Name: Intubation orale du poisson-zèbre adulte : un modèle pour l’évaluation de l’absorption intestinale des composés bioactifs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: Apprenez l'intubation orale chez Danio rerio adultes pour évaluer l'absorption intestinale des composés bioactifs. Cette méthode simple et rapide permet d'étudier la vaccinologie muqueuse avec un faible taux de mortalité.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère espagnol de la Science, la commission européenne et des fonds AGAUR NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER et AGAUR 2014SGR-345). RT est titulaire d’une bourse d’études pré-doctorales de AGAUR (Espagne), JJ a été soutenue par une bourse de doctorat de la China Scholarship Council (Chine) et NR est pris en charge par le programme Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Nous remercions m. Torrealba conseils spécialisés dans la production de protéines, N. Barba de la « Servei de Microscopia » et Dr M. Costa de la « Servei de Citometria » de l’Universitat Autònoma de Barcelona pour assistance technique utile.

Toutes les procédures expérimentales impliquant le poisson zèbre (Danio rerio) ont été autorisés par le Comité d’éthique de l’Universitat Autònoma de Barcelona (nombre CEEH 1582) en accord avec les principes directeurs de l’International pour la recherche avec des animaux) EU 2010/63). Toutes les expériences avec webcam live poisson zèbre ont été effectuées à 26 et 28 ° C.
1. préparer le matériel pour l’Intubation orale
<ol><li>Placer environ 1 cm d’un tube de silicone fine sur l’aiguille Luer lock 31 G pour couvrir la pointe de l’aiguille.</li>
	<li>Couper une pipette de filtre stérile 10 µL bout (environ 2 cm), prenez l’extrémité plus fine et placez-le sur le tube de silicone comme une gaine. S’assurer que la pipette s’étend au-delà de l’extrémité de l’aiguille pour ne pas blesser l’animal.</li>
	<li>Fixer l’aiguille à une 100 µL Luer lock seringue. NOTE : Toujours rincer avec de l’éthanol et puis solution saline tamponnée au phosphate (PBS, voir Materials) soigneusement entre les traitements.</li>
</ol>2. les solutions requises
<ol><li>Préparer 150 mg/L (anesthésie) ou 300 mg/L (d’euthanasie) de solution de méthanesulfonate (MS-222) 3-aminobenzoate éthylique avec de l’eau de l’aquarium où le poisson-zèbre sont entretenus. Remplir un petit réservoir avec 1 L de solution anesthésique et gardez-le aéré.</li>
	<li>Remplir un autre petit réservoir avec 1 L d’eau de l’aquarium sans MS-222 pour la récupération du poisson et gardez-le aéré.</li>
	<li>Faire 50 mL de solution de 1 PBS x d’un 10 x solution mère stérile.</li>
	<li>Pour l’isolation de la cellule intestinale/analyse cytométrie en flux, préparer assez fraîche collagénase de 0,15 % solution de Type IV 1 mL par poisson d’une solution-mère ou de la poudre au moyen d’eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec la pénicilline 1 % v/v et à la streptomycine (voir documentation). Faites parties aliquotes (1 par poisson) de 1 mL à tubes de centrifugeuse de 2 mL. Conserver à 4 ° C jusqu'à 30 min avant l’étape de la dissection.</li>
	<li>Pour la fixation de la microscopie confocale/échantillon, préparer 50 mL de la solution fraîche de paraformaldéhyde (PFA) 4 % dans du PBS ou décongeler une solution-mère du congélateur-20 ° C sous une hotte. ATTENTION : PFA est toxique. Veuillez lire la fiche signalétique avant de travailler avec elle. Gants et lunettes de protection devraient être portés et laissent toujours des solutions à l’intérieur d’une hotte aspirante.</li>
</ol>3. préparation de la Suspension de nanoparticules fluorescentes
<ol><li>Étiqueter les nanoparticules de protéine avec ester Atto-488 NHS (voir Table des matières) ou un colorant fluorescent approprié selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Remettre en suspension les nanoparticules dans un tampon bicarbonate de sodium 0,1 M à la concentration de 2 mg/mL.</li>
	<li>Dissoudre l’ester Atto 488 NHS en amines libres diméthylsulfoxyde (DMSO) à 2 mg/mL. Garder une partie aliquote de 10 µL à contrôler l’efficacité de l’étiquetage (étape 3,7 à 3,8).</li>
	<li>Mélanger les nanoparticules et l’ester d’Atto 488 NHS à un rapport molaire de 1:2 (protéine : colorant) en le remuant dans l’obscurité.</li>
	<li>Tournez en bas des nanoparticules étiquetées par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à température ambiante, éliminer le surnageant et gardez-le pour contrôler l’efficacité de l’étiquetage (étape 3,7 à 3,8).</li>
	<li>Lavez les nanoparticules étiquetées en resuspendant dans 1 mL de tampon bicarbonate de sodium 0,1 M de vortex et de pipetage de haut en bas. Puis jeter le surnageant par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Répétez l’étape 3.6 pour 5 fois.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon bicarbonate de sodium 0,1 M dans un tube à centrifuger 15 mL et faire des parties aliquotes de la NANOPARTICULE fluorescente dans des tubes à centrifuger 1,5 mL (30 parties aliquotes). Filer vers le bas à 8 000 x g pendant 10 min à température ambiante, jeter le surnageant et stocker à-80 ° C, abri de la lumière.</li>
	<li>
Mesurer l’efficacité d’étiquetage à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume.
	<ol>
<li>Prendre 1 µL de la solution d’Atto 488 originale conservée à l’étape 3.3 et plus loin le diluer dans le DMSO (par exemple, 01:20 d’après le rapport de volume). Il s’agit du volume utilisé pour obtenir le rapport molaire des protéines NANOPARTICULE et Atto 488 mix à l’étape 3.4.</li>
		<li>Prendre 1 µL de surnageant sauvé par la réaction d’étiquetage à l’étape 3.5. Mesurer l’absorption (abs) a = 501 nm. Le pourcentage de l’étiquetage est : (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58366/58366eq1.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avant l’expérience, préparer la suspension de la NANOPARTICULE à la concentration désirée à l’aide de la solution de PBS 1 x.</li>
</ol>4. poisson-zèbre Anesthetization et Intubation orale
<ol><li>Rapidement le poisson (&gt; 0,5 g) au moins 48 h avant l’expérience de vider l’intestin.</li>
	<li>Déplacez les poissons (12) dans les bassins expérimentaux (6 L) une nuit avant l’expérience pour permettre l’acclimatation12.</li>
	<li>Vortex la solution de nanoparticules bien (par exemple, 2 500 tr/min et 30 s) et établit le volume souhaité de nanoparticules suspension (p. ex., 20 – 50 µL) dans la seringue, attachée à l’aiguille protégée.</li>
	<li>Placer le poisson dans le gazeuse 150 mg/L MS-222 solution (voir chapitre 2) jusqu'à ce qu’ils se déposent au fond de la cuve et ne répondent pas à une pincée de la nageoire caudale ; Ce processus prend moins de 5 min.</li>
	<li>Rapidement transférer les poissons anesthésiés avec un filet sur un plateau en plastique mouillé, orienter l’animal horizontalement pour faire face à l’aiguille et commencer immédiatement l’intubation orale.</li>
	<li>Avec précaution, soutenir le poisson d’une main et ouvrir la bouche de l’autre main à l’aide de l’aiguille protégée. Insérer délicatement l’aiguille vers le bas de le œsophage à environ 1 cm de la bouche d’ouverture. Remarque : L’opérateur peut se sentir une légère résistance lorsque l’extrémité de l’embout de la pipette a passé les branchies. Prendre soin de ne pas l’entrée de l’aiguille trop qui peut perforer les branchies d’angle.</li>
	<li>Injecter lentement la suspension de nanoparticules pour le poisson. Veillez à ce que la suspension ne s’écoule pas vers l’extérieur par les branchies ou la bouche.</li>
	<li>Doucement, retirer l’aiguille et placer le poisson dans le réservoir de récupération (voir chapitre 2). Récupération prend généralement moins de 1 min.</li>
	<li>Vérifier le poisson soigneusement pour toute anomalie (par exemple, des saignements au niveau des branchies est un signe de perforation).</li>
	<li>Une fois que les poissons ont récupéré, Reverse dans les bassins expérimentaux.</li>
</ol>5. Dissection de l’intestin du poisson-zèbre
<ol><li>Après un certain temps après intubation (p. ex., 5 h ou 24h), placez le poisson à l’aide d’un filet en 300 mg/L MS-222 solution d’euthanasie (voir chapitre 2). Assurez-vous que l’opercule s’immobilise et il n’y a aucun réflexe de pincée de queue. Cinq minutes est normalement suffisant.</li>
	<li>Ramasser l’animaux euthanasié avec un filet et le placer sur un papier filtre. Remarque : Le papier filtre est très utile pour enlever le tissu adhésif le long de l’intestin.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux de dissection pointu, faites une incision semi-circulaire de l’anus à l’opercule et l’incision ouverte à l’aide de pinces fines. Couper les deux extrémités de l’intestin, retirez tous les organes internes et placez-les sur du papier filtre. ATTENTION : Les travaux rapidement à réduire la mortalité et le métabolisme cellulaire. NOTE : Ou bien, supprimez le tissu adhésif dans du PBS et sur glace.</li>
	<li>Séparer les organes internes, en veillant à conserver son orientation (antérieur à segment intestinal postérieur) et de l’étirer l’intestin. Habituellement, le segment antérieur de l’intestin est plus large que le segment postérieur. Veiller à obtenir tout l’intestin lorsque la dissection. Remarque : L’extrémité postérieure est assez fine et fragile dans petits poissons et peuvent se rompre, en particulier chez les animaux &lt; 0,7 g.</li>
	<li>Rouler l’intestin sur le papier filtre avec des pincettes pour détacher les tissus adhésifs de l’intestin.</li>
	<li>Passez à préparer l’intestin pour diverses analyses en aval (Articles 6, 7 et 8).</li>
</ol>6. préparation des cellules intestinales de cytométrie en flux
<ol><li>Préparer à l’avance des parties aliquotes de solution de collagènase de 0,15 % (voir la section 2.4). Remarque : Les parties aliquotes doivent être à température ambiante avant de procéder.</li>
	<li>Facultatif : Continuant de l’étape 5.5, fente ouverte l’intestin longitudinalement et laver avec du PBS 1 x.</li>
	<li>À l’aide de pinces à épiler, placer l’intestin dans le tube à centrifuger 2 mL rempli de solution de collagènase de 0,15 %.</li>
	<li>Placer les tubes sur un agitateur de laboratoire vertical pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Placez l’intestin sur un tamis de cellule 100µm appuyé sur un tube de centrifugation de 50 mL. Briser l’intestin avec un piston de seringue de 5 mL, laver 3 fois avec du PBS 1 x, recueillant le débit à travers l’échantillon dans le tube à centrifuger 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger le tube de centrifuger de 50 mL à 400 x g pendant 10 min, à 4 ° C.</li>
	<li>Pipetter soigneusement la plupart du surnageant tout en ne perdant ne pas les cellules, dont certaines peuvent être associés à la glaire.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules intestinales en bas du tube centrifuge avec 500 µL de PBS 1 x et rester sur la glace jusqu'à l’analyse de la cytométrie en flux</li>
	<li>Échantillons de filtre par un filtre de cellule 30 µm dans 5 mL autour des tubes du bas pour la cytométrie en flux.</li>
	<li>Réglez les paramètres (par exemple, le nombre de cellules pour l’analyse, la région d’intérêt, de tension et de compensation, choix des détecteurs) sur un équipement cytomètre (voir documentation).</li>
	<li>Immédiatement analyser les cellules sur un cytomètre, suivant les instructions d’utilisation13.</li>
</ol>7. préparer l’intestins Cryosections pour la microscopie confocale
<ol><li>Remplissez le moule en plastique (voir la Table des matières) à la moitié du volume avec la température de coupe optimale (PTOM) composé.</li>
	<li>Continue de l’étape 5.5 et immédiatement après la dissection, poser délicatement l’intestin dans le moule en plastique. Assurez-vous que l’intestin est totalement intégré dans l’enceinte des PTOM. Si nécessaire, ajouter composé plus PTOM dans le moule en plastique. Remarque : Il est recommandé de placer l’intestin en forme de « Z » dans les PTOM composé de suivre facilement son orientation naturelle.</li>
	<li>Placer le moule en plastique sur la glace sèche jusqu'à ce qu’il va opaque (moins d’une minute).</li>
	<li>Stocker le moule en plastique à-80 ° C pour une utilisation à long terme ou procédé immédiatement à l’aide de la procédure suivante. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.</li>
	<li>Couper l’intestin congelé en 10 sections de µm ou épaisseur appropriée à l’aide d’un cryostat à-20 ° C.</li>
	<li>Recueillir la section intestinale avec une brosse fine sur une lame.</li>
	<li>Plonger la lame dans 4 % PFA pendant 15 min à température ambiante pour fixer l’échantillon. ATTENTION : PFA est toxique. Veuillez lire la fiche signalétique avant de travailler avec elle. Gants et lunettes de protection devraient être portés et laissent toujours des solutions à l’intérieur d’une hotte aspirante.</li>
	<li>Laver la lame 3 fois avec 1 x PBS, 10 min chacun.</li>
	<li>Ajouter une goutte de milieu de montage et placez une lamelle sur le spécimen. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.</li>
	<li>Observer l’échantillon sous un microscope confocal à grossissement approprié.</li>
</ol>8. préparation de l’intestin pour temps réel qPCR (RT-qPCR)
<ol><li>Continue de l’étape 5.5, mettre l’intestin dans un flacon cryogénique et congeler rapidement l’intestin dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.</li>
	<li>Pour l’homogénéisation, ajouter 200 µL de 2 % (v/v) réfrigérée 1-thioglycérol/homogénéisation solution (voir la Table des matières) ou solution alternative homogénéisation de l’échantillon de l’intestin.</li>
	<li>Travailler rapidement, homogénéiser l’échantillon intestin sur la glace avec un homogénéisateur de laboratoire à grande vitesse (fixé à 25 – 30 000 tr/min) jusqu'à ce qu’aucun tissu visible des fragments demeurent. 3 fois pendant 5 s est généralement suffisant.</li>
	<li>Isoler l’ARN à l’aide d’un film publicitaire nécessaire (voir la Table des matières) selon d’instructions du fabricant14 ou une autre méthode appropriée. Au besoin, conservez l’ARN à-80 ° C pour une utilisation à long terme. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.</li>
	<li>Quantifier la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre15 et évaluer la qualité à l’aide d’un analyseur de RNA16.</li>
	<li>Préparer 1 µg ou une quantité appropriée de cDNA utilisant un kit de synthèse de cDNA selon les instructions du fabricant. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Pour l’analyse de qPCR, veuillez suivre les directives MIQE17.</li>
	<li>Création de paires d’amorces appropriées pour le gène ou d’intérêt.</li>
	<li>Sélectionnez un gène de référence appropriés et d’analyser l’expression de chaque gène par une détection de la RT-qPCR kit de système à l’aide d’un film publicitaire (voir documentation). NOTE : par exemple, ajouter 5 µL de supermix SYBR green, des amorces 0,5 µM, 2,5 µL du cDNA dilué et 1,5 µL d’eau dans un volume final de 10 µL de chaque puits de la plaque de qPCR.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’aucun intérêts contradictoires n’existent.

Ce protocole est une amélioration de la technique décrite précédemment pour l’intubation orale par Collymore et al. 4 notre protocole décrit en détail la méthode intubation orale et comprend la préparation de l’intestin pour les analyses en aval. Notre méthode améliore la vitesse de manipulation de poissons permettant à une personne d’effectuer le protocole entier rapidement, sans beaucoup de variation entre les opérateurs. Une différence principale de notre protocole avec la précédente, ...

L’objectif de cet article est de décrire en détail une méthode simple pour l’intubation orale du poisson-zèbre, ainsi que des procédures en aval connexes utiles. Intubation orale à l’aide de poisson-zèbre est devenu un modèle de pratique dans l’étude de la dynamique des maladies infectieuses, vaccin oral/immunostimulant, absorption de drogues/NANOPARTICULE et efficacité et immunité muqueuse intestinale. Par exemple, le poisson zèbre intubation orale a été utilisée dans l’étude de l’infection à Mycobacterium marinum et Mycobacterium peregrinum 1. Lovmo et al. également utilisé avec succès ce modèle pour livrer des nanoparticules et M. marinum vers le tractus gastro-intestinal du poisson-zèbre adulte2. En outre, Chen et coll. utilisé zebrafish intubation orale pour montrer que les médicaments encapsulés par nanoparticules, quand administré via le tractus gastro-intestinal, ont été transportés à travers le sang cerveau barrière3. Ces auteurs ont effectué l’intubation selon la méthode de gauvage décrite par Collymore et al. 4 sous réserve de modifications. Toutefois, ils ne prévoyaient pas un protocole très détaillé décrivant la procédure d’intubation orale. Ici, nous présentons une méthode pour l’intubation orale du poisson-zèbre adulte s’appuyant sur l’arrêt Collymore et al. 4 nous incluons également la préparation de l’intestin pour analyse en aval pertinent par cytométrie en flux, microscopie confocale et qPCR.
L’intestin et particulièrement sa muqueuse est la première ligne de défense contre l’infection et le principal site d’absorption des éléments nutritifs5. Lorsque les cellules épithéliales et les cellules présentatrices d’antigène dans les barrières muqueuses perçoivent les signaux de danger, une réponse immédiate d’immunitaire innée est déclenchée. Ensuite, l’immuno-réaction adaptative très spécifique est établie par de6,les lymphocytes T et B7. Mise au point de vaccins oraux est une zone de mise au point actuelle en vaccinologie. Ces vaccins serait un outil efficace pour protéger l’organisme à des sites exposés en raison de la réponse spécifique des cellules immunitaires dans les tissus lymphoïdes associé aux muqueuses (MALT)8,9. En aquaculture, les vaccins ont des avantages évidents par rapport à l’aide de vaccins injectables. Ils sont pratiques pour la vaccination de masse, beaucoup moins de travail, sont moins stressants pour les poissons et peuvent être administrés aux jeunes poissons. Néanmoins, muqueuse vaccins candidats doivent atteindre le deuxième segment de l’intestin sans être dénaturé dans le milieu buccal. Ils doivent aussi franchir les obstacles muqueux pour accéder à l’antigène présentant des cellules (CPA) pour provoquer des réactions locales ou systémiques,10. Test de l’absorption muqueuse atteindre par les antigènes orale de candidats et de leurs vecteurs, ainsi que de la réponse immunitaire évoquée, est donc essentiel dans le développement de vaccins oraux.
Dans un contexte biomédical, élaboration d’un modèle pour tester les effets biologiques des composés après que intubation orale est d’un intérêt croissant. Bon nombre des caractéristiques anatomiques et physiologiques de l’intestin sont conservées entre deux lignées forment, avec les mammifères et poissons osseux11. Ce modèle d’intubation orale relié à l’analyse en aval peut être un outil pour donner un aperçu de la biologie humaine, mais aussi un terrain d’essai pour les produits biologiques ou autres composés en vivo.
Le protocole d’intubation orale peut être effectué par un seul opérateur, par exemple, administrer avec succès jusqu'à 50 µL de la suspension de nanoparticules de protéines de poissons pesant 1 g, avec un taux de survie élevé. La procédure est simple à mettre en place et rapide ; 30 poissons peuvent être intubés en 1 h. Le protocole pour la préparation intestinale est essentielle pour fournir des échantillons de cellules et de tissus de qualité pour une analyse ultérieure. On trouvera des exemples de résultats en aval qui montrent utilité du protocole dans l’obtention de données relies à l’absorption intestinale et à isoler l’ARN de qualité pour qPCR. Le protocole serait d’une grande utilité pour ceux qui ont besoin d’un modèle approprié pour tester la dynamique de la prophylaxie par voie orale ou d’autres composés dans l’intestin.

<table><tbody><tr><td>Tube en silicone</td><td>Dow Corning</td><td>508-001</td><td>0,30 mm de diamètre intérieur et 0,64 mm de diamètre extérieur</td></tr><tr><td>Aiguille Luer</td><td>lock Hamilton</td><td>7750-22</td><td>31 G, Kel-F Hub</td></tr><tr><td>Seringue Luer</td><td>lock Hamilton</td><td>81020/01</td><td>100 &mu ; L, Kel-F</td></tr><tr><td>Hub Pointe de pipette filtrée</td><td>Nerbe Plus</td><td>07-613-8300</td><td>10 &mu ; L</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>poudre</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre&nbsp ;</td><td>Filter-Lab</td><td>RM14034252</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Aigle modifié de Dulbecco moyen</td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>Filtre cellulaire</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Filtres CellTrics&nbsp ;</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326 (Wolflabs)</td><td>30 & micro ; Filtres à mailles m avec réservoir de 2 mL</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Moules en plastique pour cryosections</td><td>SAKURA</td><td>4557</td><td>Moules jetables en vinyle. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Slide Thermo</td><td>Scientific</td><td>10149870</td><td>SuperFrost Plus slide</td></tr><tr><td>Cover glasses</td><td>Labbox&nbsp ;</td><td>COVN-024-200</td><td>24&aigu ; 24 mm</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Atto-488 NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41698</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyKit de tissus</td><td>ARN Promega</td><td>AS1340</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycérol/Homogénéisation solution</td><td>Promega</td><td>Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td><td>ajoutant 20 &mu ; l 1-Thioglycérol à 1 mL solution d’homogénéisation (2 %)</td></tr><tr><td>rotateur vertical de laboratoire&nbsp ;</td><td>Suministros Grupo Esper</td><td>10000-01062</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM3050S Homogénéisateur</td><td>KINEMATICA</td><td>Polytron PT1600E</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux&nbsp ;</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACS Canto</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tube à fond rond</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Hotte</td><td>Kottermann</td><td>2-447 BST</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Spectrophotomètre</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td><td>Agilent</td><td>G2939A</td><td>Bioanalyseur d’ARN</td></tr><tr><td>Maxwell Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ADNc iScript&nbsp ;</td><td>Bio-rad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>CFX384 PCR en temps réel&nbsp ; Système de détection</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr><tr><td>iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td><td>Bio-rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>Eau&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Flacon cryogénique&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td>CryoTube</td></tr><tr><td>flacon Support de montage</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td>Fluoroshield avec DAPI</td></tr></tbody></table>

intubation orale du poisson-zèbre adulte : un modèle pour l’évaluation de l’absorption intestinale des composés bioactifs

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Plupart des agents pathogènes envahissent les organismes par l’intermédiaire de leur muqueuse. Cela est particulièrement vrai chez les poissons, car ils sont exposés en permanence à un environnement microbien riches en eau. Développer des méthodes efficaces pour l’administration orale d’immunostimulants ou de vaccins, qui activent le système immunitaire contre les maladies infectieuses, est hautement souhaitable. Dans l’élaboration des outils prophylactiques, bons modèles expérimentaux sont nécessaires pour tester leurs performances. Ici, nous montrons une méthode pour l’intubation orale du poisson-zèbre adulte et un ensemble de procédures de disséquer et de préparer l’intestin pour la cytométrie en flux, microscopie confocale et analyse la réaction en chaîne (qPCR) polymérase quantitative. Avec ce protocole, nous pouvons administrer précisément les volumes jusqu'à 50 µL de pêcher pesant environ 1 g simplement et rapidement, sans nuire aux animaux. Cette méthode permet d’explorer l’absorption directe in vivo des composés fluorescents marqués par la muqueuse intestinale et la capacité immunomodulatrice de tels produits biologiques sur le site local après intubation. En combinant des méthodes en aval comme la cytométrie en flux, histologie, qPCR et microscopie confocale du tissu intestinal, nous pouvons comprendre comment immunostimulants ou vaccins sont capables de traverser les barrières muqueuses intestinales, passent par la lamina propria, et atteindre le muscle, exerçant un effet sur le système immunitaire des muqueuses intestinal. Le modèle pourrait servir à tester la prophylaxie orale de candidat et de vecteurs ou de l’effet local de tous les composés bioactifs administré par voie orale.

Poisson-zèbre (poids moyen : 1,03 ± 0,16 g) de sexe mixte ont été intubés avec succès avec des nanoparticules de différentes protéines recombinantes (inclusions bactériennes) à l’aide de notre dispositif d’intubation orale fait maison (Figure 1). Nous avons avec succès effectué l’intubation orale et atteint un taux de mortalité faible pourcentage moyen (6,8 %) (Tableau 1). Poisson zèbre ont été soit intubé avec 30 µL ou 50 µL de suspensions d...

Le protocole décrit intubating poisson-zèbre adulte avec un produit biologique ; puis dissection et la préparation de l’intestin pour la cytométrie en flux, microscopie confocale et qPCR. Cette méthode permet à l’administration de composés bioactifs pour surveiller l’absorption intestinale et la stimulation immunitaire locale évoquée. Il est utile pour tester la dynamique intestinale de la prophylaxie par voie orale.

Intubation orale du poisson-zèbre adulte : un modèle pour l’évaluation de l’absorption intestinale des composés bioactifs

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la vaccinologie muqueuse, telles que la façon dont la muqueuse intestinale absorption des composés biologiques et comment ces produits biologiques modulent le système immunitaire au site local après l’intubation. Le principal avantage de cette technique est qu’il est simple à mettre en place, rapide, et montre de faibles taux de mortalité. Cette méthode peut fournir un aperçu de la vaccinologie muqueuse.Il peut également être appliqué à d’autres composés, tels que les produits chimiques, les substances toxiques ou les agents pathogènes. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car dans les étapes orales d’intubation et de dissection intestinale, vous devez être prudent parce que dans l’intubation vous pourriez blesser le poisson zèbre et causer la mort. En dissection, l’extrémité de l’intestin est très fine et fragile.Placez environ un centimètre de tubes en silicone fin sur une aiguille luer-lock de calibre 31. Coupez une pointe stérile de pipette filtrant de 10 microlitres, prenez l’extrémité la plus fine et placez-la sur le tube de silicone comme gaine. Pour commencer, fixez l’appareil à aiguille à une seringue luer-lock de 100 microlitres.Tout d’abord, déplacez le poisson vers les réservoirs expérimentaux une nuit avant l’expérience. Vortex la solution de nanoparticule préparée bien, et d’élaborer le volume désiré de la suspension. Après avoir anesthésier le poisson en toute sécurité, utilisez un filet pour transférer rapidement le poisson dans un plateau en plastique humide.Orientez l’animal horizontalement pour faire face à l’aiguille. Soutenir soigneusement le poisson d’une main et ouvrir la bouche avec l’aiguille protégée. Puis, insérez doucement l’aiguille vers le bas de l’œsophage à environ un centimètre de l’ouverture de la bouche.Il est difficile de voir jusqu’où l’aiguille doit aller, et c’est une question de pratique. Vous sentirez l’aiguille comme il trouve un arrêt, puis en manipulant l’aiguille, vous trouverez l’angle correct pour insérer l’appareil un peu plus. Injectez lentement la suspension des nanoparticules dans le poisson, en veillant à ce que la suspension ne s’écoule pas vers l’extérieur par les branchies ou la bouche.Après cela, retirez doucement l’aiguille et placez le poisson dans un réservoir de récupération. Pendant que le poisson récupère, surveillez le poisson pour toutes les anomalies. Une fois le poisson récupéré, retournez-le dans l’un des réservoirs expérimentaux.Après avoir euthanasié le poisson selon le protocole du texte, placez le poisson sur un morceau de papier filtre. À l’aide de ciseaux de dissection tranchants, faire une incision semi-circulaire de l’anus à l’operculum, et ouvrir l’incision avec des pinces fines. Ensuite, coupez les deux extrémités de l’intestin, sortez tous les organes internes et placez-les sur le papier filtre.Ensuite, séparez l’intestin des organes internes, et étirez-le, en prenant soin d’obtenir tout l’intestin. Enfin, utilisez des pinces à épiler pour rouler l’intestin sur le papier filtre pour détacher le tissu adhésif. Utilisant ce protocole, le poisson zèbre du sexe mélangé ont été avec succès intubés avec différentes nanoparticules recombinantes de protéine.Utilisant le dispositif oral fait maison d’intubation, un faible pourcentage moyen de mortalité a été réalisé. Pour évaluer la livraison des corps fluorescents d’inclusion de nanoparticules faits avec l’alpha recombinant de TNF, une analyse de cytométrie a été exécutée. La quantité totale de cellules fluorescentes était significativement plus élevée dans le groupe intubé par nanoparticules que dans le groupe témoin cinq et 24 heures après l’intubation.L’équipement d’intubation est peu coûteux, précis et réutilisable. L’ensemble de la procédure d’intubation peut être fait très rapidement par un opérateur, et, surtout, la méthode est cohérente entre les différents opérateurs. La combinaison de notre méthode d’intubation et de l’analyse en aval pourrait être idéale pour la mise au point d’un vaccin oral.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous démontrons injection intrapéritonéale dans le poisson zèbre adulte. Nous utilisons une microseringue 10 ul Nanofil contrôlée par un contrôleur Micro4 et UltraMicroPump III. Cette manifestation comprend l'utilisation de l'eau froide comme anesthésique.

Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

Nous présentons une nouvelle méthode de gavage microscopique de larves de poisson-zèbre utilisant du matériel standard d'injection microscopique d'embryons et de microscopie stéréo. Nous démontrons que le gavage microscopique est une technique sûre et efficace, utile pour délivrer des quantités contrôlées de divers matériaux directement dans la lumière intestinale des larves de poisson-zèbre.

Microgavage de larves de poisson zèbre

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Intubation orale du poisson-zèbre adulte : un modèle pour l’évaluation de l’absorption intestinale des composés bioactifs

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