Name: Ex Vivo Imagerie du Calcium cellulaire spécifique de signalisation à la Synapse Tripartite du diaphragme souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique ex vivo au diaphragme de souris pour étudier la signalisation cellulaire à la jonction neuromusculaire. Cette méthode permet de visualiser les réponses des cellules musculaires et de Schwann.

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Ce travail a été soutenu avec des fonds des National Institutes of Health (NIH) GM103554 et GM110767 à (T.W.G.) et le National Center for Research Resources 5P20RR018751 et le National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (pour G.W.H.).

L’élevage et les expériences ont été effectuées conformément au instituts nationaux de santé Guide pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire et l’IACUC à l’Université du Nevada.
1. préparation des diaphragmes et des nerfs phréniques chez des souris transgéniques
<ol><li>Acheter souris transgéniques et des amorces au génotype de ces souris. Remarque : Les amorces sont répertoriés sur la page « Informations » pour chacun de ces souris.<ol>
<li>Reproduire une souris 3 - to 6-month-old exprimant une copie de l’approprié transgéniques/knock-in allèle de Cre-pilote et zéro copies de l’allèle de GCaMP3/6 conditionnelle avec une deuxième souris du même âge exprimant un ou deux exemplaires de conditionnel GCaMP3 / 6 allèle et zéro copies de l’allèle de Cre-pilote.</li>
		<li>Génotype les chiots et marque ceux qui ont des Cre et conditionnelle GCaMP3/6 allèles — ceux-ci seront appellera dorénavant des souris double-transgéniques (p. ex., Myf5-Cre, GCaMP3 conditionnelle)6. Remarque : De cette façon, toutes les données dérivent de souris exprimant une seule copie du Cre et conditionnelle GCaMP3/6 allèles. Ceci est particulièrement important lors de l’ajout dans les autres souris mutantes (p. ex., coups de grâce) à ces croisements.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quand les souris double-transgéniques sont de l’âge approprié (par exemple, un jour après la naissance 0 ou 5 [P0 ou P5] ou adultes), euthanasier les souris en les décapitant avec des ciseaux (pour les souris plus jeunes que P10) ou en les plaçant dans une chambre d’inhalation isoflurane — lorsqu’ils sont n’est plus recevable à pincer la queue avec une paire de pinces, ils sont prêts pour le sacrifice.</li>
	<li>Sacrifier l’animal par décapitation avec une paire de ciseaux.</li>
	<li>Section transversalement à travers l’animal entier juste en dessous du foie et juste au-dessus du cœur et des poumons avec des ciseaux iridectomie.</li>
	<li>Loin de disséquer le foie, le cœur et les poumons, en prenant soin de maintenir une longueur du nerf phrénique qui est suffisamment long pour être aspiré par une électrode d’aspiration (c.-à-d., 1-2 cm). Remarque : Le nerf phrénique gauche peut être identifié comme un morceau blanc de tissu qui s’introduit dans la partie médiale du diaphragme gauche. Il ne doit pas être coupé lorsque vous retirez les poumons. Le nerf phrénique droit s’exécute dans un morceau de carénage qui contient la veine cave supérieure et est plus mince et plus blanc que la veine cave. Ensemble, ils ont tous deux pénètrent le diaphragme droit médial.</li>
	<li>Plus loin, enlever la cage thoracique et la colonne vertébrale, à l’exception de la crête mince autour de la membrane.</li>
	<li>Placer le diaphragme et l’échantillon du nerf phrénique dans un tube à centrifuger avec une solution de Krebs-Ringer avec 594-αBTX de 1 µg/mL pendant 10 min dans l’obscurité. Note : Cette concentration de 594-αBTX étiquettes récepteurs ACh (ACHaRS) sans bloquer leur fonction (observation personnelle).</li>
</ol>2. la stimulation et l’enregistrement des potentiels d’Action musculaires
<ol><li>À l’aide d’épingles à minutien, immobiliser le diaphragme en épinglant sur un plat de 6 cm recouvertes de silicone gel diélectrique et rempli de ~ 8 mL de solution de Ringer-Krebs oxygénée et placez-la sur la platine du microscope. Perfuse le diaphragme avec une solution plus Krebs-Ringer (8 mL/min) pendant 30 min. Remarque : Il rince l’indépendant 594-αBTX, ainsi que s’équilibre les tissus après dissection.</li>
	<li>Faire une électrode d’aspiration selon les méthodes établies7.<ol>
<li>Un grossissement X 4, à l’aide d’un micromanipulateur, déplacez l’électrode d’aspiration sur le nerf phrénique gauche et appliquer la succion en tirant le Canon d’une seringue de 5 mL relié à la tuyauterie qui est attachée à l’électrode d’aspiration. Remarque : Lorsqu’il est dessiné avec succès dans l’électrode d’aspiration, le nerf phrénique est bien tendu. Allumez le stimulateur et stimuler le phrénique nerf en faisant basculer le Manuel commutateur 1 x.</li>
		<li>Veiller à ce que le diaphragme se contracte en réponse à la stimulation de 1 Hz en examinant visuellement il avec éclairage de fond clair. Si ce n’est pas le cas, ajuster la tension en tournant le bouton de tension progressivement pour atteindre une impulsion supramaximal, qui peut être vérifiée par un examen visuel de la contraction musculaire. Si elle est toujours pas visible, souffler le nerf avec la seringue et tenter d’établir nouveau en appliquant d’aspiration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arrêter la perfusion et ajoutez la myosine du muscle spécifique inhibiteur BHC6 ou canal sodique voltage-dépendant antagoniste µ-conotoxine8 à une concentration finale de 100 µM.<ol>
<li>Pour faire 100 µM BHC, distribuer 4 µL de stock de 200 mM dans le DMSO et il predilute dans 1 mL de solution de Ringer-Krebs.</li>
		<li>Retirer le plat de 1 mL de solution de Ringer-Krebs.</li>
		<li>Ajouter le BHC dilué, au plat. Remarque : Cette dilution permet d’éviter l’induction par le DMSO non dilué de réponse fluorescente non transitoires dans les cellules exprimant le GCaMP3.</li>
		<li>Attendre 30 min, puis, tournez sur la perfusion de solution fraîche de Krebs-sonnerie pendant 20-30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer l’électrode d’enregistrement.<ol>
<li>Porter des gants, placer un verre de borosilicate l’avec un diamètre extérieur (OD) de 1 mm et 0,4 mm de diamètre intérieur (ID) dans une de micropipettes et serrer les cadrans pour bloquer en position. Fermer la porte de l’extracteur.</li>
		<li>À l’aide d’un extracteur P-97, programmer le paramètre suivant : chaleur à 900, tirez à 120, vitesse à 75 fois à 250, pression à 500 et pas de boucles supplémentaires. Remarque : Resistance (R) est mesurée à l’aide de contrôles de logiciels de l’amplificateur : le logiciel d’acquisition de données confirme la résistance en résolvant la formule V = IR Le contrôleur logiciel passe un courant connu (I) (typiquement 1 nA) par le biais de l’électrode et mesure la variation de tension (V), nous permettant ainsi de résoudre pour R.</li>
		<li>Pour les membranes embryonnaires, veiller à ce que la résistance est près de 60 MΩ et pour les plus âgés membranes, 10-20 MΩ. Charger l’électrode d’enregistrement avec 3M KCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À un grossissement de 10 X, abaisser l’électrode dans le muscle, à l’aide d’un micromanipulateur deuxième sur le côté opposé de la scène comme une électrode de stimulation.</li>
	<li>À l’aide de logiciels d’acquisition de données électrophysiologiques, attendez jusqu'à ce que le potentiel membranaire de repos varie de 0 à -65 mV ou ci-dessous.</li>
	<li>Stimuler à 1 Hz et vérifier la présence d’un potentiel d’action musculaire en recherchant un grand potentiel qui présente un dépassement modeste (potentiel qui s’élève au-dessus de 0 mV quand il commence à -65 mV ou ci-dessous). Ne confondez pas l’artefact de la stimulation avec un potentiel d’action. Remarque : Les potentiels sont beaucoup plus longues en durée (~ 5 ms) que les artefacts de stimulation.</li>
</ol>3. imagerie de Fluorescence de l’échantillon
<ol><li>Grossissement de 20 X, repérez la plaque d’extrémité bande au centre du muscle en recherchant NMJ 594-αBTX – étiquetés sous excitation lumineuse vert/jaune (550 nm). Passer à l’excitation lumineuse bleue (470 nm) à l’image Ca2 + réponses dans le muscle, neurone moteur ou les cellules de Schwann.</li>
	<li>Si vous le souhaitez, mettre en place le séparateur d’image avec filtres passe-bande et un filtre dichroïque de single-edge pour l’imagerie à double longueur d’onde.</li>
	<li>Afin de calculer la fluorescence maximale (Fmax) exposée par GCaMP3/6-exprimant le tissu, ajouter 12 µL 3M de chlorure de potassium (KCl) dans les préparations de diaphragme6.<ol>
<li>Réaliser des expériences avec la barre de luminosité sur la barre de recherche table fixée à 110 % du niveau auquel le tissu GCaMP3/6-exprimant pièces saturation au grossissement de 20 X, sans binning en réponse au KCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enregistrer à 20 images par seconde pas manquer aucun événement rapide.</li>
	<li>Stimuler avec 1-45 s de 20-40 Hz de stimulation nerveuse en livrant un train d’impulsions à l’aide de l’électrode d’aspiration ou ajouter agonistes pharmacologiques par application de bain ou en perfusion et recueillir fluorescent Ca2 + réponses dynamiques dans le sous-type d’une cellule ainsi que le signal NMJ statique 594-αBTX. Remarque : Si souris tissu-spécifique de rouge ou rouge sombre GECI ou GEVI seront disponibles pour une utilisation à la NMJ, ils peuvent servir à recueillir deux signaux dynamiques reflétant deux éléments cellulaires distincts à la NMJ.</li>
	<li>Lorsque les expériences d’imagerie ou électrophysiologiques sont finis parce que les résultats escomptés ont été atteints, perfuse l’eau à travers les lignes de perfusion et aspirer l’eau 2 x - 3 x par le biais de l’électrode d’aspiration pour s’assurer que les sels ne construisent pas vers le haut.</li>
</ol>4. exportation et analyse des données par une carte d’intensité de Fluorescence de l’écart-type (SDiu16)
<ol><li>Enregistrez des séquences d’images enregistrées comme piles TIFF 16 bits et de les charger dans le système d’analyse données d’imagerie désiré pour l’analyse.</li>
	<li>Dans le menu du logiciel 8D fichier, sélectionnez Image pile d’intérêt et cliquez pour charger.<ol>
<li>Une fois que la vidéo se charge, parcourir le temps d’identifier une section qui n’exerce aucune activité cellulaire fluorescente. Remarque : Cette région servira à créer un échantillon de fond.</li>
		<li>Maintenez MAJ enfoncée et cliquez pour tirer une région de la zone d’intérêt (ROI) dans la zone identifiée comme la zone de prélèvement de fond.</li>
		<li>Après avoir créé la zone, appuyez sur la barre d’espace pour générer une parcelle du changement de l’activité de fond.</li>
		<li>Faites un clic droit de la trace et sélectionnez l’option assorties de présenter l’option Vider le ROI sous forme de texte pour faire la trace dans un fichier de texte coordonnées xy.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour en revenir à la vidéo d’intérêt, Renumériser pour identifier la zone de temps où l’activité d’intérêt se produit.<ol>
<li>En utilisant le bouton central de la souris, sélectionnez cette région de temps dans la boîte jaune.</li>
		<li>Faites un clic droit sur la vidéo et sélectionnez Pile OPS , puis Stat carte option 5. Remarque : Cela va générer une carte d’écart-type (carte SD) dans la fenêtre de gauche.</li>
		<li>Cliquez sur la carte SD et ensuite sur le ] la touche x 19 à appliquer le plan de chaleur de couleur appropriée.</li>
		<li>Faites un clic droit de la carte SD et sélectionnez STM charger et enregistrer, qui présentera l’option Enregistrer stm comme tiff pour enregistrer la carte SD.</li>
		<li>Ensuite, appuyez sur la [ clé 19 x pour revenir à une carte de couleur en niveaux de gris.</li>
		<li>Appuyez sur C , puis D à mettre en place des outils de cartographie de la densité. En utilisant le bouton gauche de la souris et le bouton de la souris du centre, ajustez le seuil pour y inclure toute activité fluorescente indiquée sur la carte SD.</li>
		<li>Appuyez sur C pour fermer les outils densité tout en conservant les paramètres de seuil.</li>
		<li>Avec le bouton droit de la carte SD et sélectionnez les particules STM , puis Trouver PTCLS. Remarque : Ceci permettra d’identifier des cellules individuelles exprimant l’activité fluorescente.</li>
		<li>Faites un clic droit de la carte SD une fois de plus, puis sélectionnez Créer des ROIs de particules. Remarque : Cela va superposer les cellules sélectionnées sur la vidéo originale d’intérêt.</li>
		<li>Tout en maintenant Shift, faites un clic droit sur l’un de la particule maintenant identifié ROIs sur la vidéo originale.</li>
		<li>Sélectionnez marqueur ROI et mesure Int au ROI. Remarque : Cela génèrera les parcelles individuelles activité fluorescent pour chaque ROI identifié dans la vidéo d’intérêt. Ceux-ci peuvent être sauvés par un clic droit sur l’un d'entre eux et sélectionnant assortis, suivies d’un ROI Dump sous forme de texte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour logique détaillée de ces opérations, veuillez consulter le fichier de code source9.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li>
<li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+%28GECIs%29+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).</li>
<li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).</li>
<li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li>
<li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+geographutoxin+II+%28mu-conotoxin%29+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li>
<li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Ca2%2B+signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839(2018).</li>
<li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous fournissons ici quelques exemples de mesure Ca2 + réponses dans certaines cellules dans le tissu neuromusculaire intact, à l’aide de souris exprimant le GECI. Pour réaliser ces expériences, il est impératif de ne pas blesser le nerf phrénique au cours de la dissection. Pour image réponses Ca2 + dans les cellules de Schwann à haute ou basse puissance (c'est-à-dire, 20 X ou 60 X), il est nécessaire d’utiliser le BHC ou µ-conotoxine au mouvement du bloc. Pour l’imagerie de la faible puiss...

Le NMJ, comme toutes les synapses, se compose de trois éléments : une terminaison présynaptique dérivé d’un neurone, une cellule de neurone postsynaptique/effecteurs, et un périsynaptique glial cell1,2. Alors que les aspects fondamentaux de la transmission synaptique étaient tout d’abord montrés à cette synapse3, beaucoup d’aspects de ce processus demeure inconnus, en partie en raison de l’expression des molécules de mêmes par les éléments cellulaires distincts de cette synapse. Par exemple, des récepteurs pour les séquences de nucléotides puriques adénine ATP et l’acétylcholine (ACh), qui sont conjointement libérées par les neurones moteurs à la NMJ vertébré, sont exprimés par muscle, les cellules de Schwann et les neurones moteurs, ce qui complique l’interprétation de le quelconque effet fonctionnel exercée par ces substances (p. ex., libération des transmetteurs ou réponse, génération de la force musculaire)4. En outre, bien que les composants tripartites de la NMJ sont simples par rapport à, par exemple, les neurones du système nerveux central qui présentent souvent des entrées synaptiques multiples, si les motoneurones, les cellules musculaires ou des cellules de Schwann varient en réponse à des stimuli basé sur leur intrinsèque hétérogénéité (p. ex., dérivation embryonnaire, sous-type de fibre, morphologie) n’est pas claire. Afin de répondre à chacune de ces questions, il serait avantageux de suivre simultanément la réponse de plusieurs cellules dans un seul élément synaptique, ainsi que piste, en même temps, une telle réponse dans un des autres éléments distincts. Les stratégies conventionnelles utilisant des teintures chimiques pour mesurer la signalisation calcique ne peut pas atteindre ces deux buts, car appliqué au bain de teinture est repris par plusieurs types de cellules après application sur tissu, et utilisable uniquement dans les cellules chargées de colorant pour visualiser individuels ou de petites cohortes de cellules. Ici, utilisant des souris transgéniques exprimant GECIs conçu pour mesurer la signalisation calcique spécifique des cellules, ainsi que l’imagerie spécifique et logiciels outils5, nous montrer la première de ces deux objectifs généraux et discuter comment l’ajout de nouveaux outils transgéniques permettrait d’atteindre le second. Cette technique sera utile pour tous ceux intéressés par le suivi dynamique du calcium ou autres cellulaires observables d’événements de signalisation par l’intermédiaire de capteurs optiques gène codé dans plusieurs populations de cellules en même temps.

<table><tbody><tr><td>Souris Myf5-Cre</td><td>Jax</td><td>#007893</td><td>Stimule l’expression des cellules musculaires dès E136</td></tr><tr><td>Wnt1-Cre</td><td>souris Jax</td><td>#003829</td><td>Stimule l’expression dans toutes&nbsp ; Cellules de Schwann à E13 mais pas à P209</td></tr><tr><td>Sox10-Cre</td><td>souris Jax</td><td>#025807</td><td>Stimule l’expression des cellules de Schwann à des âges plus avancés</td></tr><tr><td>Souris GCaMP3 conditionnelles</td><td>Jax</td><td>#029043</td><td>Exprime GCaMP3 de manière spécifique à la cellule</td></tr><tr><td>Souris GCaMP6f conditionnelles</td><td>Jax</td><td>#024105</td><td>Exprime GCaMP6f de manière spécifique à la cellule</td></tr><tr><td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td><td>Hit2Lead</td><td>#5102862</td><td>Bloque la myosine musculaire squelettique mais pas la neurotransmission6</td></tr><tr><td>CF594-&alpha ;-BTX</td><td>Biotium</td><td>#00007</td><td>Marque les grappes de récepteurs de l’acétylcholine aux</td></tr> <tr><td>peptides</td> NMJ<td>&micro ;-conotoxine GIIIb</td> Int’l<td>#CONO20-01000</td><td>Blocs Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td></tr><tr><td>Gel diélectrique de silicone ; alias Sylgard</td><td>Ellswoth Adhesives</td><td># Sil Dielec Gel .9KG&nbsp ;</td><td>Permet l’immobilisation du diaphragme par des broches minutiennes</td></tr><tr><td>Broches minutieuses (0,1 mm de diamètre)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Immobilise le diaphragme sur le gel diélectrique de silicone</td></tr><tr><td>Microscope droit Eclipse FN1&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td>MBA74100</td><td>Permet la mise en scène et l’observation de l’échantillon</td></tr><tr><td>Plate-forme de microscope fixe de base avec traducteur manuel de microscope XY&nbsp ;</td><td>Autom8</td><td>MXMScr</td><td>Permet le déplacement de l’échantillon</td></tr><tr><td>Micromanipulateur manuel.</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>Contient des électrodes d’enregistrement et de stimulation</td></tr><tr><td>Amplificateur à microélectrodes&nbsp ;</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A</td><td>Permet l’enregistrement électrophysiologique intracellulaire à électrodes pointues</td></tr><tr><td>Système d’acquisition de données à faible bruit</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1550&nbsp ;</td><td>Permet l’acquisition de données électrophysiologiques</td></tr><tr><td>Système d’analyse de données à microélectrodes</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>PCLAMP 10 Standard</td><td>Effectue une analyse de données électrophysiologiques</td></tr><tr><td>Stimulateur à ondes carrées</td><td>Herbe</td><td>S48</td><td>Stimule le nerf pour exciter le muscle</td></tr><tr><td>Unité d’isolation de stimulus</td><td>Herbe</td><td>PSIU6</td><td>Réduit les artefacts de stimulation</td></tr><tr><td>Filaments borosilicatés, diamètre extérieur de 1,0 mm, diamètre intérieur de 0,5 mm.</td><td>Sutter</td><td>FG-GBF100-50-15</td><td>Empale et enregistre les potentiels musculaires évoqués par les nerfs Filaments</td></tr><tr><td>borosilicatés, diamètre extérieur de 1,5 mm, diamètre intérieur de 1,17 mm&nbsp ;</td><td>Sutter</td><td>BF150-117-15</td><td>Allongé et utilisé pour l’électrode d’aspiration</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Sutter</td><td>P-97&nbsp ;</td><td>Tire et prépare les électrodes d’enregistrement</td></tr><tr><td>Caméra cMOS rétroéclairée de 1200 x 1200 pixels&nbsp ;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95b</td><td>Caméra sensible qui permet une imagerie haute résolution et haute vitesse</td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>Lumencor</td><td>Spectra X</td><td>Fournit un éclairage à partir de LED pour l’observation de la fluorescence</td></tr><tr><td>. Objectifs fluorescents à immersion dans l’eau corrigés à l’infini, D.E. 2 mm</td><td>Nikon</td><td>CFI60</td><td>Fournit de longues distances de travail pour la visualisation de l’échantillon</td></tr><tr><td>Illuminateur à fibre optique avec lampe halogène</td><td>Sumita</td><td>LS-DWL-N</td><td>Fournit un éclairage pour l’observation en fond clair</td></tr><tr><td>W-View Gemini Image Splitter&nbsp ;</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>projette 1 paire d’images à double longueur d’onde séparées par un dichroïque à une seule caméra</td></tr><tr><td>Filtres passe-bande monobande&nbsp ; (512/25-25 et 630/92-25)&nbsp ;</td><td>SemRock</td><td>FF01-512/25-25 ; FF01-630/92-25</td><td>Permet l’imagerie bi-bande</td></tr><tr><td>560 nm Séparateur de faisceau dichroïque à bord unique</td><td>Sem Rock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Miroir dichroïque qui sépare les faisceaux de lumière pour permettre une imagerie à double longueur d’onde</td></tr><tr><td>Système d’acquisition de données d’imagerie</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements - MQS31000</td><td>Permet l’acquisition de données d’imagerie</td></tr><tr><td>Module de contrôle de longueur d’onde</td><td>Module MQS41220</td><td></td><td>Nikon pour les données d’imagerie acqusiition</td></tr><tr><td>Module matériel de répartiteur d’émissions&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td>MQS41410</td><td>Module pour l’acquisition de données d’imagerie</td></tr><tr><td>Système d’analyse de données d’imagerie</td><td>NA</td><td>Volumétrie 8D5, Fiji</td><td>Permet l’analyse de l’intensité de fluorescence et d’autres données d’imagerie</td></tr></tbody></table>

ex vivo imagerie du calcium cellulaire spécifique de signalisation à la synapse tripartite du diaphragme souris

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

L’activité électrique des cellules dans les tissus peut être surveillée par des techniques électrophysiologiques, mais ceux-ci sont généralement limités à l’analyse des cellules individuelles. Puisqu’une augmentation du calcium intracellulaire (Ca2 +) dans le cytosol se produit souvent en raison de l’activité électrique, ou en réponse à une myriade d’autres stimuli, ce processus peut être surveillé par l’imagerie de cellules chargé avec fluorescentes sensibles au calcium colorants.  Toutefois, il est difficile d’imager cette réponse en un type de cellule individuelle au sein de tissus entiers parce que ces colorants sont repris par tous les types de cellules dans les tissus. En revanche, les indicateurs de calcium génétiquement encodé (GECIs) peuvent être exprimées par un type de cellule individuelle et sont fluorescents en réponse à une augmentation du Ca intracellulaire2 +, ce qui permet l’imagerie de Ca2 + signalisation des populations entières de types de cellules individuelles. Ici, nous appliquons l’utilisation du GECIs GCaMP3/6 à la jonction neuromusculaire de la souris, une synapse tripartite entre les motoneurones du muscle squelettique et terminal/périsynaptique les cellules de Schwann. Nous démontrent l’utilité de cette technique dans les préparations de tissu classique ex vivo . À l’aide d’un diviseur optique, nous réalisons l’imagerie double longueur d’onde des signaux dynamiques de Ca2 + et une étiquette statique de la jonction neuromusculaire (NMJ) dans une approche qui pourrait être facilement adaptée pour surveiller deux GECI spécifiques des cellules ou tension génétiquement encodée indicateurs (GEVI) simultanément. Finalement, nous discutons les routines utilisées pour capturer des cartes spatiales de l’intensité de la fluorescence. Ensemble, ces techniques optiques, transgéniques et analytiques peuvent être utilisées pour étudier l’activité biologique des sous-populations de cellules distinctes à la NMJ dans une grande variété de contextes.

Plusieurs exemples de changements d’intensité de fluorescence, médiées par l’augmentation du Ca intracellulaire2 + dans les types de cellules déterminées de la NMJ, montrent l’utilité de cette approche. Ces résultats sont présentés sous forme de cartes d’intensité spatiale de fluorescence, qui fournissent la localisation des cellules ayant répondu au questionnaire, ainsi que l’intensité de leurs réponses, ce qui permet l’évaluation de combien les cellules réagissent et combien ...

Nous présentons ici un protocole au calcium image de signalisation dans les populations de types de cellules individuelles à la jonction neuromusculaire murine.

Ex Vivo Imagerie du Calcium cellulaire spécifique de signalisation à la Synapse Tripartite du diaphragme souris

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neuromusculaire, comme le rôle de la signalisation du calcium dans les cellules musculaires ou schwann en réponse à la stimulation nerveuse. Le principal avantage de cette technique est que l’on peut l’image de l’activation de types de cellules spécifiques en réponse à la stimulation nerveuse. Pour commencer, obtenir des souris transgéniques, et génotypez-les comme détaillé dans le protocole de texte.Après l’euthanasie, section transversale à travers l’animal entier juste en dessous du foie et juste au-dessus du cœur et des poumons avec des ciseaux iridectomy. Disséquez le foie, le cœur et les poumons. Prendre soin de maintenir une longueur du nerf phrénique suffisamment longue pour être aspirée dans une électrode d’aspiration.Retirez davantage la cage thoracique et la colonne vertébrale, à l’exception de la mince crête autour du diaphragme. Placez le diaphragme et l’échantillon de nerf phrénique dans un tube de microfuge avec la solution Krebs-Ringer contenant un microgramme par millilitre d’alpha bungarotoxin étiqueté fluorescent. Laissez le spécimen couver dans la solution pendant 10 minutes dans l’obscurité.À l’aide d’épingles minutien immobiliser le diaphragme en l’épinglant sur un plat de six centimètres recouvert de gel diélectrique en silicone et rempli d’environ huit millilitres de solution Krebs-Ringer oxygénée. Placez le plat au microscope. Ensuite, perfusez le diaphragme avec plus de solution Krebs-Ringer à huit millilitres par minute pendant 30 minutes.À quatre reprises grossissement, à l’aide d’un micromanipulateur, déplacer l’électrode d’aspiration sur le nerf phrénique gauche. Appliquez l’aspiration en retirant le canon d’une seringue de cinq millilitres reliée au tube qui est fixé à l’électrode d’aspiration. Assurez-vous que le diaphragme se contracte en réponse à la stimulation hertzienne en l’examinant visuellement avec l’éclairage Brightfield.Sinon, ajustez la tension en tournant le bouton de tension progressivement pour obtenir une impulsion supramaximale qui peut être vérifiée par l’examen visuel de la contraction musculaire. S’il n’est toujours pas visible, soufflez le nerf avec la seringue et essayez de la tirer à nouveau en appliquant l’aspiration. Maintenant, éteignez la perfusion pour ajouter l’inhibiteur de la myosine spécifique au muscle BHC ou l’antagoniste du canal de sodium fermé par tension mu-conotoxin.Préparer la pré-dilution du BHC en pipetant quatre microlitres de 200 millimolaires de stock BHC dans DMSO en un millilitre de solution Krebs-Ringer. Retirer un millilitre de la solution Krebs-Ringer du plat. Ajouter ensuite le BHC pré-dilué au plat.Après 30 minutes, allumer la perfusion de la solution Krebs-Ringer fraîche pendant encore 20 à 30 minutes. En portant des gants, préparez l’électrode d’enregistrement en plaçant un verre filamenté borosilicate d’un diamètre extérieur d’un millimètre et d’un diamètre intérieur de 0,4 millimètre dans un pull de micropipette. Serrez les cadrans pour le serrer en position et fermez la porte du tiroir.Programmez ensuite le puller tel que décrit dans le protocole texte. Pour les diaphragmes embryonnaires, mesurez la résistance à l’aide des commandes logicielles de l’amplificateur. Assurez-vous que la résistance est proche de 60 mégaohms et pour les diaphragmes plus anciens, 10 à 20 mégaohms.Maintenant, chargez l’électrode d’enregistrement avec trois chlorure de potassium molaire. À 10 fois le grossissement, abaissez l’électrode dans le muscle à l’aide d’un deuxième micromanipulateur de l’autre côté de la scène comme électrode stimulante. À l’aide d’un logiciel d’acquisition de données électrophysiologiques, attendez que le potentiel de la membrane de repos passe de zéro à moins 65 millivolts ou moins.Stimulez à un hertz et vérifiez la présence d’un potentiel d’action musculaire en vérifiant un grand potentiel qui présente un dépassement modeste. Ne confondez pas l’artefact de stimulation avec un potentiel d’action. À 20 fois le grossissement localiser la bande de plaque d’extrémité au centre du muscle en recherchant fluorescente étiquette alpha bungarotoxin jonctions neuromusculaires sous excitation lumière jaune vert.Passez à l’excitation de la lumière bleue pour l’image des réponses de calcium dans les cellules musculaires, motoneuriques ou schwann. Dans cet exemple GCaMP trois est exprimé dans les cellules musculaires. Si vous le souhaitez, configurez le séparateur d’image avec des filtres de passage de bande et un filtre dichroïque à bord unique pour l’imagerie à double longueur d’onde.Effectuez des expériences avec la barre de luminosité sur la barre de table de recherche fixée à 110% du niveau auquel l’indicateur de calcium génétiquement codé exprimant les tissus présente une saturation à 20 fois le grossissement sans binning en réponse au chlorure de potassium. Enregistrez à 20 images par seconde afin de ne pas manquer d’événements rapides. Stimulez avec un à 45 secondes de 20 à 40 hertz de stimulation nerveuse en livrant un train d’impulsions à l’aide d’une électrode d’aspiration et de recueillir des réponses dynamiques de calcium fluorescent dans un sous-type cellulaire avec le statique fluorescent étiqueté alpha bungarotoxin signal de jonction neuromusculaire.Les agonistes pharmacologiques peuvent également être ajoutés par application de bain ou par perfusion et les réponses fluorescentes dynamiques de calcium peuvent être rassemblées de la même manière. Lorsque les expériences d’imagerie ou d’électrophysiologie sont terminées parce que les résultats souhaités ont été atteints, perfuser l’eau à travers les lignes de perfusion et sucer l’eau deux à trois fois à travers l’électrode d’aspiration pour s’assurer que les sels ne s’accumulent pas. Une carte spatiale des réponses de calcium de cellules de Schwann à la stimulation phrénique de nerf d’un Wnt un GCaMP trois diaphragme de souris au septième jour post natal montrent une restriction aux cellules synaptiques terminales de Schwann à la jonction neuromusculaire.Le même diaphragme a été photographié après étiquetage avec bungarotoxin alpha fluorescentement étiqueté, qui se lie pour permettre aux récepteurs d’acétylcholine de la jonction neuromusculaire. Le même diaphragme a également été photographié sous l’illumination de Brightfield pour guider une électrode d’enregistrement à la région post-synaptique du muscle par la jonction neuromusculaire. Il est indiqué ici la démarcation spatiale des cellules codées en couleur ou des régions d’intérêt prises pour l’analyse des transitoires individuels de calcium.La carte spatiale des réponses de calcium de cellules musculaires d’un mth 5 GCaMP trois diaphragme de souris à P quatre à la stimulation phrénique de nerf en présence de l’inhibiteur de myosin BHC montre une réponse dans toute la région de toutes les cellules musculaires de diaphragme. En revanche, la stimulation du même diaphragme en présence de mu-conotoxine provoque une réponse de calcium spatialement restreinte dans la région médiale de toutes les cellules musculaires du diaphragme qui correspond à la bande de plaque d’extrémité enrichie par cluster récepteur d’acétylcholine. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme l’immuno histochimie ou l’immunoblotting peuvent être réalisées afin de répondre à d’autres questions telles que le profil moléculaire des cellules identifiées par électrophysiologie ou imagerie calcique?Cette méthode peut fournir un aperçu des réponses de la population des cellules de Schwann et des cellules musculaires à la stimulation nerveuse chez les souris néonatales normales. Il peut également être appliqué à l’étude de souris plus âgées ou à l’étude de souris exprimant des protéines associées aux maladies neuromusculaires.

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JoVE Journal

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Neurosciences

Source : Heredia, D. J., et. al. Imagerie ex vivo de la signalisation calcique spécifique à la cellule au niveau de la synapse tripartite du diaphragme de la souris. J. Vis. Exp. (2018) Cette vidéo démontre l’imagerie par fluorescence de la dynamique calcique au niveau des jonctions neuromusculaires (NMJs) chez une souris transgénique exprimant des indicateurs calciques génétiquement codés. Un NJM est identifié par des récepteurs d’acétylcholine marqués par fluorescence dans le diaphragme avec...

Imagerie par fluorescence de la dynamique calcique au niveau des jonctions neuromusculaires du diaphragme d’une souris transgénique

Source : Shannonhouse, J., et al. Imagerie calcique in vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions de la racine dorsale intacts. J. Vis. Exp. (2023). La vidéo fait la démonstration d’une technique d’imagerie calcique in vivo pour surveiller l’activité neuronale dans les ganglions de la racine dorsale (DRG) d’une souris transgénique. Les neurones DRG expriment un indicateur de calcium qui augmente l’intensité de la...

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