Name: Le Peptide de40 MUB destinés à détecter l’Inflammation induite par le neutrophile événements (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Découvrez la détection des neutrophiles dans les tissus inflammatoires à l'aide du peptide MUB40. Cette méthode permet une visualisation spécifique des granules de lactoferrine pour étudier l'inflammation.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (préstation) et ANR JCJC accorde (ANR-17-CE15-0012) (préstation).

Toutes les méthodes décrites ici ont été examinées et approuvées par les organismes Français CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) et CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).
1. coloration des neutrophiles dans le tissu d’histopathologie avec fluorescent étiquetés MUB40
<ol><li>Pour obtenir le tissu pour l’histopathologie, difficulté sections/biopsie de tissu dans un volume adéquat de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 30 min à 4 h selon l’épaisseur de l’échantillon. Placer les échantillons dans un réfrigérateur à 4 ° C durant la fixation. Remarque : Méthodes de fixation Alternative/horaires peuvent être remplacés selon les exigences uniques de l’utilisateur.<ol>
<li>Supprimer la PFA, ajouter la solution de saccharose de 16 % avec un volume suffisant pour recouvrir entièrement l’échantillon et placer l’échantillon à 4 ° C pendant 4 h jusqu'à la nuit.</li>
		<li>Enlever la solution de saccharose de 16 % et ajouter une solution de saccharose 30 % à un volume assez grand pour recouvrir entièrement l’échantillon et placez-le à 4 ° C pendant 4 h jusqu'à la nuit.</li>
		<li>Enlever la solution de saccharose 30 % et éponger hors excédent de solution du tissu avec du papier absorbant. Placer la section de tissu dans les médias de température (OCT) de coupe optimale et clin d’oeil-gel 2-méthylbutane refroidi dans un bain de glace sèche-éthanol (-72 ° C). Une fois gelé (après environ 2 min), retirer les blocs de la 2-méthylbutane et placez-les sur la glace sèche jusqu'à ce que tous les blocs sont terminé et prêt pour le stockage à long terme. Stocker les blocs congelés à-80 ° C pour le stockage à long terme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La veille de blocs de tissus doivent être coupés, les sortir du congélateur-80 ° C et placez-les à-20 ° C pendant la nuit s’équilibrer.<ol>
<li>À l’aide d’un cryostat, couper le tissu OCT-encastré en tranches de 10 à 30 μm d’épaisseur et s’adsorber sur lames de verre de haute qualité. Remarque : Plus épais ou plus minces tranches peuvent être utilisés selon les conditions expérimentales.</li>
		<li>Avec un crayon de cire ou autre méthode hydrophobe, dessinez un rectangle autour de la tranche de tissu sur la lame de verre et laissez sécher.</li>
		<li>Préparer la solution colorante en effectuant une dilution de 1 : 1 000 de MUB40-Cy5 (ou autre version fluorescente de40MUB, 1 mg/mL de solution) dans une solution de saponine-PBS de 0,1 %. La concentration optimale de40 MUB finale devrait être de 1 μg/mL. Nota : La concentration finale inférieure peut être utilisée (0,01-0,1 μg/mL), mais peut conduire à abaisser l’intensité du signal. Attention : Poudre de saponine peut causer une irritation respiratoire. Prenez soin de peser la saponine dans un placard ou protégées. Méthodes perméabilisation alternatives peuvent être utilisées comme Triton. Ajouter des marqueurs supplémentaires à des concentrations de fabricant-recommandé (p. ex.., 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), la phalloïdine, anticorps fluorescents).</li>
		<li>Doucement, trempez la lame de verre dans une solution de saponine-PBS de 0,1 % trois fois.</li>
		<li>Soigneusement éponger le liquide en excès loin autour de la section de tissus et ajouter assez solution colorante pour couvrir complètement la section de tissu. Placez le chariot dans une chambre humide pour éviter l’évaporation et il incuber pendant 1 heure à température ambiante. Gardez-la à l’abri de la lumière.</li>
		<li>Tremper délicatement la lame dans la solution de saponine-PBS 0,1 % 3 x. Puis, doucement tremper la lame dans la solution de PBS 3 x. Enfin, doucement tremper la lame dans distillée H2O 3 x. Séchez soigneusement le liquide en excès de la diapositive.</li>
		<li>Ajouter une petite quantité (~ 20 μL) de milieu de montage (20 mM Tris pH 8,0, gallate de propyle de 0,5 %, 90 % de glycérol) à côté de la tranche de tissu et poser délicatement vers le bas une lamelle de verre sur le dessus de la lame de verre. Légèrement et uniformément, appuyer sur la lamelle couvre-objet sur la section de tissu et, à l’aide d’une serviette en papier, retirez soigneusement tout support de montage qui extrude autour des bords de la lamelle.</li>
		<li>Placez le chariot monté dans une armoire sombre pendant 24 heures afin de permettre le support de montage solidifier. Vous pouvez également mettre la lame montée à 37 ° C pendant 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Les tranches de tissu sur un microscope à fluorescence selon la méthode d’acquisition souhaitée de l’image.</li>
</ol>2. visualisation des neutrophile Activation avec rétro-Inverso-MUB40-Peptide Cy5
<ol><li>Obtenir des neutrophiles humains en utilisant le protocole suivant. Préparer les solutions suivantes et placez-les dans une nuit armoire anoxique. Exposition à l’oxygène commence à activer des neutrophiles et induire davantage cellule mort16,17. Remarque : Neutrophiles peuvent être alternativement purifiés « sur le banc » MUB40-étiquetage des expériences ; Toutefois, sachez qu’exposition oxygène vont commencer à affecter les neutrophile activation.<ol>
<li>Préparer la solution suivante : Solution 1 [chlorure de sodium (NaCl) 0,9 %] : ajouter 4,5 g de NaCl à 500 mL d’H2O. filtrer la solution. Solution 2 (dextran 6 %) : ajouter 6 g de dextran dans NaCl 0,9 % solution à 100 mL. Solution 3 (tampon de lavage) : dissoudre l’acide tétraacétique (EDTA) dans le tampon au phosphate pH 7,2 à une concentration finale de EDTA de 2 mM. Immédiatement avant l’utilisation, dissoudre l’albumine sérique bovine (BSA) dans la solution de PBS/EDTA telle que la concentration finale de BSA est 10 % p/v.</li>
		<li>Centrifuger les tubes de prélèvement sanguin à 650 x g pendant 20 minutes sans pauses.</li>
		<li>Sans perturber le sang séparé, transférer les tubes de prélèvement sanguin à un fractions anoxique plasma frais virés et du cabinet (en haut) dans un tube conique de 50 mL.</li>
		<li>Retirer le tube contenant du plasma du cabinet anoxique et centrifuger à 2 900 x g pendant 20 min avec des pauses pour granuler les plaquettes.</li>
		<li>Sans perturber les plaquettes granulés, transfert de doucement le tube de plasma dans le cabinet anoxique et la pipette le plasma pauvre en plaquettes dans un tube de frais 50 mL (ci-après dénommé « plasma »).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Séparation des globules rouges de leucocytes<ol>
<li>En utilisant les tubes contenant les globules rouges (hématies) de l’étape 2.1.3., combiner les globules rouges dans un tube conique de 50 mL (5 sang tube contenu de la collection par tube de 50 mL).</li>
		<li>Ajouter NaCl 0,9 % jusqu'à ce que le volume total s’élève à 44 mL. Ajouter 6 mL de dextran 6 % (dernier).</li>
		<li>Mélanger délicatement le mélange de sang/dextran en renversant le tube de 10 à 20 fois. Laissez le sédiment du tube pendant au moins 30 min.</li>
		<li>Alors que la sédimentation se produit, préparer un gradient de Percoll en ajoutant 4,2 mL de solution de Percoll à 5,8 mL de plasma dans un tube conique de 15 mL et bien mélanger en renversant le tube.</li>
		<li>Recueillir la fraction supérieure du dextran tout en essayant d’éviter de pipetage de globules rouges.</li>
		<li>Serrer le bouchon à vis, retirez le tube de dextran de la chambre anoxique et centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 min avec des pauses.</li>
		<li>Soigneusement placer le tube dans la chambre d’anoxique sans déranger les cellules granulés et évacuer le liquide par pipetage.</li>
		<li>Doucement resuspendre le culot dans 1 mL de plasma et ajouter très lentement vers le haut de la solution de Percoll. Veillez à ne pas induire le mélange des couches lors du pipetage les cellules sur le dessus.</li>
		<li>Retirer délicatement le tube de solution Percoll de la chambre anoxique (en évitant le mélange) et centrifuger à 800 x g pendant 20 minutes sans pauses. Les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) restera à la surface de solution Percoll et neutrophiles seront pellet avec les globules rouges.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enlèvement de contaminer des globules rouges<ol>
<li>Préparation de 14 mL de solution tampon de lavage en ajoutant 700 μL PBS + 10 % de BSA à 14 mL de tampon de lavage.</li>
		<li>Placer le tube de solution Percoll dans la chambre d’anoxique. Retirez le Percoll et PBMC par pipetage et remettre en suspension les cellules boulettes dans 1 mL de solution tampon de lavage. Le culot d’être remises en suspension aura une couleur rouge en raison de la contamination de globules rouges.</li>
		<li>Ajouter 200 μl de billes magnétiques anti-CD235a (glycophorine) aux cellules remises en suspension, mélanger doucement et incuber pendant au moins 15 min. Cette étape charge les hématies contaminantes avec billes magnétiques afin qu’ils puissent être enlevés.</li>
		<li>Laver la colonne de séparation avec 2 mL de lavage tampon x 3.</li>
		<li>Tout en maintenant un tube conique de 15 mL sous la colonne de séparation, lentement déposer le mélange de neutrophile/RBC en haut de la colonne. Recueillir les cellules dans le tube de 15 mL conique qu’ils traversent. Le cheminement sera nuageux et perdre sa couleur rouge à cause de la SCFR restant lié à la colonne.</li>
		<li>Ajouter 2 mL de tampon vers le haut de la colonne de lavage et de recueillir dans le même tube conique de 15 mL. La fin du cycle de lavage 2 mL, le cheminement doit être clair, ce qui signifie que tous les neutrophiles ont été recueillis.</li>
		<li>Mélanger doucement le tube pour assurer une répartition égale des neutrophiles et collecter 10 μL pour le comptage des cellules. Noter le volume final de cellule comptage fins. Énumérer le nombre total de cellules avec n’importe quelle cellule standard méthode de comptage.</li>
		<li>Retirer le tube de neutrophil de la chambre anoxique et centrifuger les neutrophiles à 300 x g pendant 20 min avec des pauses.</li>
		<li>Placer les neutrophiles sédimentés dans la chambre d’anoxique et retirer le tampon de lavage par pipetage. Resuspendre le culot de neutrophil dans le plasma avec une densité maximale de 107 PMN/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Énumération des neutrophiles purifiées et visualisation à l’aide de MUB40<ol>
<li>Ajouter 1 μL de RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL) à 1 mL de milieu Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sans rouge de phénol. Mélanger en pipettant également bien.</li>
		<li>Aux fins du présent protocole, le résultat a été décrit comme si un puissant neutrophile activation réactif, N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (FMLP), est ajouté. Ajouter 1 μm de FMLP dans le RPMI/RI-MUB40-mélange par pipetage et Cy5 tube haut et bas. Remarque : Chaque procédure expérimentale sera différente à partir de ce moment, selon les questions abordées.</li>
		<li>Transférer le RPMI/RI-MUB40de 1 mL-Cy5/FMLP mélange dans un plat de microscopie de fond de verre. Pour ce plat, ajouter un volume de cellules purifiées correspondant à 106 total neutrophiles. La composition de pipetage doucement.</li>
		<li>Placer le plat dans un microscope inversé à fluorescent et acquisition d’images de démarrage. Par exemple, il est recommandé d’acquérir des images de référence avant l’addition d’un réactif d’activation des neutrophiles comme FMLP ou bactéries. Dans cet exemple, commencer l’acquisition de RPMI/RI-MUB40-Cy5/neutrophiles, un validant ultérieure, pipeter le réactif de l’activation des neutrophiles dans le plat en verre et à poursuivre l’acquisition d’images. Remarque : Modifications à ces étapes peuvent être effectuées selon besoins scientifiques.</li>
		<li>Processus acquis films images/time-lapse comme se rapporte au microscope spécifique utilisé.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Préstation est répertorié en tant qu’inventeur MUB40 brevets :
MUB40: EP11290403.2 de brevet européen, 09/09/2011.
RI-MUB40: brevet européen EP no 17306746.3, 12/11/17.

Ici, deux essais sont décrits dans lequel le peptide de40 MUB est utilisé pour étudier l’activation et l’inflammation neutrophile. Nous montrons comment MUB40 peut révéler des neutrophiles présent dans les sections de l’histopathologie ou montrent leur état d’activation à l’aide de direct neutrophiles purifiées. Les étapes critiques d’utilisation MUB40 comme réactif de coloration sont les mêmes qu’avec n’importe quelle autre méthode de détection par fluorescence. Il faut pour assurer la c...

Neutrophiles sont une des branches principales du système immunitaire inné et sont systématiquement recrutés aux sites d’inflammation autour du corps. L’étude des neutrophiles a été grandement altérée par leur courte durée de vie in vitro (moins de 8 h) et par les outils de détection limitée dans des conditions basales ou après l’activation. Nous présentons ici un protocole éprouvé pour la détection large et spécifique des neutrophiles mammifères dans les échantillons fixe/perméabilisées. Nous fournissons également un protocole détaillé pour la coloration des neutrophiles direct avec MUB40. En utilisant le protocole de coloration neutrophil direct, le calendrier et la localisation d’activation neutrophile peuvent être déterminées. Ce protocole est idéal pour les chercheurs qui souhaitent étudier les neutrophile libération d’activation ou de granules. Au-delà de leurs fonctions antimicrobiennes, neutrophiles sont maintenant appréciés comme des immunomodulateurs cellules impliqués dans un large éventail de maladies et de la réponse immunitaire (inné et adaptatif)1,2. Les neutrophiles sont présents dans les tissus inflammatoires plus, à des nombres élevés dans les tissus infectés et dans les tumeurs inflammatoires3, au cours de l’IBS et de Crohn poussées4, dans les zones d’inflammation non infectieuses comme le synovia de polyarthrite rhumatoïde ( Les patients de RA)5. Neutrophiles contiennent des quatre classes de granules préformés nommées azurophiles (α), spécifiques (β1), granules tertiaires (β2) et vésicules de sécrétion (γ)6. Lors de la migration vers un site inflammatoire, neutrophiles recrutés deviennent activés et sécrètent séquentiellement contenu de granule (composé d’adhérence, composés antimicrobiens et molécules immunomodulatrices), qui favorise davantage le recrutement et contribue à infection de résolution (mais aussi à des lésions tissulaires hôte)7. Tandis que les neutrophiles sont considérés comme un aspect essentiel de l’immunité innée, ce jour là sont peu réactifs de détection disponibles à les étudier, et encore moins qui peut être utilisé pour évaluer l’état d’activation des neutrophiles vivant.
Les méthodes actuelles de détection des neutrophiles s’appuient sur des anticorps monoclonaux contre des antigènes exposés de surface cellulaire, comme Ly - 6 G2 ou protéines spécifiquement stockés dans des granules de neutrophiles dans les conditions basales (p. ex., myéloperoxydase la lactoferrine). Avantages des anticorps monoclonaux sont leur forte liaison, une sensibilité et polyvalence dans diverses conditions de test. Cependant, il y a plusieurs inconvénients à l’utilisation des anticorps monoclonaux et anti-Ly - 6G en particulier. Ces inconvénients incluent la spécificité, comme Ly - 6G est présent sur la plupart des cellules myéloïdes dans la moelle osseuse et sur tous les granulocytes notamment éosinophiles ; déchiffrage des neutrophiles d’éosinophiles avec ce marqueur requiert donc8des approches plus complexes. Un autre compromis fréquents avec des anticorps monoclonaux est leur gamme de spécificité d’hôte souvent limité, complique les comparaisons effectuées avec plus d’une espèce animale. Un troisième inconvénient des méthodes de détection d’anticorps, en particulier lors de l’utilisation des cellules vivantes ou in vivo, est leur capacité à perturber la fonction cellulaire ou mènent à l’activation des cellules. Par exemple, l’administration d’anti-Ly - 6G de souris est couramment appliquée à l’appauvrissement de neutrophil et de neutropénie transitoire9. En outre, il a été démontré qu’injection d’anticorps pourrait stimuler la fonction antitumorale neutrophiles10. Enfin, la détection des anticorps des neutrophiles ne révèle pas l’état d’activation de la cellule.
Nous avons identifié un peptide d’acides aminés 40 appelé MUB40, qui peut être utilisé dans un certain nombre d’épreuves pour étiqueter des neutrophiles dans des conditions in vitro ou in vivo ainsi que d’analyse l’état d’activation des neutrophiles direct11. MUB40 est dérivé de MUB7012, un domaine de la protéine liant le mucus de surface de Lactobacillus reuteri décrite à l’origine pour sa capacité à lier les mucus13,14. MUB40 interagit avec la lactoferrine glycosylée qui est présente à des concentrations élevées dans les granules spécifiques neutrophile et tertiaires. MUB40 peuvent être exposés à ces granules des étapes perméabilisation standard qui sont présents en histopathologie ou fluorescence-lancée de cellules tri des protocoles (FACS) pour coloration robuste des neutrophiles fixes. Lorsque live neutrophiles sont conservés dans un état inactivé, le peptide de40 MUB est exclu le contenu de granule et cellules tache pas positifs avec le marqueur. Lors de l’activation, MUB40 peut se lier à la lactoferrine exposée et conduire à coloration robuste avec le peptide. Ainsi, MUB40 peut servir à déterminer l’état d’activation des neutrophiles purifiés, ce qui en fait un marqueur attrayant de suivre le processus infectieux. La capacité de liaison aux neutrophiles activés en direct permet également aux MUB40 à être utilisé comme un outil pour détecter les zones d’inflammation neutrophile dans des modèles animaux vivants (par exemple, une souris arthrite modèle15). Les protocoles ce manuscrit en détail comment fluorescent étiqueté MUB40 peuvent être utilisés pour révéler des neutrophiles dans les tissus de l’histologie et comment analyser l’activation des neutrophiles purifiée live in vitro.

<table><tbody><tr><td>MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Peptide fluorescent MUB40 (disponible avec d’autres fluorophores conjugués)</td></tr><tr><td>RI-MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Peptide MUB40 fluorescent rétro-inverso. Synthétisé avec des acides aminés D et résistant aux protéases (disponible avec d’autres fluorophores conjugués)</td></tr><tr><td>Parformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Fixateur pour l’histologie</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td>Solution utilisée pour éliminer l’excès de PFA</td></tr><tr><td>Composé à température de coupe optimale (OCT)</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>Utilisé pour congeler les tissus avant la coupe du</td></tr> <tr>cryostat<td>2-Méthylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td>Utilisé pour congeler les tissus avant la section du cryostat</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00974</td><td>Utilisé pour le bain de glace carbonique pour congeler les tissus</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1520</td><td>Utilisé pour sectionner les tissus</td></tr><tr><td>Lames de microscopie en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-101</td><td></td></tr><tr><td>Couvertures</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>Couvre-lame de haute précision</td></tr><tr><td>Dako pen&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Utilisé pour prévenir la perte de liquide lors de la coloration des tissus</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Utilisé pour perméabiliser les cellules pour la coloration IF</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>Colore l’ADN&nbsp ;</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 Phalloïdine&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Lie l’actine</td></tr><tr><td>Prolonger l’or anti-effacement Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Prolonge le signal IF et la résistance au photoblanchiment</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td>Utilisé pour l’imagerie des lames IF Cabinet</td></tr><tr><td>anoxique</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td>Utilisé pour la purification des neutrophiles inactivés vivants</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium NaCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Composant de tampon de lavage</td></tr><tr><td>Tampon MACS BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>Composant de tampon de lavage</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td>Gradient pour la purification des neutrophiles</td></tr><tr><td>CD235a microbilles magnétiques de glycophorine</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td>Utilisé pour éliminer les globules rouges contaminants</td></tr><tr><td>Colonnes LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Utilisé pour l’élimination des globules rouges des neutrophiles</td></tr><tr><td>RPMI-1640 sans rouge de phénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8755</td><td>Utilisé pour les dosages des neutrophiles</td></tr></tbody></table>

le peptide de40 mub destinés à détecter l’inflammation induite par le neutrophile événements

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Ici, nous fournissons un protocole impliquant l’utilisation de MUB40, un peptide synthétisé avec le pouvoir de lier la lactoferrine glycosylée stockée à des concentrations élevées dans les granules spécifiques et tertiaires des neutrophiles. Ce détails du protocole comment MUB40 conjugué directement à un fluorophore peuvent être utilisé pour colorer les neutrophiles en fixe/perméabilisées tissus ainsi que la façon dont ceci peut être utilisé dans l’imagerie de cellules vivantes à analyser pour la granulation et activation de neutrophile. Méthodes de détection neutrophiles sont limités à des anticorps monoclonaux spécifiques à l’espèce, qui ne sont pas toujours adaptés pour certaines applications. MUB40 ne pénètre pas la membrane cellulaire et est donc exclu de la lactoferrine stockée dans les neutrophiles non-activé/non-perméabilisées. MUB40 a l’avantage de reconnaître la lactoferrine d’une vaste gamme d’hôtes, ce qui en fait surtout utile pour comparer les résultats dans les études impliquant des modèles de recherche multiple, réduisant le nombre de réactifs en double et en simplifiant les protocoles par la seule étape souillure.

Résultats de MUB40-tissus tachés de diapositives d’histopathologie révèlent en général des cellules individuelles, dispersés à travers le tissu. MUB40 taches lactoferrine, qui est présente dans les granules neutrophiles et compartimentée. Ainsi, généralement vu sont ponctuée de taches ou de plusieurs grandes surfaces séparées du signal en provenance des neutrophiles (Figure 1). Il est utile d’ajouter un deuxième marqueur de cellules comm...

Nous présentons ici un protocole visant à détecter la présence de neutrophiles dans les sections fixes/perméabilisées histologie et évaluer l’état d’activation des neutrophiles purifiées direct. En particulier, le peptide de40 MUB lie la lactoferrine présente dans les granules spécifiques neutrophile et tertiaires. Exposition du contenu par perméabilisation ou activation neutrophile granule permet le marquage des neutrophiles.

Le Peptide de40 MUB destinés à détecter l’Inflammation induite par le neutrophile événements

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 est un nouveau marqueur neutrophile, qui se lie à la lactoferrine et permet une détection spécifique chez l’homme et tous les échantillons de tissus mammifères testés jusqu’à présent. L’étiquetage des neutrophiles avec MUB40 est facile, rapide et spécifique. Il est maintenant largement utilisé dans notre laboratoire et l’implication de cette technique s’étendent vers le diagnostic des maladies inflammatoires.Pour commencer, préparez des solutions une, deux et trois selon le protocole du texte, et placez-les dans une armoire anoxique pendant la nuit. Ensuite, centrifugeuse les tubes de sang recueilli à 650 g pendant 20 minutes pour séparer les cellules de la fraction plasmatique. Sans perturber le sang séparé, transférer les tubes à l’armoire anoxique et transférer les fractions plasmatiques dans un tube conique de 50 millilitres.Après cela, retirez le tube de plasma de l’armoire anoxique et centrifugez-le à 2900 g pendant 20 minutes. En prenant soin de ne pas perturber les plaquettes granulées, transférer le tube à l’armoire anoxique et pipette le plasma plaquette pauvres dans un tube frais de 50 millilitres. À l’aide des tubes de collecte de sang, mélanger les globules rouges dans un tube conique de 50 millilitres.Ensuite, ajoutez 0,9 % de chlorure de sodium jusqu’à ce que le volume total atteigne 44 millilitres et ajoutez six millilitres de 6 % dextran. Inverser le tube de 10 à 20 fois pour mélanger délicatement le mélange de sang et de dextran, et laisser le tube sédimenter pendant au moins 30 minutes. Pendant que le tube sédimente, préparer un gradient percoll en ajoutant 4,2 millilitres de solution Percoll à 5,8 millilitres de plasma, et inverser le tube pour mélanger.Ensuite, recueillir le neutrophile contenant la fraction supérieure du dextran, en prenant soin de ne pas pipette globules rouges. Serrez le bouchon de vis, retirez le tube de dextran de l’armoire anoxique et centrifugez le tube à 300 g pendant 10 minutes. En prenant soin de ne pas déranger les cellules granulées, placez le tube dans l’armoire anoxique.Ensuite, retirez le liquide par pipetting. Resuspendez doucement la pastille en un millilitre de plasma. Ajoutez lentement les cellules résuspendus au sommet de la solution Percoll.Retirez soigneusement le tube de solution Percoll de l’armoire anoxique et centrifugez-le à 800 g pendant 20 minutes pour séparer les PBMC des neutrophiles. Ensuite, préparez 14 millilitres de solution tampon de lavage selon le protocole de texte. Ensuite, placez le tube Percoll dans l’armoire anoxique.Utilisez une pipette pour enlever le Percoll et les PBMCs et résuspendez le neutrophile contenant des granulés dans un millilitre de solution tampon de lavage. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de perles magnétiques aux cellules résuspendues. Mélanger et incuber délicatement les cellules et les perles pendant au moins 15 minutes.Après cela, laver une colonne de séparation deux fois, avec deux millilitres de tampon de lavage. Tout en tenant un nouveau tube conique de 15 millilitres sous la colonne, pipette lentement le mélange de globules rouges neutrophiles à travers la colonne. Le flux de la colonne doit être nuageux et perdre sa couleur rouge, confirmant la séparation totale des neutrophiles des globules rouges restants.Ajoutez deux millilitres de tampon de lavage au sommet de la colonne et recueillez le débit dans le même tube. À la fin de ce lavage, le débit doit être clair. Mélanger délicatement le tube de collecte pour s’assurer que les neutrophiles sont répartis uniformément.Puis recueilli 10 microlitres de l’écoulement à partir du comptage cellulaire. Après cela, retirez le tube de neutrophile de l’armoire anoxique et centrifugez le tube à 300 g pendant 20 minutes. Remettre les neutrophiles sédimentés dans l’armoire anoxique et retirer le tampon de lavage par pipetting.Ensuite, resuspendez la pastille dans le plasma. Ajouter un microlitre de RI-MUB40-Cy5 à un millilitre de RPMI-1640 moyen, sans phénol rouge, et mélanger via pipetting. Ensuite, ajoutez un microlitre de solution FMLP et pipette à mélanger.Transférer le mélange dans un plat de microscopie à fond de verre. Ajouter ensuite un volume approprié de cellules purifiées au plat. Enfin, placez le plat dans un microscope fluorescent inversé et commencez l’acquisition d’images.Dans ce protocole, MUB40 a été employé sur des cellules vivantes pour détecter la sécrétion de neutrophile sur la simulation avec FMLP. La dynamique de la libération de la teneur en granulés, y compris la lactoferrine, peut être visualisée au fil du temps, ici en magenta. MUB40 peut être en outre utilisé sur les neutrophiles fixes.Ici, des perles fluorescentes phagocytisantes dans une série timed. Le contenu du granule neutrophile est étiqueté ici en bleu. Les neutrophiles ont montré peu ou pas de coloration cellulaire aux premiers moments et graduellement, l’étiquetage RI-MUB40 a augmenté au fil du temps, tant sur la membrane plasmatique que sur la surface des perles.MUB40 peut également être utilisé sur les tissus inflammatoires fixes pour détecter les neutrophiles spécifiquement, comme le montrent les chiffres du texte. Nous décrivons ici la procédure de purification du neutrophile, appliquée régulièrement dans notre laboratoire. Toute autre méthode convient, l’étiquetage MUB40-Cy5 fonctionnera toujours.Le neutrophile peut être spécifiquement étiqueté avec MUB40 après purification, ou directement dans les tissus enflammés des patients ou des modèles animaux. Plusieurs dérivés MUB40 ont été conçus pour élargir son utilisation. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à un chercheur dans le domaine de l’inflammation, afin d’explorer le recrutement et l’activation neutrophiles dans les maladies inflammatoires.

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JoVE Journal

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Cette vidéo montre un test de dégranulation de granules azurophiles dans des neutrophiles de souris, impliquant la stimulation des neutrophiles pour libérer des granules azurophiles contenant de la myéloperoxydase. La réaction enzymatique qui s’ensuit est utilisée pour quantifier les niveaux de myéloperoxydase, ce qui donne un aperçu de l’activation des neutrophiles.

Un test pour surveiller la dégranulation des granules azurophiles dans les neutrophiles après activation

Nous décrivons une méthode d'imagerie non-invasive permettant de distinguer les stades inflammatoires. Administration systémique de luminol révèle des zones d'inflammation aiguë dépendent activité MPO dans les neutrophiles. En revanche, l'injection de lucigénine permet de visualiser l'inflammation chronique dépend de l'activité Phox dans les macrophages.

In vivo méthode d&#39;imagerie à distinguer inflammation aiguë et chronique

Lipides sont connus pour jouer un rôle important dans les fonctions cellulaires. Nous décrivons ici une méthode pour déterminer la composition lipidique des neutrophiles, en mettant l'accent sur le taux de cholestérol, en utilisant à la fois HPTLC et HPLC pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents de la formation de piège extracellulaire neutrophile.

Méthodes d&#39;étude Les modifications lipidiques de neutrophiles et de la formation subséquente des neutrophiles pièges extracellulaires

Ici, nous présentons trois méthodes pour évaluer la migration et l’infiltration de neutrophiles in vivo et in vitro. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.

Détection de la migration et de l’infiltration des neutrophiles chez les souris

Les protocoles décrits ci-dessus fournissent un guide pour visualiser et quantifier l’activité des protéases neutrophiles dans les expectorations humaines. Les applications de cette analyse vont de l’évaluation des traitements anti-inflammatoires à la validation des biomarqueurs, au dépistage des médicaments et aux études cliniques de grandes cohortes.

Surveillance de l’activité de l’élastase neutrophile et de la cathepsine G dans les échantillons d’expectorations humaines

Un protocole pour l’induction et l’analyse de pièges extracellulaires (TNE) in vitro est présenté. La quantification de l’ADN, de la cathélicidine (LL37) et de l’activité enzymatique a fourni des données qui montrent la variabilité de la composition et de la morphologie des TNE induites par des stimuli microbiens et chimiques dans des conditions contrôlées similaires.

Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Nous présentons un protocole pour une technique modifiée de dosage immuno-enzymatique sandwich permettant de mesurer quantitativement deux composants des restes de pièges extracellulaires neutrophiles, l’ADN conjugué myéloperoxydase et les complexes ADN conjugués à l’élastase neutrophile, dérivés de neutrophiles activés.

Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié

Ce protocole comprend un ensemble de tests fonctionnels des neutrophiles à utiliser comme méthode de criblage pour couvrir les fonctions de différentes voies de signalisation. Le protocole comprend une évaluation initiale et simple de la viabilité cellulaire, de la pureté, de la production d’espèces réactives de l’oxygène, de la migration en temps réel, de la phagocytose et d’une suggestion préliminaire de pièges extracellulaires à neutrophiles.

Un ensemble de techniques de dépistage pour un aperçu rapide de la fonction des neutrophiles

Ce protocole décrit un test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas qui permet de diagnostiquer le cancer au point d’intervention grâce à l’analyse ex vivo des activités protéases associées à la tumeur.

Test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas pour les diagnostics portables

Ce protocole définit une approche de microscopie à haut débit en temps réel pour visualiser et quantifier la libération de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles humains in vitro. La méthode reproductible permet d’étudier les caractéristiques et la cinétique de la libération de TNE lors de la stimulation avec des inducteurs de NETosis distincts et permet d’évaluer la pharmacologie des antagonistes de NETosis.

Quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes

Les neutrophiles de basse densité (LDN) augmentent considérablement dans plusieurs maladies. Les LDN sont généralement isolés par tri cellulaire. Nous présentons une méthode pratique pour obtenir de la NDT pure et viable. Après la centrifugation du sang périphérique par gradient de densité, les cellules sont incubées avec des microbilles magnétiques, puis la LDN est séparée par des colonnes magnétiques.

Méthode à microbilles magnétiques rapides pour la purification efficace de neutrophiles de faible densité

Découvrez la détection des neutrophiles dans les tissus inflammatoires à l'aide du peptide MUB40. Cette méthode permet une visualisation spécifique des granules de lactoferrine pour étudier l'inflammation.

Le Peptide de₄₀ MUB destinés à détecter l’Inflammation induite par le neutrophile événements

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