Name: Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Apprenez l'analyse d'invasion des cellules cancéreuses en 3D avec le système HMCA pour le dépistage de médicaments anti-métastatiques. Cette méthode permet un suivi continu et une analyse à haut débit des sphéroïdes tumoraux.

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Ce travail est soutenu par le legs de Moshe Shimon et Judith Weisbrodt.

1. HMCA plaque de gaufrage
Remarque : Le processus complet pour la conception et la fabrication du timbre de polydiméthylsiloxane (PDMS) et plaque d’imagerie HMCA utilisé dans le présent protocole est décrit en détail dans notre précédent article15,16. Le timbre PDMS (forme négative) sert à gaufrer le HMCA (forme positive) qui se compose d’environ 450 MCs / puits (Figure 1 a). Comme le montre la Figure 1 b, chacune des MCs a une forme d’une pyramide tronquée de forme carrée à l’envers (hauteur : 190 µm, petite surface de base : 90 µm x 90 µm et grande surface de base : 370 µm x 370 µm). La plaque HMCA est utilisée pour la préparation et la mise en culture des sphéroïdes 3D tumeur et par la suite, pour l’analyse de l’invasion. Par ailleurs, un timbre commercial pourrait servir pour la production de HMCA.
<ol><li>Préparer une solution de 6 % d’agarose fusion faible (CGL). Insérez la poudre LMA salin stérile tamponnée au phosphate (PBS) (0,6 g de CGL pour 10 mL de PBS) dans une bouteille en verre avec un agitateur magnétique. Placer la bouteille sur une plaque chauffante et agiter la solution tout en chauffage à 80 ° C pendant quelques heures jusqu'à l’obtention d’une solution uniforme. Conserver la solution à 70 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Pré-chauffer le timbre PDMS à 70 ° C dans le four. Garder au chaud jusqu'à l’utilisation. Vous pouvez également utiliser un timbre commercial et suivez les instructions.</li>
	<li>Placez les plaques de fond en verre 6 puits commercial sur un bain sec préchauffé à 75 ° C. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que la plaque est totalement chaude.</li>
	<li>Versez une goutte (400 µL) de LMA préchauffé sur le fond de verre de chacun des puits de la plaque. Placez délicatement le timbre PDMS préchauffé sur la goutte de gel d’agarose. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 – 10 min pour la gélification et refroidissement préalable. Incuber à 4 ° C pendant 20 min atteindre la pleine d’agarose gélification. Ensuite, décollez délicatement le PDMS, laissant le gel d’agarose à motifs avec MCs. Remarque : Cette étape se faite simultanément dans tous les puits.</li>
	<li>Placer la plaque en relief dans un système équipé de lampe ultraviolette (UV) à lumière et incuber pendant 3 min. Remarque : La plaque HMCA est maintenant UV stérilisé.</li>
	<li>Remplir les puits-macro avec du PBS stérile pour s’assurer qu’ils sont maintenus humides, puis la plaque de recouvrement, l’envelopper avec du parafilm et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Avant utilisation, vider les résidus de PBS de la plaque HMCA. Placez-le dans la hotte biologique.</li>
</ol>2. chargement de cellules et la Formation sphéroïde
<ol><li>Recueillir les cellules comme suit : supprimer tout moyen d’une monocouche de cellules de plaque de culture 10 cm, laver deux fois avec 10 mL de PBS, afin de disposer des résidus de sérum, ajouter 5 mL de trypsine (préalablement chauffée à 37 ° C) et incuber pendant 3 min dans l’incubateur à 37 ° C. Ensuite, secouez la plaque doucement pour s’assurer que le détachement de la monocouche, ajouter 10 mL de milieu complet (préalablement chauffé à 37 ° C) et la pipette de haut en bas jusqu'à ce que la suspension cellulaire homogène est obtenue. Centrifuger et laver la suspension cellulaire avec 15 mL de milieu frais, puis, suspendre à des concentrations appropriées dans un milieu frais complet.</li>
	<li>Charger doucement la suspension cellulaire (50 µL, 150-360 x 103 cellules/mL dans le milieu, ~ 16 – 40 cellules par MC) sur le dessus de la HMCA et laisser les cellules à régler par gravité pendant 15 min.</li>
	<li>Doucement, ajoutez 6 à 8 portions de 500 µL de milieu frais (total 3 à 4 mL) jusqu’au bord du puits de macro en plastique fond en dehors du ring et hydrogel tableau.</li>
	<li>Incuber les cellules HeLa pendant 72 h et cellules MCF7 pendant 48 h à 37 ° C et 5 % de CO2, dans une atmosphère humidifiée pour la formation des sphéroïdes.</li>
</ol>3. viabilité détection par l’iodure de Propidium (PI) coloration
<ol><li>Préparer une solution de PI (500 µg de PI par 1 mL de PBS). Conserver à 4 ° C pour environ 6 mois. Fraîchement, préparer une dilution de 1:2,000 (0,25 µg/mL), par l’addition de 6 µL de stock à 12 mL de milieu complet sans rouge de phénol, de la plaque HMCA de 6 puits (2 mL / puits).</li>
	<li>Transférer la plaque HMCA avec sphéroïdes de 48 à 72 heures, de l’incubateur à la hotte biologique. Supprimer tous les moyen du HMCA en vous penchant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique à côté de la baie d’hydrogel, laissant le réservoir tableau rempli de milieu.</li>
	<li>Doucement ajouter 2 mL de la dilution de la PI d’étape 3.1 dans chaque puits, en s’appuyant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique. Incuber la plaque HMCA pendant 1 h à 37 ° C et 5 % CO2, dans une atmosphère humidifiée. Passez à l’étape 7. Remarque : Autres colorants peuvent être utilisés ici même, par exemple, Hoechst pour noyau la souillure, tétraméthylrhodamine méthylester (TMRM) pour le potentiel de membrane mitochondrial coloration, fluorescéine diacétate (FDA) pour la détection des cellules vivantes, Annexin V pour l’apoptose détection et autres.</li>
</ol>4. préparation de mélange collagène
<ol><li>Préparez l’eau bidistillée stérile (DDW) en autoclave et un stock de 100 mL d’une solution stérilisée par filtration de NaOH 1 M. Maintenir les matériaux RT, et les conseils pour la préparation de mélange collagène congelée à-20 ° C, jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>10 – 20 min avant utilisation, placer tous les intermédiaires dont : stérile DDW, solution stérile de 1 M de NaOH, stérile 10 x PBS, du collagène type I de queue de rat (conservés à 4 ° C pendant 3-mois) et un tube stérile dans le bac à glaçons jusqu'à ce que totalement refroidi. Placez le bac à glaçons à l’intérieur de la hotte biologique.</li>
	<li>Préparer 1 800 µL du mélange de collagène à une concentration finale de 3 mg/mL, plaque 6 puits HMCA invasion assay (300 µL / puits) comme suit. Ajouter les intermédiaires dans le tube de refroidissement dans l’ordre suivant : 515 µL de DDW, 24,8 µL de 1 NaOH M et 180 µL de PBS 10 x. Mélangez bien en vortex et place dans la glace. Enfin, ajouter 1080 µL de collagène dans le mélange, vortex à nouveau et remettre dans la glace.</li>
</ol>5. HA et préparation de mélange collagène
<ol><li>Dissoudre 10 mg de HA dans 2 mL de DDW stérile. Incuber le mélange à ta pendant quelques minutes et vortex doucement jusqu'à ce que la poudre se dissout totalement. Stocker la solution-mère à 4 ° C jusqu'à deux ans.</li>
	<li>Juste avant utilisation, placer la solution HA dans le bac à glaçons à l’intérieur de la hotte biologique.</li>
	<li>Préparer un 3 mg/mL de mélange collagène tel que décrit à l’étape 4. Ajouter 36 µg (7,2 µL) d’HA dans 1 800 μL de prêt à l’emploi de mélange de collagène, pour une concentration finale de 20 µg/mL. Puis, vortex à nouveau brièvement et mettre de nouveau dans la glace.</li>
</ol>6. ECM mélange ajout
<ol><li>La plaque HMCA, à sphéroïde de 48 à 72 h, de transfert de l’incubateur dans la hotte biologique et placez-le sur la glace. Incuber pendant 10 min jusqu'à ce que la plaque est refroidie. Préchauffer une solution de 1 % CGL à 37 ° C dans un bain d’eau.</li>
	<li>Supprimer tous les moyen d’autour de la HMCA, en s’appuyant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique à côté de la baie d’hydrogel. Puis, très soigneusement, enlever toutes les moyennes du réservoir tableau avec un fin pointe/gel chargement astuce, en s’appuyant l’extrémité sur le bord du tableau, lentement et doucement sucer tous support sur. Remarque : Après avoir enlevé tous les moyen d’autour de la baie d’hydrogel, le réservoir tableau est toujours rempli de moyen. Ce support doit être retirée très doucement afin d’éviter la destruction de l’hydrogel MC et dislocation des sphéroïdes.</li>
	<li>Prenez 150 µL du mélange collagène ou HA et le collagène (mélange de ECM) avec la pointe fine surgelée et ajouter dans le réservoir de tableau en joignant la pointe vers le bord du tableau. Communiqué le mélange lentement pour éviter la dislocation de l’ellipsoïde. Répétez cette étape avec une autre partie aliquote de 150 µL, pour un total de 300 µL / puits. Suivez la même procédure pour chaque puits jusqu'à ce que tous les puits sont remplis. Puis placer la plaque dans l’étuve pendant 1 h pour la gélification complet de l’ECM.</li>
	<li>Après la gélification pleine d’ECM est parvenue, distribuer 400 µL de préchauffé 1 % LMA surface du gel de l’ECM. Couvrir la plaque avec son couvercle, incuber la plaque à RT pour 5 à 7 min, puis pendant 2 min à 4 ° C, pour la gélification de l’agarose. Enfin, doucement ajouter 2 mL de milieu complet en vous penchant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique. Remarque : La couche de gel d’agarose empêche le détachement de la matrice de collagène-gel de la HMCA.</li>
</ol>7. analyse et Acquisition de dosage invasion
<ol><li>Charge la plaque de HMCA sur un moteur inversé des microscopes équipés d’un incubateur, réglé à 37 ° C, 5 % de CO2 et atmosphère humidifiée.</li>
	<li>Déterminez avant les positions pour l’acquisition d’images dans chaque bien afin de couvrir la zone de l’intégralité du tableau et utilisent 10 X ou 4 X objectifs (cette étape est requise pour le logiciel d’acquisition image utilisé ici, consultez la Table des matières ci-dessous pour plus de détails). Également utiliser n’importe quel logiciel d’acquisition image pour faciliter le balayage automatique de toute la zone requise, en choisissant la « Stich » option.</li>
	<li>Acquérir des images de champ lumineux (BF) toutes les 2 à 4 h pour une durée totale de 24 à 72 h pour suivre l’invasion des cellules de l’organisme de sphéroïde dans l’ECM environnante.</li>
	<li>Acquisition d’images fluorescentes pour la détection de PI en utilisant un cube fluorescent dédié (excitation filtre 530 – 550 nm, miroir dichroïque 565 nm long col et émission filtre 600-660 nm).</li>
	<li>Exporter des images BF/fluorescent Time-lapse de logiciel d’acquisition de l’image et enregistrer au format de fichier étiqueté d’image (TIFF) dans un dossier dédié à l’aide de l’onglet « Base » dans la barre d’outils, puis sur le bouton « Exporter les fichiers d’enregistrement » . NOTE : Nous avons développé un code spécial analyse interne dans le logiciel MATLAB qui inclut une interface utilisateur graphique conçue (GUI) dans lequel invasion analyse pourrait être exécuté plus rapidement et plus facilement. Dans cette analyse de code, la segmentation des sphéroïdes et zone d’invasion se faite semi-automatique à l’aide de filtre de Sobel suivie par les opérateurs morphologiques, l’érosion et dilatation. Après la segmentation automatique des zones, corrections manuelles ont été faites au besoin pour une meilleure précision. Après l’achèvement de la segmentation, un ensemble de paramètres ont été automatiquement calculé par le logiciel et exporté vers un fichier excel pour autre manipulation. La liste des paramètres sont : aire de la section base de sphéroïde au moment = 0, zone d’invasion des cellules reliée au corps du sphéroïde = invasion principale, quartier des cellules séparées de la zone principale d’invasion, nombre de cellules séparée de la zone principale d’invasion, la distance moyenne de invasion de la base sphéroïde Centre de masse à la circonférence de la zone principale d’invasion, les cellules séparées et les paramètre de distance collective invasion = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) de la Des coordonnées X et Y sphéroïde Centre de masse, avant (X1, Y1) et après (X2, Y2) processus d’invasion collective). Alternativement, analyse d’image pourrait être fait avec n’importe quel autre logiciel spécialisé.</li>
	<li>Ouvrez l’interface utilisateur et appuyez sur le bouton « Load BF » . Une fois l’image ouverte, ajustez les paramètres de segmentation (taille minimale : > 1 et rayon à proximité : > 1) pour réaliser une segmentation précise de sphéroïde et sa zone d’invasion, puis, appuyez sur « Région de segmentation d’intérêt (ROI) » pour l’exécution et une bordure apparaît autour de chaque sphéroïde. Si la segmentation automatique est incorrecte, appuyez sur le bouton « Supprimer » ou « Ajouter » et apporter les correctifs requis manuellement. Répétez les mêmes étapes pour les images suivantes.</li>
	<li>Appuyez sur le bouton « Tracking » de numéroter les sphéroïdes et le logiciel va attribuer le même numéro pour chaque ellipsoïde dans chacune des images de laps de temps. Puis, appuyez sur le bouton « Mesure » qui va générer une feuille de calcul avec tous les paramètres. Sauvegarder cette feuille de calcul dans un fichier excel pour une utilisation dans le traitement des résultats et statistiques dans excel logiciel.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Il est bien documenté que les organismes vivants, caractérisés par leur organisme multicellulaire 3D complexe sont tout à fait distinctes des cellules utilisées monocouche 2D cultivée, en insistant sur la nécessité cruciale d’utiliser des modèles cellulaires qui mieux imitent les fonctions et les processus de l’organisme vivant pour médicament dépistage. Récemment, les sphéroïdes multicellulaires, culture organotypique, organoïdes et organes-on-a-chip ont été introduites8 pour l’utilisation dans l...

Décès par cancer est attribuée principalement à la diffusion des cellules métastatiques à des endroits éloignés. Beaucoup d’efforts dans le traitement du cancer se consacrée sur le ciblage ou de prévenir la formation de colonies métastatiques et la progression de la maladie métastatique systémique1. Migration des cellules du cancer est une étape cruciale dans le processus de métastase tumorale, ainsi, la recherche de la cascade d’invasion du cancer est très important et une condition préalable à la recherche de thérapies anti-métastatique.
L’utilisation de modèles animaux comme outils pour l’étude de la maladie métastatique s’est avérée pour être très coûteux et pas toujours représentatifs de la tumeur chez les humains. En outre, la topologie du microenvironnement extracellulaire, la mécanique et la composition fortement affectent cancer cell comportement2. Car en vivo modèles intrinsèquement n’ont pas la capacité de séparer et de contrôler ces paramètres spécifiques qui contribuent à l’invasion du cancer et des métastases, on a besoin pour biomimétique contrôlables en vitro modèles.
Pour métastaser dans des organes éloignés, cellules cancéreuses doivent présenter des caractéristiques phénotypiques migrateurs et envahissantes qui peuvent être ciblés pour la thérapie. Toutefois, étant donné que la plupart des modèles in vitro du cancer ne pas imiter les caractéristiques réelles des tumeurs solides3, c’est très difficile de détecter des phénotypes physiologiquement pertinents. En outre, l’hétérogénéité phénotypique qui existe au sein de la tumeur, dicte la nécessité pour l’analyse des migrations de la tumeur à élément simple résolution afin de découvrir les thérapies axées sur le phénotype, par exemple, en ciblant les cellules déclenchant les métastases population au sein de tumeurs hétérogènes4.
L’étude de la motilité cellulaire et migration collective est menée principalement dans des cultures monocouches de cellules épithéliales sur des surfaces planes homogènes. Ces modèles cellulaires classiques pour la migration des cellules du cancer sont basées sur l’analyse de populations de cellules individuelles envahir à travers les membranes et les ECM composants5, mais dans ces systèmes, les différences intrinsèques entre les cellules individuelles ne peuvent pas être a étudié. Générer des sphéroïdes 3D par échafaudages ou en microstructures exempte d’échafaudage est considéré comme un supérieur moyen étudier la tumeur de cellules croissance et cancer invasion6,7,8. Cependant, la plupart des systèmes 3D ne sont pas adaptés aux formats à haut débit, et interaction entre sphéroïde habituellement ne peut être atteints depuis sphéroïdes individuels isolés sont générés à chaque micro puits9. Des études récentes portant sur la migration du cancer reposent sur des dispositifs microfluidiques3,10,11,12, cependant, ces complexes microfluidique outils sont difficiles à produire et ne peut pas servir à haut débit (HTS) de dépistage des drogues anti-invasives.
Deux principaux phénotypes, migration des cellules individuelles et collectives, qui jouent un rôle dans les cellules tumorales, surmonter l’obstacle de l’ECM et envahissent les tissus voisins, ont été démontrées13,14, chaque affichage distinct morphologiques caractéristiques, les mécanismes biochimiques, moléculaires et génétiques. En outre, les deux formes de migration des cellules tumorales, fibroblastes-like et amiboïdes, sont observées dans chaque phénotype. Depuis les deux phénotypes de l’invasion et les modes de migration, sont principalement définies par les propriétés morphologiques, il y a un besoin pour cellulaires modèles qu’activer la détection basée sur l’imagerie et l’examen de toutes les formes de l’invasion tumorale et la migration des cellules.
L’objectif global de la méthode actuelle doit fournir un système de biomimétique simple et reproductible 3D in vitro sur les cellules pour l’analyse de la capacité d’invasion dans les grandes populations des sphéroïdes de tumeur. Ici, nous introduisons la plaque d’imagerie basée sur HMCA 6 puits de recherche sur l’invasion tumorale et de la thérapie anti-métastatique. Cette technologie permet la formation d’un grand nombre des sphéroïdes de tumeur 3D uniforme (450 / puits) dans une structure de micro-chambres (MC) d’hydrogel. Divers composants de l’ECM sont ajoutés au tableau sphéroïde pour permettre l’invasion des cellules dans le milieu environnant. Processus d’invasion est surveillée de façon continue par l’observation des cellules individuelles sphéroïdes/envahir même court et long terme et facilite la caractérisation morphologique, coloration fluorescente et récupération des sphéroïdes spécifiques à tout moment. Puisque les sphéroïdes nombreux partagent l’espace et médium, interaction par l’intermédiaire de molécules solubles sphéroïdes individuels et leur impact sur l’autre est possible. Analyse d’images semi-automatique est effectué au moyen de code interne de MATLAB qui permet une collecte plus rapide et plus efficace de grandes quantités de données. La plateforme facilite la mesure précise et simultanée de nombreuses cellules sphéroïdes/envahir temps-efficacement, permettant le criblage de débit moyen des médicaments anti-invasion.

<table><tbody><tr><td>6 plaques inférieures en verre à micro-puits avec verre de couverture micro-puits #1.5 de 14 mm</td><td>Cellvis</td><td>P06-14-1.5-N</td><td>Plaques inférieures en verre commerciales utilisées pour le gaufrage HMCA</td></tr><tr><td>UltraPure Low Point Melting Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td>Une solution de 6 % d’agarose est chauffée à 80 &deg ; C avant utilisation, une solution d’agarose à 1 % est réchauffée à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Trypsine EDTA solution B</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1A</td><td>Chauffé à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>DMEM moyenne, élevée en glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td>Chauffé à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum spécial pour veau nouveau-né (NBCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-122-1A</td><td>DPBS inactivé</td></tr> par la chaleur <tr><td>(10x), sans calcium, sans magnésium</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td>Conservé sur glace avant utilisation</td></tr><tr><td>NaOH, anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Utilisé pour la préparation de 1 M de solution de NaOH</td></tr><tr><td>Cultrex Collagène de type I de queue de rat, 5 mg/mL</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Conservé sur glace avant utilisation</td></tr><tr><td>Acide hyaluronique sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5542-10MG</td><td>Conservé sur glace avant utilisation</td></tr><tr><td>Fisetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F505-100MG</td><td>Ajouté au milieu de culture, inhibiteur d’invasion</td></tr><tr><td>DETA/NO</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>alx-430-014-m005</td><td>Ajouté au milieu de culture, donneur d’oxyde nitrique</td></tr><tr><td>PI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Utilisé à très faible concentration sans avoir besoin de lavage</td></tr><tr><td>Dymax 5000-EC Système complet de lampe UV avec écran de lumière & Alimentation EC Dymax 400 Watt</td><td>Dymax Corporation</td><td>PN 39823</td><td>Utilisé pour la stérilisation des plaques HMCA par</td></tr><tr><td>microscope UV Inversé IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td>Utilisé pour l’acquisition automatique d’images</td></tr><tr><td>Incubateur pour microscope</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td>Essentiel pour les expériences en accéléré avec acquisition d’images, pré-ajusté à 37 &deg ; C, 5 % CO2 et maintien d’une atmosphère humidifiée</td></tr><tr><td>Platine motorisée submicronique SCAN-IM</td><td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td><td></td><td>Utilisé pour prédéterminer les zones d’acquisition d’images, pour l’acquisition automatique d’images</td></tr><tr><td>14 bits, caméra refroidie ORCA II C4742-98</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>Très sensible, utilisé pour l’imagerie</td><td></td></tr><tr><td>Cube de filtre fluorescent pour la détection PI</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Spécifications du cube de filtre : filtre d’excitation 530-550 nm, miroir dichroïque 565 nm passe-long et filtre d’émission 600-660 nm</td></tr><tr><td>Le logiciel d’exploitation Olympus Cell^P</td><td>Logiciel Olympus</td><td></td><td>utilisé pour contrôler l’acquisition de microscopes, de platines motorisées, de caméras et d’images</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse Matlab R2014B</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Utilisé pour développer en interne une interface utilisateur graphique interne pour le logiciel</td></tr> <tr><td></td><td>Excel d’analyse d’imagesMicrosoft</td><td></td><td>Utilisé pour la gestion des données, le calcul, la création de tracés et les statistiques</td></tr></tbody></table>

analyse d’invasion des cellules du cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant hydrogel micro-chambre array (hmca)-plaques de base

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Métastases du cancer est connu pour causer des 90 % de létalité du cancer. Métastase est un processus à plusieurs étapes qui initie avec la pénétration/invasion des cellules tumorales dans les tissus voisins. Ainsi, l’invasion est une étape cruciale à la métastase, rendant l’invasion processus recherche et le développement de médicaments anti-métastatiques, hautement significative. Pour répondre à cette demande, il est nécessaire de développer des modèles 3D dans vitro qui imitent l’architecture des tumeurs solides et leur microenvironnement plus étroitement à l’état in vivo d’une part, mais en même temps être reproductible, robuste et adapté aux haut rendement et hautes teneur Mensurations. Actuellement, la plupart analyses d’invasion se pencher sur technologies microfluidiques sophistiqués qui sont adéquates pour la recherche, mais pas pour le dépistage des drogues un volume élevé. Autres dosages utilisant des dispositifs à base de plaque avec des sphéroïdes individuels isolés dans chaque puits sont matériel consommant et ont la taille de l’échantillon faible par l’État. L’objectif du protocole actuel est de fournir un système de base de cellules 3D biomimétique simple et reproductible pour l’analyse de la capacité d’invasion dans les grandes populations des sphéroïdes de tumeur. Nous avons développé un modèle 3D pour invasion analyse basée sur la plaque d’imagerie HMCA de recherche sur l’invasion tumorale et la découverte de médicaments anti-métastatique. Ce dispositif permet la production de nombreux sphéroïdes uniformes par puits (taille de l’échantillon élevé par État) entouré de composantes d’ECM, tout en permanence et simultanément observer et mesurer les sphéroïdes à élément simple résolution pour les moyennes criblage de médicaments anti-métastatiques. Cette plateforme est présentée ici par la production des sphéroïdes HeLa et MCF7 pour illustrant la cellule individuelle et collective invasion. Nous comparons l’influence de l’ECM composant l’acide hyaluronique (HA) sur les capacités invasives de collagène qui entourent les sphéroïdes HeLa. Enfin, nous ne présentons fisétine (inhibiteur de l’invasion) HeLa sphéroïdes et l’oxyde nitrique () (activateur d’invasion) à MCF7 sphéroïdes. Les résultats sont analysés par un logiciel interne qui permet l’analyse semi-automatique, simple et rapide qui facilite l’examen des paramètre multiples.

L’unique HMCA plaque d’imagerie est utilisée pour le dosage de l’invasion des sphéroïdes tumeur 3D. L’analyse entière, commençant par la formation sphéroïde et finissant avec le processus d’invasion et les manipulations supplémentaires, est réalisée au sein de la même plaque. Pour la formation sphéroïde, cellules HeLa sont chargés dans le bassin de la baie et s’installer dans l’hydrogel MCs par gravité. L’hydrogel MCs, qui présentent des caractéristiques non adhérent/faible attachement, f...

Une plaque d’imagerie basée sur HMCA est présentée pour la performance de série invasion. Cette plaque facilite la formation des sphéroïdes en trois dimensions (3D) tumeur et la mesure de l’invasion des cellules du cancer dans la matrice extracellulaire (ECM). La quantification de dosage d’invasion est obtenue par analyse semi-automatique.

Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Le but de ce système 3D biomimétique simple reproductible basé sur la cellule est de faciliter l’analyse de capacité d’invasion dans une grande population de sphéroïdes de tumeur pour le criblage anti-métastatique de drogue. Le principal avantage de notre tableau de micro-chambre hydrogel est qu’il permet la production d’un grand nombre de sphéroïdes uniformes qui peuplent le même plan focal par puits. La position sphéroïde est conservée en raison de la structure du réseau hydrogel micro-chambre, même après l’ajout de matrice extracellulaire, facilitant la surveillance continue précise des sphéroïdes et le processus d’invasion.En outre, la caractérisation morphologique et la coloration fluorescente de nombreux sphéroïdes et cellules envahissantes peuvent être effectuées in situ et analysées à une résolution à un seul élément d’une manière efficace dans le temps. Maria Sobolev, de notre laboratoire, présentera la procédure de production de plaques d’imagerie à six puits hydrogel. Pour préparer les plaques de tableau de micro-chambre hydrogel, préchauffer d’abord six polydimethylsiloxane, ou PDMS, timbres à 70 degrés Celsius, et placer un six puits, plaque de fond de verre sur un bain sec préchauffé à 75 degrés Celsius pendant plusieurs minutes.Lorsque la plaque est chaude, versez une goutte de 400 microlitres d’agarose préchauffée à faible fond fondant sur le fond de chaque puits de la plaque de six puits, et placez doucement un timbre sur chaque goutte. Laisser refroidir la configuration de cinq à dix minutes à température ambiante, suivie de 20 minutes à quatre degrés Celsius pour une gelation complète de l’agarose. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, décoller délicatement le PDMS de chaque puits, laissant les gels agarose modelés avec des micro-chambres.Après avoir permis à la lampe UV d’atteindre sa plus grande intensité, placez la plaque en relief dans le système de séchage léger pendant trois minutes et remplissez les macro-puits stérilisés aux UV de PBS stériles. Ensuite, couvrez la plaque et enveloppez-la de parafilm pour un stockage de quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour charger les cellules, retirez le PBS de chaque puits et chargez doucement 50 microlitres des cellules d’intérêt au-dessus de chaque tableau d’hydrogel.Après avoir permis aux cellules de se déposer par gravité pendant 15 minutes, ajouter soigneusement six à huit aliquots de 500 microlitres de milieu frais au bord du fond en plastique macro-puits à l’extérieur de l’anneau et du tableau hydrogel. Incuber les cellules pendant la période appropriée à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec l’humidité pour la formation de sphéroïdes. Ensuite, transférez les sphéroïdes dans une hotte de biosécurité sur la glace pendant 10 minutes.Lorsque la plaque est refroidie, penchez une pointe de pipette sur le bord du fond en plastique macro-bien à côté du tableau hydrogel, et retirez tout le milieu autour du tableau. Ensuite, retirez le milieu du réservoir de tableau, penchez une pointe de pipette de gel-chargement sur le bord du réservoir de tableau très soigneusement, prenant soin de ne pas déranger les micro-chambres et les sphéroïdes. Ensuite, utilisez une pointe de pipette fine prégelée pour ajouter deux aliquots de 150 microlitres du mélange de collagène d’intérêt au bord du tableau un à la fois, libérant le mélange lentement pour éviter la dislocation sphéroïde.Après la deuxième série de collagène a été ajouté à chaque puits, retourner les sphéroïdes à l’incubateur pendant une heure pour la gelation complète de la matrice extracellulaire. Lorsque la matrice s’est solidifiée, ajouter 400 microlitres d’agarose préchauffée de 1 % à faible fondant sur le gel et incuber la plaque, recouverte à température ambiante, pendant cinq à sept minutes, avant de la refroidir pendant deux minutes à quatre degrés Celsius pour une gelation agarose. Puis, en appuyant sur la pipette sur le bord du fond en plastique macro-bien, ajouter délicatement deux millilitres de milieu complet à chaque puits.Pour effectuer un test d’invasion, chargez la plaque de tableau de microchôle hydrogel sur un stade de microscope inversé motorisé équipé d’un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et de 5 % avec une atmosphère humidifiée, et utilisez un objectif de quatre ou 10 x pour prédéterminer les positions de l’acquisition d’images dans chaque puits afin que l’ensemble de la zone du réseau soit évalué. Ensuite, acquérir des images en champ lumineux toutes les deux à quatre heures pour un total de 24 à 72 heures pour suivre l’invasion cellulaire du corps sphéroïde dans la matrice extracellulaire environnante. À la fin de l’acquisition de l’image, exportez les images en time-lapse du logiciel d’acquisition d’images pour économiser dans un format de fichier d’image marqué vers un dossier dédié.Ensuite, ouvrez l’interface utilisateur graphique et cliquez sur Load Bright Field. Ajustez les paramètres de segmentation de l’image pour obtenir une segmentation précise des sphéroïdes et de leurs zones d’invasion, et cliquez sur Segmentation région d’intérêt pour créer une bordure autour de chaque sphéroïde. Si la segmentation automatique est incorrecte, appuyez sur Supprimer ou Ajouter, et apporter les corrections appropriées manuellement.Cliquez sur Suivi pour numéroter les sphéroïdes dans chacune des images time-lapse. Ensuite, cliquez sur Mesure pour générer une feuille de calcul avec tous les paramètres, et enregistrer la feuille de calcul dans un format approprié pour le traitement des données et l’analyse statistique. Pour examiner l’influence de l’acide hyaluronique sur le processus spontané d’invasion sphéroïde HeLa, dans cette expérience, les sphéroïdes mûris de deux jours ont été couverts de collagène et de solution de mélange d’acide hyaluronique et comparés à des sphéroïdes mûris de deux jours couverts de solution de collagène seul.Après 50 heures d’incubation, les sphéroïdes incorporés dans le collagène et l’acide hyaluronique ont démontré une dispersion cellulaire inférieure dans la matrice extracellulaire environnante par rapport aux sphéroïdes incorporés dans le collagène seul. En effet, l’analyse de la cinétique de la zone d’invasion au fil du temps pour 99 sphéroïdes à résolution monosphéroïde indique clairement que l’ajout d’acide hyaluronique au collagène empêche la dispersion cellulaire hors du sphéroïde, ce qui entraîne de plus petites zones d’invasion. Le traitement de la culture sphéroïde HeLa avec un flavonoïde bioactif avec des propriétés cyto-et migrastatiques pendant 24 heures entraîne une dispersion cellulaire inhibée autour des sphéroïdes par rapport aux sphéroïdes HeLa non traités.En effet, l’analyse des zones d’invasion de 488 sphéroïdes à la fin de l’expérience a révélé une inhibition significative après traitement avec aussi peu que 10 micromolaires du médicament. En raison de la faible caractéristique d’attachement de l’hydrogel, cette technologie à base de micro-chambre facilite la formation de sphéroïdes, même dans les cas de très peu de cellules. Ceci est particulièrement avantageif dans les échantillons limités limités de cellules primaires de type tige de cancer ou d’origine patiente.La plaque d’imagerie hydrogel micro-chambre permet l’analyse de l’emplacement spatial exact des sphéroïdes au cours d’expériences à long terme pour l’évaluation du processus d’invasion au niveau d’un seul élément et fournit un degré élevé de robustesse statistique et de précision. Les applications futures de cette méthodologie incluent côte à côte la culture multicellulculaire des cellules tumorales et stromal dans différentes régions du macro-puits et la récupération de sphéroïdes individuels pour l’analyse moléculaire en aval.

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À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire, la biologie du cancer nécessite de nouveaux outils in vitro et informatiques pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié. Nous décrivons des protocoles pour exploiter les co-cultures microfluidiques immunitaires contre les tumeurs dans des contextes 2D et 3D, compatibles avec la surveillance dynamique et multiparamétrique des fonctions cellulaires.

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Il s’agit d’une méthode efficace pour dépister les suppresseurs ou les facteurs de métastases cancéreuses. Les cellules, transduites avec une bibliothèque d’expressions, sont injectées dans le système vasculaire de la membrane chorioallantoïque du poulet pour former des colonies métastatiques. Les colonies ayant un caractère invasif diminué ou accru sont excisées, élargies, réinjectées pour confirmer leur phénotype et, enfin, analysées à l’aide d’un séquençage à haut débit.

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L’invasion est un phénomène biologique majeur dans le développement et la progression du cancer. Ce processus est influencé par les cellules non néoplasiques et les composants du microenvironnement tumoral. Le but de cette étude est de décrire une méthode alternative pour analyser l’invasion des cellules tumorales in vitro à l’aide de cultures tridimensionnelles (3D).

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Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base

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