Synthèse et détermination de Structure des isomères PIIIA µ-conotoxine avec disulfure différentes connectivités

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la synthèse peptidique telles que la synthèse des peptides riches en disulfides et la détermination de leur modèle de pont disulfide correspondant. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la synthèse sélective de différents isomères de peptide de bondend de disulfide et leur caractérisation chimique et structurale suivante. Généralement, les individus nouveaux à cette méthode auront du mal parce que chaque peptide riche en disulfide se comporte différemment.

La synthèse et l’analyse peuvent devoir être partiellement optimisées pour le peptide ou la protéine individuels. Transférez les réacolteurs énumérés dans le protocole textuel aux vaisseaux correspondants et placez-les dans les raquettes appropriées du synthétiseur peptidique de phase solide. Ensuite, ajoutez 100 milligrammes de résine sèche aux colonnes de réaction et mettez-les dans la raquette du synthétiseur.

Démarrez la synthèse peptidique en phase solide tel que détaillé dans le protocole texte. Une fois la synthèse terminée, lyophilisé la résine du jour au lendemain. Maintenant, fendre le peptide de la résine et effectuer une protection profonde des chaînes latérales.

Pour ce faire, mélanger la résine séchée dans un tube de 12 millilitres et la refroidir à zéro degré Celsius sur la glace. Tout d’abord, ajouter 150 microlitres d’un mélange de charognards, puis ajouter un millilitre d’acide trifluoroacétique à 95 % par 100 milligrammes de résine. Laisser le mélange secouant doucement pendant trois heures à température ambiante.

Maintenant, filtrer le mélange à travers une frit en verre. Recueillir le filtrate dans des tubes, rempli individuellement d’éther de déthyle glacé à un millilitre de mélange de clivage par huit à 10 millilitres d’éther de diététhyle. Le peptide se précipite comme un solide blanc.

Après le rinçage et la centrifugeuse des tubes tels que décrits dans le protocole de texte, congelez-séchez les peptides. Pour purifier le précurseur linéaire avec une chromatographie semi-préparative ajouter environ 70 milligrammes de peptide brut à un tube de 15 millilitres. Puis dissoudre le peptide brut dans 0,1%TFA et un-à-un Acetonitrile à l’eau.

Séparez le mélange peptidique à l’aide d’un gradient de zéro à 50%Eluent B sur 120 minutes à un débit de 10 millilitres par minute. Recueillir les fractions dans les tubes individuels tels qu’ils apparaissent et préparer des fractions sélectionnées pour la spectrométrie de masse et l’analyse HPLC tel que décrit dans le protocole texte. Séchez les fractions et combinez les fractions des pairs.

Commencez la formation sélective de liaisons de disulfide en effectuant la première oxydation. Pour ce faire, dissoudre 15 milligrammes du peptide linéaire lyophilisé en 105 millilitres d’un mélange d’eau isopropanol. Laisser le mélange en remuant à l’air dans des conditions de base pendant 12 à 48 heures.

La procédure d’oxydation stepwise est très critique. Les contrôles de réaction sont pris dans les trois étapes d’oxydation pour assurer la formation riche en disulfide individuel. La troisième oxydation est la plus cruciale parce que le brouillage du disulfide peut se produire lorsque le temps de réaction optimal est dépassé.

Maintenant, effectuez la deuxième oxydation. Dissoudre 15 milligrammes du peptide lyophilisé dans 105 millilitres d’une eau isopropanol, un mélange d’acide chlorhydrique molaire. Ajouter 158 microlitres d’une solution d’iode molaire de 0,1 molaire en méthanol à la solution.

Remuer la réaction à température ambiante jusqu’à ce que l’oxydation soit terminée. Puis arrêter la réaction en ajoutant 79 microlitres d’un acide ascorbique molaire dans l’eau. Enfin effectuer la troisième oxydation.

Dissoudre 15 milligrammes de peptide lyophilisé dans 5,5 millilitres de TFA contenant un mélange de charognards. Précipitez le peptide dans des tubes contenant de l’éther de détyle froid à un millilitre de solution de réaction par huit à dix millilitres d’éther de diététhyle. Effectuer la purification du peptide à 15 milligrammes du produit brut lyophilisé à un tube de 15 millilitres.

Dissoudre le produit brut dans le volume de la boucle d’échantillon HPLC à l’aide d’un mélange de 0,1%TFA et un à un Acetonitrile à l’eau. Après vortex jusqu’à dissolution complète, centrifugez la solution à partir d’une minute à 3400 fois G.Dessinez le mélange de 3,6 millilitres dans une seringue de 5 millilitres et injectez l’échantillon sans bulles d’air dans la boucle d’injection. Démarrez l’injection dans le système HPLC.

Purifier le mélange de peptides à l’aide d’un gradient de zéro à 50%Eluent B pendant 120 minutes à un débit de 10 millilitres par minute. Recueillir les fractions dans les tubes individuels tels qu’ils apparaissent. Une fois la course terminée, préparez des fractions sélectionnées pour l’analyse MS et HPLC telle que décrite dans le texte.

Séchez toutes les fractions et conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Pour effectuer hplc analytique, transférer des échantillons des fractions peptidiques ou des contrôles de réaction dans un flacon HPLC et le dissoudre dans le mélange de 0,1%TFA dans un à un Acetonitrile à l’eau. Placez le flacon HPLC dans l’échantillonneur automatique de la phase inverse analytique HPLC réglée pour injecter 250 microlitres de chaque échantillon.

Utilisez un système d’élitution de gradient de 0,1% TFA dans l’eau comme Eluent A dans 0,1%TFA dans Acetonitrile comme un Eluent B.Analyser le peptide en utilisant un gradient de 10% à 40%Eluent B sur 30 minutes à un débit de 1,0 millilitre par minute. Pour effectuer l’analyse des acides aminés, transférer 100 microgrammes du peptide pur dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et dissoudre la poudre en 200 microlitres de six molaires HCL. Après avoir transféré la solution à un ampule de verre, fermez l’ampule en chauffant le cou à l’aide d’une flamme de brûleur bunsen.

Ensuite, placez un tube de verre tenant l’ampule dans un bloc chauffant pendant 24 heures à 110 degrés Celsius pour l’hydrolyse. Après 24 heures, ouvrez l’ampule et transférez la solution dans un tube de micro-centrifugeuse de deux millilitres. Centrifugeuse de la solution pendant six heures à soixante degrés Celsius et 210 fois G dans un concentrateur de vide rotationnel.

Puis dissoudre le produit hydrolysé dans 192 microlitres du tampon de dilution échantillonné et transférer la solution dans un filtre centrifuge micro. Après avoir centrifugé l’échantillon pendant une minute à 2300 fois G, transférer 100 microlitres du filtrate dans un tube d’analyse d’acides aminés. Placez le tube dans l’analyseur d’acides aminés et commencez l’analyse.

Au cours de ce protocole de réduction passé, il est crucial de prendre plusieurs contrôles de réaction afin d’obtenir deux ou quatre fois kappa mido espèces méthylés qui sont indispensables pour l’analyse ultérieure du disulfure par spectrométrie de masse. Dissoudre d’abord 600 microgrammes du peptide pur en 1,2 millilitres de tampon de citrate molaire de 0,05 molar contenant du TCEP. Incuber le mélange à température ambiante en prenant plusieurs échantillons de contrôle de réaction de 100 microlitres allant de zéro à 30 minutes.

Mélanger les échantillons dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre avec 300 microlitres de tampon d’alkylation pour arrêter la réaction et effectuer la méthylation carbonyle des groupes de thiol libre. Arrêtez la réaction après cinq minutes en ajoutant 100 microlitres de 10% de TFA et d’eau et stockez les échantillons sur de la glace sèche. Effectuez maintenant hplc sur les échantillons tels que détaillés dans le protocole de texte.

Transférer une petite quantité de chaque fraction recueillie dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre pour l’analyse de la SP/SP des formes oxydées. Dissoudre le peptide restant dans 0,1% TFA dans l’eau et ajouter un volume approprié sur une solution TCEP de 100 millimlaires pour obtenir une concentration finale de TCEP de 10 millimolaires. À ce stade, l’alkylation sélective de cystéine peut être vérifiée par le séquençage de peptide.

Avec les deux peptides au milieu, une détermination du modèle de pont de disulfide est possible. L’analyse de NMR des différents isomères est effectuée pour révéler les structures individuelles de peptide. Les 20 structures avec les énergies les plus basses ainsi que la connectivité disulfide des différents isomères sont montrées.

Notamment, une combinaison de fragmentation HPLC MS/MS de phase inversée et d’analyse NMR est nécessaire pour l’identification sans ambiguïté de la connectivité au disulfide. La comparaison de la valeur moyenne de déviation carrée de racine a clarifié qu’un peptide rigide mène la plupart du temps à une structure meilleure résolue de NMR. Cette vidéo devrait vous donner un exemple de la façon de synthétiser sélectivement les peptides avec un modèle de liaison de disulfide désiré.

Il montre également la possibilité de vérifier la connectivité de disulfide correcte par spectrométrie de masse tendre et d’obtenir une structure tridimensionnelle par spectroscopie NMR. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la synthèse peptidique pour explorer l’importance des modèles de liaison de disulfide pour la structure tridimensionnelle et, par conséquent, l’activité de ces isomères peptidique. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’activité ASAS peuvent être effectuées afin d’obtenir un aperçu des relations d’activité de structure des différents isomères peptidiques à la cible biologique spécifique.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la synthèse et de l’analyse des conotoxines, elle peut également être appliquée à d’autres peptides et protéines de pont de disulfide tels que les fenzens, les toxines animales riches en disulfide et d’autres molécules contenant la cystéine multiple.