules à 20 μg/mL dans le tampon MES au vortex. Remplir un tube de microcentrifuge polypropylène avec 900 μL de tampon de MES et ajouter 100 μL de la solution de particules dans le tube.</li>
	<li>Préparer la solution d’EDC/NHS. Dissoudre 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et 48 mg de N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) dans 1 mL de tampon de MES.</li>
	<li>Ajouter 100 μL EDC/NHS solution pour les particules et le vortex pour mélanger.</li>
	<li>Incuber le tube sur un onduleur à température ambiante pendant 30 minutes.</li>
	<li>Tournez en bas des microparticules à 5 000 x g pendant 5 minutes, ou nanoparticules à 17 000 x g pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de PBS par Vortex (microparticules) ou la sonification à 2-3 W pendant 5 secondes (nanoparticules).</li>
	<li>Pour les microparticules, ajouter 8 μg de la protéine du signal désiré 1 et 10 μg de anti-souris CD28 (clone 37,51) aux particules. Pour les nanoparticules, ajouter 16 μg signal 1 et 20 μg anti-souris CD28. Ajouter PBS pour porter le volume du tube à 1,1 mL.</li>
	<li>Incuber le tube sur un variateur de fréquence à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, laver les particules. Tournez en bas des microparticules à 5 000 x g pendant 5 minutes, ou nanoparticules à 17 000 x g pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension des particules dans 1 mL de PBS stérile par Vortex (microparticules) ou la sonication à 2-3 W pendant 5 secondes (nanoparticules). Répéter deux fois.</li>
	<li>Remettre en suspension les particules à la concentration voulue dans le milieu de culture pour un usage immédiat. Pour le stockage à long terme, remettre en suspension les particules à 10 mg/mL dans une solution de saccharose de 100 mM. Geler, lyophiliser et stocker les particules à-80 ° C.</li>
</ol>4. caractérisation et évaluation de Vamp
<ol><li>Caractérisation de vamp taille et la forme (Figure 3)<ol>
<li>Caractériser les microparticules de taille et de forme par imagerie de particules à l’aide de la microscopie électronique à balayage (SEM). Pour SEM particules lyophilisées d’imagerie, étalées sur une bande carbone ont adhéré à un aluminium louvoyer et bredouiller manteau avec or-palladium.</li>
		<li>Analyser la taille et les proportions de particules à l’aide de logiciels d’analyse image.</li>
		<li>Pour déterminer la taille des particules, définissez l’échelle à l’aide de la barre d’échelle et mesurer le diamètre des particules. Répétez pour environ 100 particules déterminer le diamètre moyen de particules et de générer un histogramme de tailles de particules.</li>
		<li>Pour déterminer le ratio d’aspect, mesurez la distance entre l’axe longitudinal et l’axe court des particules et diviser le long axe par axe court. Répétez pour environ 50 particules de chaque forme pour déterminer les proportions de moyenne des particules pour chaque forme et générer des histogrammes.</li>
		<li>Caractériser des nanoparticules de taille et de forme par imagerie de particules à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM). Analyser la taille et les proportions des nanoparticules avec logiciel d’analyse d’image tel que décrit en 5.1.2. Vous pouvez également mesurer la taille des nanoparticules sphériques utilisant la diffusion dynamique de la lumière (DLS) ou nanoparticules suivi d’analyse (NTA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efficacité de la protéine conjugaison<ol>
<li>Préparer la VAMP selon les méthodes 1 à 3, mais étape 3.7 utiliser le signal fluorescent étiquetés 1 protéine et CD28 anti-souris. Après conjugaison et lavage, resuspendre la VAMP dans 1 mL de PBS pour une concentration finale de 2 mg/mL vamp.</li>
		<li>Élaborer des normes de la protéine dans une microplaque de 96 puits en polystyrène noire. Ajouter 5 μg de protéines du signal fluorescent étiquetés 1 à PBS dans le premier puits de la plaque et faire des dilutions de 1:2 10 dans du PBS à travers la ligne de la plaque. Laisser le dernier vide bien. Répétez cette étape pour générer un autre ensemble de normes avec anti-CD28 fluorescent étiquetés.</li>
		<li>Pipetter 100 μL de la solution de vamp dans puits répétées de la microplaque de polystyrène noire en trois exemplaires.</li>
		<li>Lire la fluorescence sur un lecteur de fluorescence dans les longueurs d’onde appropriées. Les lectures de fluorescence dans les normes de la protéine permet de générer des courbes d’étalonnage pour chaque anticorps fluorescents. À l’aide de la courbe d’étalonnage, calculer les concentrations de signal 1 et anti-CD28 dans chaque puits échantillon et ensuite de calculer la quantité de protéine de surface et d’efficacité de conjugaison (Figure 4 a, Figure 5 a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Évaluation de VAMP pour in vitro la stimulation des cellules T CD8 +<ol>
<li>Préparer les médias B' (RPMI additionné L glutamine, 10 % FBS, solution d’acides aminés Non essentiels 1 %, pyruvate de Sodium 1 %, solution de 1 % de vitamines MEM, 92 μM β-mercaptoéthanol et 10 ng/mL ciprofloxacin 30 U/mL IL-2.</li>
		<li>Sacrifier une souris noire 6 par l’exposition du dioxyde de carbone.</li>
		<li>Récolter la rate de la souris selon un protocole établi précédemment16. Recueillir la rate dans un tube conique de 50 mL avec 10 - 15 mL de PBS. À l’aide d’un pilon, écraser la rate à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube conique de 50 mL. Au cours de brassage, lavez le tamis avec 40 mL de PBS.</li>
		<li>Tournez les splénocytes à 300 x g pendant 5 minutes. Décanter le liquide surnageant et remettre en suspension les splénocytes dans 4 mL de tampon de lyse Ack à lyser les globules rouges. Permettre le tube s’asseoir non perturbés pendant une minute, puis ajoutez les PBS pour porter le volume dans le tube de 20 mL.</li>
		<li>Tournez les cellules à 300 x g pendant 5 minutes. Décanter le liquide surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
		<li>Faire tourner les cellules à 300 x g pendant 5 minutes et remettre en suspension dans le volume souhaité de tampon de séparation cellulaire. Isoler les cellules T CD8 + de la suspension de la cellule à l’aide d’une sélection négative de CD8 + kit d’isolation de lymphocytes T, suivant le protocole du fabricant.</li>
		<li>Après la séparation magnétique, spin des cellules T CD8 + à 300 x g pendant cinq minutes et retirer le tampon de séparation cellulaire. Remettre en suspension des cellules dans 1 mL de PBS et compter les cellules non vides. Cellules avec carboxyfluorescéine succinyl ester (CFSE) selon le protocole du fabricant de l’étiquette.</li>
		<li>Incuber 8 333 lymphocytes t CD8 + et 0,0833 mg (ou dose souhaitée) de vamp dans les milieux de 150 μL B' à chaque puits d’un 96 bien U-traitée pour la culture de tissu plaque de fond.</li>
		<li>Incuber à 37 ° C pendant 7 jours. Après 3-4 jours, actualisez le milieu de culture en ajoutant un milieu frais 75 μl à chaque puits.</li>
		<li>Après 3 jours d’incubation, analyser CFSE étiquetés cellules sur un cytomètre en flux afin d’évaluer la prolifération. Chaque pic sur l’histogramme CFSE de cytométrie de flux représente une génération de cellules en raison de la dilution CFSE avec chaque division cellulaire successifs.</li>
		<li>Après 7 jours, utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules dans chaque puits. Avant le comptage, colorer les cellules mortes avec une solution de bleu de Trypan. Exclure les cellules mortes de globules final. Normaliser la concentration de la dernière cellule de la concentration initiale pour calculer le pli-expansion (Figure 4 et Figure 5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li>
<li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+protein-based%2C+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li>
<li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striped%2C+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li>
<li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2011/sc/c0sc00596g">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li>
<li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse%2C+shape-specific+nanobiomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li>
<li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une méthode polyvalente pour la génération précise des particules de polymères anisotropes. La couche mince qui s’étend de la technique décrite ici est évolutif, hautement reproductible et peu coûteux. Des techniques alternatives pour générer des particules anisotropes souffrent de nombreuses limites, y compris le coût élevé, un débit faible et limitée de granulométrie. La couche mince qui s’étend de la démarche est également avantageuse car les particules sont modifiées afin d’être anisotrope après s...

Cellules présentatrices d’antigène artificiel (VAMP) ont montré prometteur comme agents immunomodulateurs, parce qu’ils peuvent générer une réponse des lymphocytes T spécifiques de l’antigène robuste. Essentielles à ces plates-formes sont leur capacité à présenter efficacement les signaux cruciaux pour l’activation des cellules T. Vamp acellulaire sont une alternative intéressante aux cellulaires vamp parce qu’ils sont plus facile et moins coûteux à fabriquer, relever des défis moins pendant l’intensification et de la traduction et atténuer les risques associés à des thérapies à base cellulaire. Vamp acellulaire permettent également un degré élevé de contrôle sur les paramètres de présentation de signal et les propriétés physiques de la surface qui sera en interface avec les cellules de T1.
Vamp doit récapituler un minimum de deux signaux essentiels pour l’activation des cellules T. Signal 1 prévoit la reconnaissance de l’antigène et se produit lorsque le récepteur des cellules T (TCR) reconnaît et s’engage avec un CMH de classe I ou II portant son antigène apparenté, culminant dans la signalisation à travers le complex TCR. Afin de contourner l’exigence de spécificité d’antigène, vamp systèmes portent souvent un agoniste monoclonal dirigé contre le récepteur CD3, qui stimule non spécifique du complexe TCR. Des formes recombinantes du CMH, particulièrement des multimères de MHC, ont également servis à la surface de vamp d’antigène spécificité2,3. Signal 2 est un signal de costimulation qui dirige l’activité des cellules T. Pour fournir la costimulation nécessaire pour l’activation des cellules T, le récepteur CD28 est généralement stimulé avec un anticorps agoniste présenté sur la surface de Vamp, bien que les autres récepteurs de costimulation telles que 4-1BB ont été correctement ciblée4. Protéines de signal 1 et 2 sont généralement immobilisées sur la surface des particules rigides pour synthétiser la vamp. Historiquement, vamp ont été fabriquées à partir d’une variété de matériaux, y compris en polystyrène4,5 et fer dextran6. Les systèmes plus récents utilisent des polymères biodégradables comme poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) pour générer la VAMP qui peut être facilement couplé pour signaler des protéines, est destinés à l’administration directe en vivoet peut faciliter la libération de Résumé des cytokines ou des facteurs solubles pour augmenter l’activation de lymphocytes T7,8.
En plus de la présence de protéines de signal nécessaire, l’engagement du récepteur sur une surface suffisamment grande au cours de l’interaction de cellule de vamp/T est indispensable pour l’activation des cellules T. Ainsi, les paramètres physiques de la VAMP tels que la taille et la forme radicalement modifient leurs surfaces de contact disponible et influer sur leur capacité à stimuler les lymphocytes T. Vamp taille micron ont démontré d’être plus efficace à la stimulation des cellules T à leur échelle nanométrique homologues9,10. Toutefois, les nano-vamp peut avoir biodistribution supérieure et meilleur drainage vers les ganglions lymphatiques qui peuvent améliorer leur performance en vivo sur micro-vamp11. La forme est une autre variable d’intérêt pour les systèmes axés sur les particules de vamp. Vamp anisotrope ont récemment démontré pour être plus efficace que les particules isotropes à stimulation des cellules T, principalement en raison de l’interaction améliorée avec les cellules cibles couplé avec l’absorption réduite des cellules non spécifiques. Cellules fixent de préférence à l’axe long de particules ellipsoïdales, et le plus grand rayon de courbure et plus plat surface permettent plus de contact entre la vamp et les lymphocytes T12. L’axe long de particules ellipsoïdales décourage également la phagocytose, résultant en temps de circulation accrue par rapport aux particules sphériques suit en vivo administration12,,13. En raison de ces avantages, les particules ellipsoïdales véhiculent une plus grande expansion de spécifiques à l’antigène T cellules in vitro et in vivo par rapport aux particules sphériques, un effet observé à la micro et nanoscales12, 13. Il existe différentes stratégies pour fabriquer des particules anisotropes, mais minces stretching est une méthode simple et largement acceptée, utilisée pour générer un ensemble de particules diverses formes14. Suite à la synthèse, les particules sont jetés dans les films et étirés dans une ou deux dimensions à une température supérieure à la température de transition vitreuse du matériau particulaire. Le film est ensuite dissous pour récupérer les particules. Malgré l’intérêt croissant pour les particules anisotropes, les approches actuelles de fabrication axée sur les particules vamp se limitent principalement aux systèmes isotropes et méthodes de modifier la forme des particules peuvent être difficiles à mettre en œuvre, incompatible avec la synthèse de certains vamp stratégies et manque de précision et reproductibilité15. Notre technique d’étirement minces peut être effectuée manuellement ou de manière automatisée pour générer rapidement des particules anisotropes synthétisées dans une variété de polymères biodégradables, s’étendait à un format d’image désiré dans une ou deux dimensions15.
Issu de nos travaux antérieurs, nous avons développé une approche axée sur les particules biodégradable combinée avec scalable minces étirement technologie pour générer rapidement des vamp avec taille ajustable et la forme de manière standardisée pour les lymphocytes T expansion ex vivo ou en vivo. Notre stratégie de conjugaison de protéines permet de coupler les protéines d’intérêt aux groupes carboxyle sur la surface de la particule à une densité désirée, ce qui donne à ce système de vamp un haut degré de flexibilité. Nous décrivons également des méthodes pour caractériser la taille, la morphologie et la protéine de surface contenue de Vamp et d’évaluer leur fonctionnalité in vitro. Ce protocole peut être facilement adapté pour développer des cellules immunitaires ex vivo ou in vivo pour une variété d’applications immunothérapeutiques.

<table><tbody><tr><td>Poly(alcool vinylique), MW 25000, hydrolysé à 88 %</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02975-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre numérique</td><td>Fluke</td><td>N/A</td><td>Nom du modèle : Fluke 52 II</td></tr><tr><td>Sonde de température d’immersion</td><td>Fluke</td><td>N/A</td><td>Nom du modèle : Fluke 80PK 22</td></tr><tr><td>Digital Hotplate & Agitateur</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H3760-HS</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur multipoint</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50093538</td><td></td></tr><tr><td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719900</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td><td>IKA</td><td>&nbsp ; </td><td></td>0003725001</tr><tr><td>Sonorités sonicatrices</td><td>& Matériaux, Inc.</td><td>N/A</td><td>Numéro de modèle : VC 505</td></tr><tr><td>Boîtier d’insonorisation Sonicator</td><td>Sonics & Matériaux, Inc.</td><td>N/A</td><td>Référence : 630-0427</td></tr><tr><td>Sonde sonicatrice</td><td>Sonics & Matériaux, Inc.</td><td>N/A</td><td>Référence : 630-0220</td></tr><tr><td>Sonicator microtip</td><td>Sonics & Matériaux, Inc.</td><td>N/A</td><td>Référence : 630-0423</td></tr><tr><td>Centrifugeuse à grande vitesse</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Numéro de modèle : J-20XP (discontinué), modèle alternatif : J-26XP</td></tr><tr><td>Rotor de centrifugeuse à grande vitesse</td><td>Beckman Coulter</td><td>369691</td><td>Numéro de modèle : JA-17</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en polycarbonate à grande vitesse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 mL, bouchon à vis</td></tr><tr><td>Pétri jetable rectangulaire parabole</td><td>VWR International</td><td>25384-322</td><td>75 x 50 x 10 mm</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri jetable carrée</td><td>VWR International</td><td>10799-140</td><td>100 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>LEAF&nbsp ; Anti-souris CD3&epsilon purifié ; Anticorps</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>InVivoMab anti-souris CD28, clone 37.51</td><td>Bio X Cell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime ;-chlorhydrate d’éthylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6383</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysulfosuccinimide sel</td><td>sodique Sigma-Aldrich</td><td>56485</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-souris CD3 Anticorps</td><td>Biolegend</td><td>100212</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-souris CD28 Anticorps</td><td>Biolegend</td><td>102109</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp ; Microplaque en polystyrène solide 96 puits</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3915</td><td>fond plat, polystyrène noir</td></tr><tr><td>Tubes Protein LoBind, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Moyen (+ L-Glutamine)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td> Ciprofloxacine <td>inactivée par la chaleur, filtrée stérilement</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humaine recombinante (sans porteur)</td><td>Biolegend</td><td>589102</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Solution (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11120052</td><td></td></tr><tr><td>CD8a+&nbsp ; Kit d’isolement des lymphocytes T, souris</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Kit de prolifération cellulaire</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonnes</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre</td><td>en flux Accuri C6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Lecteur de microplaques multi-détection</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi BIotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Filtre cellulaire</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22363548</td><td>Stérile, 70 & micro ; m nylon mesh</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J (Black 6) Souris</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Mâle, âgé d’au moins 7 semaines</td></tr><tr><td>U-Bottom Plaques de culture tissulaire</td><td>VWR</td><td>353227</td><td>Stérile, 96 puits traités par culture tissulaire</td></tr><tr><td>Plaques d’alimentation 40 V DC</td><td>Probotix</td><td>LPSK-4010</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Souris en fil revêtu</td><td></td><td>602-5858-100-01</td><td>Il s’agit d’une bobine de 100 pieds, mais un fil équivalent fonctionnera</td></tr><tr><td>Pilote de moteur pas à pas</td><td>Probotix</td><td>MondoStep5.6</td><td></td></tr><tr><td>Kit de connecteur IDC</td><td>Probotix</td><td>IDCM-10-12</td><td></td></tr><tr><td>Microcontrôleur</td><td>Probotix</td><td>PBX-RF</td><td></td></tr><tr><td>4A Fusibles</td><td>Radio Shack</td><td>2701026</td><td>Des fusibles équivalents fonctionneront également</td></tr><tr><td>DB25 Câble Mâle à Mâle</td><td>Probotix</td><td>DB25-6</td><td></td></tr><tr><td>Câble USB-A vers USB-B</td><td>Agrafes</td><td>2094915</td><td>Un câble équivalent fonctionnera également</td></tr><tr><td>Connecteurs Amphenol à 8 broches Souris mâle et femelle</td><td></td><td>654-97-3100A-20-7P et 654-97-3106A20-7S</td><td></td></tr><tr><td>Moteur pas à pas</td><td>Probotix</td><td>HT23-420-8</td><td></td></tr><tr><td>Vis mère à droite</td><td>Roton</td><td>60722</td><td></td></tr><tr><td>Vis mère gauche</td><td>Roton</td><td>60723</td><td></td></tr><tr><td>Vis</td><td>McMaster Carr</td><td>92196A151</td><td></td></tr><tr><td>Caoutchouc néoprène</td><td>McMaster Carr</td><td>8698K51</td><td></td></tr><tr><td>Écrou à bride pour droitier</td><td>Roton</td><td>91962</td><td></td></tr><tr><td>Écrou à bride pour gaucher</td><td>Roton</td><td>91963</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur de contrôle Linux</td><td>Probotix</td><td>LCNC-PC</td><td>Tout ordinateur avec des spécifications correspondantes et un système d’exploitation Linux fonctionnera</td></tr><tr><td>Système de filtre sous vide pour bouteilles Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS431097</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication d’anisotrope polymères artificiels cellules présentatrices d’activation des cellules t cd8 +

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Cellules présentatrices d’antigène artificiel (VAMP) sont une plate-forme prometteuse pour la modulation du système immunitaire en raison de leur capacité puissante pour stimuler les lymphocytes T. Substrats acellulaires offrent des avantages clés sur vamp basés sur les cellules, y compris un contrôle précis des paramètres de présentation de signal et les propriétés physiques de la surface de VAMP pour moduler ses interactions avec les lymphocytes T. Vamp, construit à partir de particules anisotropes, particules particulièrement ellipsoïdales, auraient dû être divulgués plus efficaces que leurs homologues sphériques de stimulation des cellules T en raison de la liaison accrue et de plus grande surface disponible pour les lymphocytes T contact, aussi bien réduit l’absorption non spécifique et des propriétés pharmacocinétiques améliorées. Malgré un intérêt accru dans les particules anisotropes, encore largement acceptée méthodes de génération de particules anisotropes comme minces étirement peut être difficile à implémenter et utiliser de façon reproductible.
À cette fin, nous décrivons un protocole pour la fabrication rapide et standardisé de vamp d’axée sur les particules anisotrope biodégradable avec taille ajustable, forme et signal de présentation pour les lymphocytes T expansion ex vivo ou in vivo, ainsi que les méthodes de caractériser leur taille, la morphologie et la protéine de surface contenue et d’évaluer leur fonctionnalité. Cette approche à la fabrication de vamp anisotrope est évolutive et reproductible, idéale pour générer VAMP pour immunothérapies « sur étagère ».

Une représentation schématique du film mince 2D automatisé, qui s’étend de dispositif est donnée à la Figure 1. Un schéma et une description pour un film mince de 1D qui s’étend du dispositif est donné en Ho et al.17 la civière est construite à partir de pièces d’aluminium à l’aide de techniques d’usinage et de fraisage standard. Semblable à la civière 1D, la civière 2D se compose de poignées métalliques et de rails de guidage. Vis de ...

Nous présentons ici un protocole pour générer rapidement et de façon reproductible des inspirée, biodégradable articifical cellules présentatrices (VAMP) avec taille ajustable, forme et présentation de la protéine de surface des lymphocytes T expansion ex vivo ou in vivo .

Fabrication d’anisotrope polymères artificiels cellules présentatrices d’Activation des cellules T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie aminé. Par exemple, quel est le rôle des propriétés physiques des particules sur les interactions et l’activation des cellules immunitaires biomatériaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un contrôle indépendant de la taille et de la forme des particules biomimétiques.Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie du cancer car il s’agit d’une thérapie par particule disponible sur le marché qui peut causer des réponses immunitaires à base de cellules in vivo. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’aminothérapie contre le cancer, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes. Comme les maladies infectieuses ou le diabète de type 1.Pour la synthèse des microparticules, commencez par peser 100 milligrammes d’acide poly(lactique-co-glycolique) ou PLGA, dans un flacon de scintillation et en dissolvant le PLGA en cinq millilitres de dichloromethane par vortex. Placez un homogénéiseur dans un bécher contenant 50 millilitres d’alcool polyvinyle à 1 %, ou solution PVA, de sorte que l’homogénéiseur soit le plus près possible du fond du bécher sans le toucher. Allumez l’homogénéiseur à la vitesse appropriée et ajoutez la solution PLGA au bécher pour une minute d’homogénéisation.À la fin de l’homogénéisation, verser la solution polyvinyle de microparticules PLGA dans un bécher contenant 100 millilitres de solution PVA à 5% sur une plaque de remue-tout dans une hotte chimique et remuer la solution pendant au moins quatre heures. Lorsque le solvant s’est évaporé, versez la solution de particules dans des tubes coniques de 50 millilitres et recueillez les particules par centrifugation. Remplacer le supernatant dans chaque tube par 20 millilitres d’eau déionisée et suspendre à nouveau les particules par vortex.Ensuite, apportez le volume final dans chaque tube jusqu’à 50 millilitres avec de l’eau fraîche déionisée et lavez les particules deux fois de plus comme nous venons de le démontrer. Pour la synthèse des nanoparticules, dissoudre 200 milligrammes de PLGA en cinq millilitres de dichloromethane et placer une sonde sonicator dans un bécher contenant 50 millilitres de solution PVA de 1% sur la glace sans toucher le fond du bécher. Commencez la sonication à 12 watts et ajoutez immédiatement la solution PLGA au bécher pour une sonication de deux minutes pour générer des nanoparticules d’un diamètre d’environ 200 nanomètres.Après la sonication, versez la solution nanoparticule PLGA de 1 % d’alcool polyvinyle dans un bécher contenant 100 millilitres de solution 5 PVA sur une plaque de remue-remuer pendant quatre heures d’évaporation du solvant dans une hotte chimique. Lorsque tout le solvant est évaporé, versez la solution de particules dans des tubes coniques de 50 millilitres pour centrifugation afin d’éliminer les microparticules et d’enlever les supernatants. Ensuite, transférez les nanoparticules dans des tubes de centrifugeuse à grande vitesse pour trois lavages dans de l’eau déionisée comme démontré.Pour la fabrication de particules polymériques, après le dernier lavage, suspendre à nouveau les particules dans environ un millilitre d’eau désionisée fraîche et ajouter une solution de coulée de film aux particules à une concentration finale de 2,5 milligrammes par millilitre de particules. Transférer la suspension de particules en aliquots de 10 millilitres dans des boîtes de Pétri rectangulaires de 75 par 50 millimètres pour un étirement unidimensionnel. Ou en aliquots de 15 millilitres en boîtes de Pétri carrées de 100 par 100 millimètres pour des étirements bidimensionnels.Après séchage pendant la nuit dans une hotte chimique, utiliser des pinces à épiler pour enlever les films et couper les bords avec des ciseaux. Pour les étirements 1D, placez les deux bords courts d’un film entre deux morceaux de caoutchouc néoprène pour monter sur les blocs d’aluminium d’un axe d’un dispositif automatisé d’étirement à couches minces. Ensuite, utilisez une clé Allen pour visser les poignées métalliques sur le dessus du caoutchouc pour maintenir le film en place.Pour les étirements 2D, monter les quatre bords sur quatre blocs d’aluminium pour étirer le film sur les deux axes mesurer et enregistrer la longueur du film entre les blocs d’aluminium sur un axe pour un étirement D ou les deux axes pour l’étirement 2D et calculer la distance nécessaire pour étirer le film dans une ou deux directions en fonction de l’étirement du pli désiré. Placez ensuite le dispositif d’étirement chargé de film dans un four à 90 degrés Celsius à côté d’un plus grand bécher d’une petite quantité d’eau pour amener le film à la température plus de 10 minutes. Lorsque l’étirement est terminé, laisser refroidir le film à température ambiante pendant 20 minutes.Pour les étirements 1D, découpez le film du dispositif d’étirement sur les bords. Pour les étirements 2D, découpez et sauvez le carré central du film qui est uniformément étiré sur les deux axes. Placez les films dans des tubes coniques de 50 millilitres avec pas plus de deux films par tube et ajoutez environ 25 millilitres d’eau déionisée à chaque tube pour le vortex.Lorsque les films se sont dissous, lavez les particules trois fois dans de l’eau déionisée comme démontré. Re-suspendre les particules dans environ un millilitre d’eau fraîche déionisée par tube après le dernier lavage. Puis congeler les particules à moins 80 degrés Celsius pendant une heure ou la nuit lyophilisation.Le lendemain matin, suspendez à nouveau les micro ou nanoparticules lyophilisées à 20 milligrammes par millilitre dans un tampon MES fraîchement préparé avec vortex. Ajouter 100 microlitres de la solution de particules à un tube de micro centrifugeuse en polypropylène contenant 900 microlitres de tampon MES et ajouter 100 microlitres de solution EDC NHS fraîchement préparée. Mélanger les particules en vortexant et incuber les particules sur un onduleur à température ambiante pendant 30 minutes.À la fin de l’incubation, recueillir les particules par centrifugation et suspendre à nouveau les granulés de microparticules dans un millilitre de PBS en vortexant ou en suspendant à nouveau les nanoparticules en un millilitre de PBS par cinq secondes de sonication à deux à trois watts. Ensuite, ajoutez huit microgrammes d’un signal approprié une protéine et 10 microgrammes d’anticorps ANTI souris CD28 aux microparticules, ou 16 microgrammes du signal une protéine et 20 microgrammes d’anti souris CD28 aux nanoparticules. Porter le volume final de chaque tube à 1,1 millilitre avec PBS et incuber les particules pendant la nuit sur un onduleur à quatre degrés Celsius.Le lendemain, lavez les particules trois fois dans de l’eau désionisée comme démontré. Ces nano et microparticules PLGA ont été synthétisées à l’aide des techniques d’émulsion unique telles que démontrées et photographiées à l’aide de la microscopie électronique de transmission et de balayage. Après homogénéisation, les microparticules ont démontré un diamètre moyen d’environ trois micromètres.Les microparticules sphériques ont eu une ration d’aspect d’environ un, alors que les particules ellipsoidal étirées de 1D ont eu un rapport d’aspect plus grand d’environ trois et demi et les particules ellipsoidal oblat étirées 2D ont eu un rapport d’aspect d’environ 1.2, maintenant approximativement un rapport d’aspect d’un. Les résultats d’efficacité de conjugaison révèlent les quantités semblables de protéine à la surface de l’antigène micro-artificiel sphérique et ellipsoidal présentant des cellules, ou AAPC et nano-AAPC, démontrant que le couplage de protéine pendant la synthèse d’AAPC se produit d’une manière dépendante de concentration. L’AAPC ellipsoidal prolate s’est trouvé pour induire des niveaux plus élevés de prolifération de cellules T aux doses sous-saturantes que l’AAPC sphérique avec la meilleure séparation réalisée à une dose de milligramme de 01.Après sept jours, le comptage manuel des lymphocytes T a révélé que l’AAPC ellipsoidal prolate stimule plus efficacement les lymphocytes T par rapport à leurs homologues sphériques à l’échelle micro et nano d’une manière dépendante de la dose. Après cette procédure, l’AAPC peut être administré in vivo pour évaluer leur efficacité thérapeutique et leur pharmacocinétique. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs du domaine de l’immuno-ingénierie d’explorer l’effet de l’anisotropie sur l’efficacité de l’AAPC.

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Cette vidéo décrit un protocole permettant d’isoler des lymphocytes T CD8+ spécifiques à des antigènes rares à l’aide de cellules présentatrices d’antigènes artificielles (aAPCs) à base de nanoparticules magnétiques fonctionnalisées avec des Ig-CMH chargées de peptides antigéniques et des anticorps anti-CD28. L’interaction des aAPCs avec les lymphocytes T CD8+ exprimant spécifiquement les récepteurs des lymphocytes T ciblant les peptides antigéniques, suivie de leur expansion in vitro, entraîne...

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Lignes directrices sont présentées pour la production de l'antigène artificiel de tueur des cellules présentatrices, KaAPC, un outil efficace pour la déplétion in vitro de lymphocytes T spécifiques de l'antigène humain et une solution alternative à l'immunothérapie cellulaire pour le traitement de T maladies auto-immunes à médiation cellulaire à un antigène de façon spécifique sans compromettre le système immunitaire reste.

Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d'utilisation efficace In Vitro L'épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l'antigène

Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser verre avec des taches de protéines nanométriques entourées par une bicouche lipidique fluide. Ces substrats sont compatibles avec la microscopie optique de pointe et devraient servir de plate-forme pour les études d'adhésion cellulaire et la migration.

Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches

Ce protocole décrit une méthode basée sur l’imagerie pour activer les lymphocytes T à l’aide de photoactivatable peptide-MHC, permettant un contrôle précis spatio-temporelle de l’activation des cellules T.

Contrôle spatial et temporel de l’Activation des cellules T à l’aide d’un agoniste Photoactivatable

Lymphocytes T antigène-spécifiques sont difficiles à caractériser ou utiliser dans les thérapies en raison de leur fréquence extrêmement basse. Ici, nous fournissons un protocole visant à développer une particule magnétique qui peut lier aux cellules T spécifiques de l’antigène à enrichir ces cellules, puis d’en faire plusieurs techniques pour la caractérisation et le traitement.

Enrichir et élargir les cellules rares T antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques

Ce protocole décrit l’utilisation de la seule chaîne CMH de classe I complexes pour étudier les interactions moléculaires dans l’activation des lymphocytes T CD8 + humaine : des constructions de génération d’ingénierie antigène présentant des cellules exprimant la seule chaîne, culture de clone humain de cellules T CD8 + et les expériences d’activation des cellules T.

Utilisation de la technologie MHC seule chaîne d’enquêter sur les Co-agonisme dans l’Activation des cellules T humaines CD8 +

Cet article décrit un protocole pour la génération des cellules T CD8 antigène-spécifiques, et leur expansion in vitro, dans le but de produire un nombre élevé de lymphocytes T fonctionnels pour une utilisation in vitro et in vivo.

Génération à haut rendement de cellules T cytotoxiques cytotoxiques de souris primaires spécifiques à l'antigène pour les tests fonctionnels dans un modèle de diabète auto-immun

Cet article décrit une méthode pour produire l'antigène fonctionnel induit par l'antigène-spécifique pluripotent cD8MD- cellules T positives uniques utilisant le système de co-culture D'OP9/DLL1.

Utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la génération de lymphocytes T spécifiques à l'antigène tumoral

Découvrez la fabrication de cellules présentatrices d'antigènes artificielles anisotropes en PLGA pour activer les lymphocytes T CD8+. Cette méthode permet un contrôle indépendant de la taille et de la forme des particules biomimétiques.

Fabrication d’anisotrope polymères artificiels cellules présentatrices d’Activation des cellules T CD8 +

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