Name: Culture et la Manipulation des cellules de la crête neurale O9-1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Apprenez à cultiver et manipuler les cellules O9-1 de la crête neurale pour la recherche en neurosciences. Ces protocoles détaillés couvrent la culture, la différenciation et l'édition génétique par siRNA et CRISPR-Cas9.

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Nicole Stancel, Ph.d., ELS, des Publications scientifiques de l’Institut de cardiologie de Texas, fourni un soutien éditorial. Nous remercions également les sources de financement suivantes : subvention de développement de l’American Heart Association nationale Centre scientifique (14SDG19840000 à J. Wang), le 2014 Lawrence Research Award de le Rolanette et Berthiaume Laurent osseuse maladie programme du Texas (à J. Wang ) et les instituts nationaux de santé (DE026561 et DE025873 J. Wang, DE016320 et DE019650 à R. Maxson).

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<li>Zurkirchen, L., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quo+vadis%3A+tracing+the+fate+of+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).</li>
<li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).</li>
<li>Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+neural+crest%3A+a+multigene+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induction of the neural crest: a multigene process.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).</li>
<li>Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+network+during+neural+crest+induction%3A+from+cell+specification+to+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).</li>
<li>Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+neural+crest%3A+achieving+specificity+in+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).</li>
<li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+progenitors+and+stem+cells%3A+from+early+development+to+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).</li>
<li>Henion, P. D., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+pattern+of+cell+fate+restrictions+in+the+neural+crest+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage.</a> Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).</li>
<li>Harris, M. L., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specification+in+neural+crest+cell+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lineage specification in neural crest cell pathfinding.</a> Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).</li>
<li>Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+distinct+neurogenic+and+melanogenic+neural+crest+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages.</a> Development. 130 (2), 321-330 (2003).</li>
<li>Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+early+human+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of early human neural crest development.</a> Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).</li>
<li>Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+neural+crest+stem+cell-derived+dopaminergic+neuronal+model+recapitulates+biochemical+abnormalities+in+GBA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-activated+kinase+1+%28Tak1%29+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li>
<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
<li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway%3A+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li>
<li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippo+signaling+pathway+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The hippo signaling pathway in development and cancer.</a> Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).</li>
<li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo%2FYap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38(2016).</li>
<li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li>
<li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+organ+development%2C+homeostasis%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li>
<li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118(2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li>
<li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208(2016).</li>
<li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li>
<li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%2C+but+not+collagen+I%2C+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004(2012).</li>
<li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li>
<li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La CCN est un collaborateur polyvalent et clé aux différents tissus et organes au cours de la morphogenèse embryonnaire. La lignée cellulaire O9-1 maintient son potentiel à se différencier en plusieurs types de cellules différents et imite les caractéristiques in vivo des CNC, ce qui en fait un outil utile en vitro pour étudier la fonction des gènes et régulation moléculaire en CNC. Les différents statuts des cellules O9-1 peut correspondre à différents crête neurale progéniture en vivo, selon ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Cellules neurales de crête (CNC) sont des cellules souches multipotentes avec une remarquable capacité migratoire et l’existence transitoire durant le développement embryonnaire. Comités nationaux sont créés entre l’ectoderme de surface et le tube neural et migre vers d’autres parties de l’embryon au cours du développement embryonnaire1. Se fondant sur leurs domaines fonctionnels, CNC peut être classées en plusieurs types différents, y compris crânienne, le tronc, vagal, sacrée et CNC cardiaque. De plus, CNC peut se différencier en plusieurs lignées cellulaires, tels que les cellules musculaires lisses, cellules osseuses et les neurones et donner lieu à divers tissus2,3. Le développement des CNC se caractérise par une série complexe d’événements morphogénétiques qui sont affinés par divers signaux moléculaires. Compte tenu de la réglementation complexe des CNC et leur importante contribution aux nombreuses structures, la dérégulation du développement NCC peut entraîner communément congenital malformations congénitales, qui représentent près de 30 % de tous les défauts de naissance humaines congénitales. Anomalies au cours du développement de la crête neurale peuvent conduire à une fente labiale/palatine, viciée nez formation, syndromes, les défauts comme une sortie du cardiaques défectueux, ou même mortalité1,4,5, 6 , 7. comprendre les mécanismes moléculaires du développement de la NCC est important pour développer des traitements pour les maladies causées par des défauts dans le développement de la NCC. Avec l’utilisation de divers in vitro et in vivo des approches8,9,10,11,12,13,14 ,15, des progrès considérables accomplis dans la recherche de la NCC. In vivo, des modèles animaux, y compris les poulets, amphibiens, poissons zèbres et la souris, ont été utilisés pour étudier le CNC1. En outre, des embryons humains ont été utilisés pour étudier le processus de migration de NCC en début de développement embryonnaire humain16. In vitro, des modèles de cellules pour les comités nationaux, tels que CNC humaine qui proviennent de la graisse sous-cutanée patiente, ont été utilisés pour étudier la maladie de Parkinson,17. La ligne O9-1 NCC, qui était à l’origine de cultures de massives des CNC endogène isolé de E8.5 souris embryons18, est un modèle cellulaire puissant pour étudier NCCs. ce qui est important, dans des conditions de culture non-différencier, cellules O9-1 sont comités nationaux de la tige-comme multipotentes. Cependant, dans diverses conditions de culture, cellules O9-1 peuvent être différenciées dans les types de cellules distingués, tels que les cellules musculaires lisses, ostéoblastes, les chondrocytes et les cellules gliales18. Compte tenu de ces propriétés, cellules O9-1 ont été largement utilisés pour les études relatives au NCC, telles que l’enquête sur le mécanisme moléculaire de défauts crânien-facial19,20.
Ici, les protocoles détaillés sont fournis pour maintenir les cellules O9-1, DIFFERENCIATION O9-1 cellules en différents types cellulaires et manipuler des cellules O9-1 en effectuant des études de perte de fonction de gènes avec CRISPR-Cas9 génome d’édition et de petits ARN interférents (siARN)- véhiculée par les technologies knockdown. Comme un exemple représentatif, l’utilisation des cellules O9-1 d’étudier Yap et Taz perte de fonction est décrite. Yap et Taz sont les effecteurs en aval de l’hippopotame, signalisation, qui joue un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, la différenciation et l’apoptose. La voie Hippo a aussi démontrée être important dans le développement et l’homéostasie de plusieurs différents tissus et organes, ainsi que dans la pathogenèse des maladies différentes20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Les composants principaux d’Hippo signalisation comprennent les kinases de 20 comme stérile du suppresseur tumeur Mst1/2, protéine d’échafaudage Salvador contenant du domaine WW et les kinases de homologue (Lats1/2) de suppresseur de tumeur grande. Hippo la signalisation inhibe l’activité de Yap et Taz et favorise leur dégradation dans le cytoplasme. Sans répression de Hippo, Yap et Taz peuvent effectuer des transferts en noyaux et fonction transcriptionnelles activateurs Co. Nous avons récemment démontré que spécifiquement inactivant l’hippopotame effecteurs Yap et Taz en souris CNC de signalisation à l’aide de la Wnt1cre et Wnt1Cre2SOR pilotes ont abouti à une létalité embryonnaire à E10.5 avec sévère Craniofacial défauts20. Nous avons également réalisé des études utilisant des cellules O9-1 pour enquêter sur le rôle de Yap et Taz en CNC. Pour étudier la fonction Yap et Taz dans le NCC prolifération et la différenciation, Yap et Taz knockdown cellules ont été générés dans les cellules O9-1 à l’aide de siARN, et cellules Ko Yap ont été générés en utilisant CRISPR-Cas9 génome édition. Les mêmes stratégies de perte de fonction de gène peuvent être appliqués aux gènes cibles différentes dans d’autres voies. En outre, gain de fonction des études et des essais de transfection peuvent également être appliqués aux cellules O9-1 pour étudier la régulation et la fonction du gène. Les protocoles décrits ici sont destinés à être utilisés par les enquêteurs comme guides pour la culture des cellules O9-1 pour maintenir stemness multipotentes, afin de différencier les cellules O9-1 dans les autres types de cellules dans des conditions de culture différente et pour étudier la fonction des gènes et les mécanismes moléculaires du CNC.

<table><tbody><tr><td>Cellules nourricières actives STO</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1503</td><td>Également disponible sous forme inactivée de mitomycine C, catalogue # ATCC 56-X</td></tr><tr><td>O9-1 souris tête neurale neurale</td> crête lignée <td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glycémie élevée, sans glutamine</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute glycémie</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS (sérum bovin fœtal)</td><td>Millipore Sigma</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline - streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau porcine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25 % dans HBSS</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco) sans calcium ou magnésium</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>MEM acides aminés non essentiels (MEM NEAA) 100Xx</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) 106 unité/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes humains recombinants-basique (rhFGF-basic)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimethylsulfoxyde)</td><td>Millipore Sigma</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x)</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Milieu essentiel minimum, alpha 1x avec sels d’Earle, ribonucléosides, désoxyribonucléosides et L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-041057</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-046247</td><td></td></tr><tr><td>FCS (sérum de veau fœtal)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ITS (insuline-transfertrine-sélénium)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF-b3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide</td><td></td><td></td><td></td>ascorbique</tr><tr><td>BMP2 (protéine morphogénétique osseuse 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supplément</td> de dexaméthasone <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

culture et la manipulation des cellules de la crête neurale o9-1

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Cellules neurales de crête (CNC) Effectuez la migration des cellules souches multipotentes qui peuvent se différencier en divers types de cellules et donnent lieu à de multiples tissus et organes. La lignée cellulaire O9-1 est dérivée de l’endogène CNC embryonnaires de souris et maintient ses multipotentialité. Toutefois, dans des conditions de culture spécifique, cellules O9-1 peuvent se différencier en divers types de cellules et être utilisés dans un large éventail d’applications de recherche. Récemment, avec la combinaison des études sur les souris et O9-1 cellule études, nous avons montré que l’hippopotame effecteurs de la voie de signalisation Yap et Taz jouent des rôles importants en développement craniofacial dérivé de crête neurale. Bien que le processus de culture de cellules O9-1 est plus compliqué que celle utilisée pour les autres lignées cellulaires, la lignée cellulaire O9-1 est un modèle puissant pour l’étude in vitrode la CNC. Nous présentons ici un protocole pour la culture de la lignée cellulaire O9-1 afin de maintenir ses stemness, mais aussi des protocoles permettant de différencier les cellules O9-1 dans différents types de cellules, telles que les cellules musculaires lisses et des ostéoblastes. En outre, les protocoles sont décrits pour effectuer des études de perte de fonction de gènes dans les cellules O9-1 l’utilisation CRISPR-Cas9 suppression et petit parasite-mediated RNA knockdown.

Nos expériences défiant et knock-out visait à étudier les effets de Yap et Taz perte de fonction dans les cellules O9-1. Avant les expériences défiant et knock-out, nous devons assurer qui préparent pour le milieu de base et des cellules de culture O9-1 tel que décrit ci-dessus (par exemple, la membrane basale matrice doit couvrir la plaque entière tel qu’illustré à la Figure 1et O9-1 cellules récupérées de l’azote liquide comme illustré à l...

O9-1 est une lignée de cellules multipotentes souris crête neurale. Nous décrivons ici des protocoles détaillés étape par étape pour mise en culture des cellules O9-1, différencier les cellules O9-1 dans les types spécifiques de cellules et manipuler génétiquement cellules O9-1 à l’aide de précipitation induite par le siARN ou CRISPR-Cas9 génome édition.

Culture et la Manipulation des cellules de la crête neurale O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

La lignée cellulaire O9-1 est un outil très utile pour étudier in vitro les cellules de crête neurale. Il a un grand potentiel d’utilisation dans un large éventail d’applications dans diverses utilisations de la recherche. Les cellules O9-1 ont des avantages évidents, tels qu’un accès facile, et l’obtention rapide de nombres cellulaires suffisants pour des expériences, ce qui en fait une méthode puissante complémentaire aux études in vitro des cellules de crête neurale.Pour commencer, préparez les supports basaux pour la culture cellulaire O9-1, selon le protocole du texte. Filtrez ensuite le fond basal et enveloppez-le dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Après cela, recueillir des supports basiques conditionnés à partir d’une cellule STO activée selon le protocole de texte.Tout d’abord, décongeler un aliquot de matrice membranaire du sous-sol sur la glace pendant deux heures. Ensuite, diluer la matrice membranaire du sous-sol avec le DMEM stérilisé filtré avec 10%FBS à une concentration finale de 0,5 mg/ml. Enduire la plaque de la matrice membranaire du sous-sol à température ambiante pendant une heure.Ensuite, aspirez la matrice membranaire du sous-sol tout

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Pour cultiver des cellules souches neurales de crête (NCSC) in vitro, un milieu spécial (NCSCM) est nécessaire. Partie essentielle de NCSCM est extrait d'embryon de poulet (PECO). Nous décrivons ici les techniques précises pour produire une quantité maximisée de qualité pure et de haute PECO, y compris des détails comme l'isolement, la macération, la centrifugation et la filtration.

Production d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet pour la culture des neurones murins Cellules souches Crest

Isolement de la crête neurale embryonnaire à partir du tube neural facilite l'utilisation...

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

Cette vidéo montre l’utilisation de petits ARN interférents (siRNA) pour réduire au silence des gènes d’intérêt spécifiques dans les cellules souches neurales et les différencier en types de cellules souhaités en utilisant un milieu de différenciation approprié. Cette procédure permet d’étudier le rôle critique de gènes spécifiques dans le processus de différenciation des cellules souches neurales.

Silençage génique médié par siRNA dans des cellules souches neurales

Cette vidéo illustre une technique permettant d’isoler les plis neuraux crâniens de la région du mésencéphale des embryons de poulet. Il présente un processus de dissection détaillé des plis neuraux, leur placement et leur fixation sur des lamelles recouvertes de fibronectine, suivi de l’observation de la migration des cellules de la crête neurale à partir des plis neuraux.

Isolement des plis neuraux crâniens d’un embryon de poulet pour une culture cellulaire de crête neurale

Ce protocole décrit la dissection et la culture des cellules de crête neurale crânienne des modèles de souris, principalement pour l'étude de la migration cellulaire. Nous décrivons les techniques d'imagerie en direct utilisées et l'analyse des changements de vitesse et de forme cellulaire.

Dissection, culture et analyse des cellules neurales primaires de crête neurale de la souris pour l'étude de la délamination et de la migration neurales de cellules de crête

Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de différenciation stable et très efficace pour la génération de neurones sympathiques postganglioniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce modèle rendra les neurones disponibles pour l’utilisation d’études sur de multiples troubles autonomes.

Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement

Nous présentons un modèle in vitro pour évaluer la capacité neurorégénérative olfactive d’ensheathing de glia (OEG), après dommages neuronaux. Il est basé sur une coculture de neurones ganglionnaires rétiniens adultes axotomisés (RGN) sur les monocouches OEG et l’étude subséquente de la régénération axonale, en analysant les marqueurs axonals et somatodendritiques RGN.

Coculture de neurones rétiniens axotomisés de ganglion de rat avec glia ensheathing olfactif, comme modèle in vitro de régénération axonale adulte

Des protocoles détaillés étape par étape sont décrits ici pour étudier les signaux mécaniques in vitro à l’aide de cellules de crête neurale O9-1 multipotentes et d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable.

Un système O9-1/Hydrogel optimisé pour l’étude des signaux mécaniques dans les cellules de la crête neurale

Ce protocole polyvalent décrit l’isolement des cellules de la crête neurale prémigratoire (CCN) par l’excision des plis neuraux crâniens des embryons de poussins. Lors du placage et de l’incubation, les NCC migrateurs émergent des explants de plis neuraux, ce qui permet d’évaluer la morphologie et la migration des cellules dans un environnement 2D simplifié.

Préparation et analyse morphologique de cultures de cellules de crête neurale crânienne de poussin

Ce protocole décrit une expérience de migration in vitro adaptée à l’analyse fonctionnelle des molécules impliquées dans la migration in vivo des cellules de la crête neurale dans la matrice extracellulaire riche en hyaluronane.

In vitro Étude des effets de la matrice extracellulaire riche en hyaluronanes sur la migration des cellules de la crête neurale

Nous présentons un protocole de différenciation in vitro tridimensionnel (3D) générant des neurosphères de taille reproductible pour produire des cellules de crête neurale crânienne à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Nous montrons que cette méthodologie réduit la variabilité par rapport aux protocoles précédents et comment elle peut être utilisée pour le dosage multiplexé afin d’étudier le développement des cellules de la crête neurale crânienne.

Cellules de crête neurale crânienne : protocole de différenciation in vitro tridimensionnelle pour le dosage multiplexé

Apprenez à cultiver et manipuler les cellules O9-1 de la crête neurale pour la recherche en neurosciences. Ces protocoles détaillés couvrent la culture, la différenciation et l'édition génétique par siRNA et CRISPR-Cas9.

Culture et la Manipulation des cellules de la crête neurale O9-1

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