Name: Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez l'analyse des complexes protéiques des thylakoïdes par électrophorèse sur gel natif bleu (BN-PAGE) et SDS-PAGE 2D chez Arabidopsis thaliana. Cette méthode révèle l'organisation et les interactions fonctionnelles des complexes photosynthétiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été financée par l’Académie de Finlande (numéros de projet 307335 et 303757) et l’énergie solaire dans la Convention de subvention de la biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Le protocole est basé sur la référence3.

1. préparer le BN Gel1,2,3
<ol><li>Mettre en place le lanceur de sorts de gel avec des plaques de 8 x 10 cm (verre rectangulaire et plaque d’alumine cranté) selon les instructions du fabricant à l’aide de cales d’espacement 0,75 mm.</li>
	<li>Placer une table de mixage dégradé sur une plaque de remuer et raccorder avec la pompe péristaltique par un tube. Attacher une aiguille de seringue à l’autre extrémité du tuyau et placez l’aiguille entre la plaque de verre et d’aluminium. Agitateur magnétique de place pour le « heavy » (H)-chambre.</li>
	<li>Préparer les 3,5 % (v/v) et 12,5 % (v/v) des solutions d’acrylamide (AA) dans des tubes à centrifuger coniques 15 mL pour le gradient de gel de séparation (voir la recette dans le tableau 1). Pour empêcher la polymérisation prématurée, garder les tubes à centrifuger sur glace tout en préparant les solutions. ATTENTION : L’Acrylamide est neurotoxique et cancérigène, portez des vêtements protecteurs et gants.</li>
	<li>Ajouter 5 % APS et TEMED droit avant de pipetage les solutions à la table de mixage dégradé. Pipette de la solution de 12,5 % à la chambre d’H.<ol>
<li>Enlever les bulles d’air du canal reliant la « lumière » (L) et H-chambre en ouvrant la vanne reliant les deux chambres permettant la solution entrer à la chambre de L. Fermer la vanne et la pipette que les traces de solution retour à H-chambre.</li>
		<li>Enfin, la solution de 3,5 % à la chambre de L pipette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Basculez sur l’agitateur magnétique (la vitesse de l’agitation n’est pas critique, mais il doit obtenir un bon mélange des solutions lourdes et légères), ouvrir les vannes et de mettre en marche la pompe péristaltique. Permettre les solutions gel de s’écouler entre la plaque de verre et l’aluminium, le débit devrait être à peu près 0,5 mL/min. L’aiguille doit être au-dessus du liquide tout le temps, il peut être attaché à la partie supérieure de la plaque de verre avec un ruban.</li>
	<li>Lorsque le H - et L-chambres sont vides, les remplir avec de l’eau ultrapure et laissez l’eau à superposer délicatement la surface du gel. La polymérisation du gel prend environ 1 à 2 heures à température ambiante.</li>
	<li>Préparer la solution à 3 % d’acrylamide (voir la recette dans le tableau 1) pour l’empilage de gel à RT. pipette le gel de concentration sur le dessus du gel de séparation polymérisé (avant de lancer le gel de concentration, retirez l’eau recouvrant la surface du gel) et placez un échantillon gel peigne entre les verre et l’aluminium plaque éviter bulles d’air.<ol>
<li>Laisser pour polymériser 30-60 min à RT. Remove le peigne doucement sous l’eau ultrapure. Stocker le gel à + 4 ° c. Point de pause. Le gel peut être conservé à + 4 ° c pendant quelques jours. Le gel doit être conservé dans des conditions humides pour éviter l’assèchement des puits et la surface du gel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. thylakoïdes solubilisation1,2,3
Remarque : Toutes les étapes devraient être effectuées sous très faible éclairage. Conserver les échantillons et les tampons sur la glace.
<ol><li>Diluer les thylakoïdes isolés avec tampon 25BTH20G glacée à une concentration de chlorophylle finale de 1 mg/mL. Pour l’analyse 2D-BN-SDS-PAGE à peu près 4-8 µg de chlorophylle / échantillon est approprié. Remarque : Les thylakoïdes utilisés dans les expériences doivent être isolés à partir des feuilles fraîches (pour protocole d’isolement de thylakoïdes, voir3)</li>
	<li>Ajouter un volume égal de détergent tampon, c'est-à-dire 2 % β-DM (p/v) ou 2 % digitonine (p/v). Mélanger le détergent à l’échantillon de thylakoïdes doucement avec le bout de la pipette et éviter de faire des bulles d’air. La concentration finale du détergent est de 1 % et celle des thylakoïdes 0,5 mg Chl/mL.<ol>
<li>Solubiliser les thylakoïdes pendant 2 min sur glace (β-DM) ou 10 minutes à RT avec un mélange doux continu sur un rocker/shaker (digitonine). Remarque : La digitonine et β-SM sont généralement utilisés pour la solubilisation des complexes protéiques thylakoïdes. Si autres détergents non ioniques sont utilisés, la concentration du détergent et l’heure de solubilisation doivent être tout d’abord optimisés. Habituellement la plage de concentration de détergent de 0,5 à 5 % (v/v). ATTENTION : La digitonine est toxique, portez des vêtements protecteurs et gants</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez le matériau insolubilized par centrifugation à 18 000 x g pendant 20 min, à + 4 ° c.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et ajouter 1/10 (v/v) de tampon de CBB à l’échantillon. Remarque : Quand on examine la composition globale des complexes de protéine membrane thylakoïde, déterminer le rendement et le domaine de thylakoïdes représenté de fraction solubilisée est recommandé. Pour déterminer le rendement du matériel solubilisé, prendre 5 µL de surnageant dans un nouveau tube (avant d’ajouter le CBB) et mesurer la teneur en Chl et Chl a / b ratio5.</li>
</ol>3. BN-PAGE1,2,3
<ol><li>Mettre en place le gel pour un système d’électrophorèse verticale (par exemple, 250 SE Hoefer). Remplir la chambre de mémoire tampon supérieure avec un tampon bleu cathode (voir tableau 1) et versez le tampon de l’anode à la chambre basse de la mémoire tampon.</li>
	<li>Charger l’échantillon de thylakoïdes (p. ex., 5 µg de chlorophylle) dans les puits.</li>
	<li>Commencez l’électrophorèse et augmentez graduellement la tension : 75 V pendant 30 min, 100 V pendant 30 min, 125 V pendant 30 min, 150 V pendant 1 h et 175 V jusqu'à ce que les complexes ont été complètement séparés. Exécutez le gel à + 4 ° c, soit à l’aide d’une chambre froide ou réglage de la température de gel avec un système de refroidissement. Remarque : Changer le tampon bleu cathode dans un buffer de cathode clair lorsque le front de l’échantillon a migré à environ un tiers du gel.</li>
	<li>Après la manche électrophorétique, scannez le gel avec un photoscanner pour l’archivage des images.</li>
</ol>4. 2D-SDS-PAGE
<ol><li>Assembler le système d’électrophorèse verticale (gel dimensions 16 cm x 20 cm). Utiliser des cales d’espacement 1 mm.</li>
	<li>Préparer standard gel SDS (12 % d’acrylamide, 6 M urée, voir recette dans le tableau 2) avec un peigne-2D (single grand bien pour la bande et un puits standard pour marqueur de poids moléculaire).</li>
	<li>Couper la voie de BN-gel et le placer dans un tube (5 mL). Ajouter 2 mL de tampon de Laemmli (contenant 5 % de β-mercaptoéthanol) et incuber la bande pendant 45 min avec agitant doucement à température ambiante.</li>
	<li>Placez la voie, avec l’aide de par ex., une entretoise, surface du gel en évitant les bulles d’air.</li>
	<li>Pipette 5 µL de marqueur de poids moléculaire sur une pièce de papier filtre et place le document à la norme bien étroite.</li>
	<li>Pour sceller la bande BN-gel et le papier de marqueur, verser 0,5 % d’agarose (dans la mémoire tampon en cours d’exécution) sur le dessus de la bande de gel et laisser pour solidifier.</li>
	<li>Effectuer l’électrophorèse conformément aux protocoles standards. Après exécution de l’électrophorèse, visualiser les protéines avec par exemple, tache Sypro Ruby ou coloration selon6à l’argent.</li>
</ol>

<ol><li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li>
<li>Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1005882406718">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li>
<li>Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes%3A+novel+super-+and+mega-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li>
<li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis%3A+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li>
<li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272889803470">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li>
<li>Aro, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+photosystem+II%3A+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li>
<li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+plant+journal+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li>
<li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pld3.39">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les machines de conversion d’énergie photosynthétique sont composé de complexes de grandes sous-unités protéiques, qui sont incorporées dans la membrane des thylakoïdes. Ce protocole décrit une méthode de base pour l’analyse des complexes de protéine thylakoïdes plante Arabidopsis thaliana avec BN-PAGE combiné avec 2D-SDS-PAGE. Le protocole est également adapté pour l’analyse des complexes protéiques thylakoïdes des thylakoïdes du tabac et les épinards, mais pourrait nécessiter des petits ajustements.
<p cla...

Grandes sous-unités protéiques complexes photosystème PSI et PSII, Cyt b6f et ATPase coordonnent la production de NADPH et d’ATP dans les réactions photosynthétiques de lumière. Dans les chloroplastes de plantes supérieures, les complexes sont situés dans la membrane des thylakoïdes, qui est une structure de membrane structurellement hétérogène, composée de grana accollées et non accolées stroma thylakoïdes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode largement utilisée dans l’analyse des grandes sous-unités protéiques complexes dans leur forme native et biologiquement active. La méthode a été établie pour la dissection de la membrane mitochondriale protéine complexes1, mais plus tard a été personnalisée pour la séparation des complexes protéiques de la membrane thylakoïde réseau3. La méthode est appropriée (i) pour la purification de complexes protéiques thylakoïdes individuels pour l’analyse structurale, (ii) pour determiner natives interactions complexes protéiques et (iii) l’analyse de l’ensemble de l’Organisation des complexes protéiques sur l’évolution des signaux environnementaux.
Avant la séparation, complexes protéiques sont isolées de la membrane avec des détergents non ioniques soigneusement choisis, qui sont généralement bénins et de préserver la structure native des complexes protéiques. Détergents contiennent hydrophobes et hydrophiles sites et micelles stable forme au-dessus d’une certaine concentration, appelée une concentration micellaire critique (CMC). Augmentation de la concentration de détergent au-dessus des résultats de CMC dans la perturbation des interactions lipides-lipides et la solubilisation des complexes protéiques. Le choix du détergent dépend la stabilité de la protéine complexe d’intérêt et les capacités de solubilisation du détergent. Les détergents utilisés couramment sont α/β-dodécyl-maltoside et digitonine. Suite à la solubilisation des complexes de protéines dans leur état natif, matériel insoluble est enlevé par centrifugation. Chez les plantes supérieures, la membrane thylakoïde est hautement hétérogènes dans la structure et certains détergents (p. ex., la digitonine) solubilisent sélectivement seulement une fraction spécifique de la membrane3. Par conséquent, afin de caractériser l’organisation complexe de la protéine ou les interactions entre les complexes de protéine, il est essentiel de toujours déterminer les capacités de solubilisation du détergent choisi par la détermination de la teneur en chlorophylle et la chlorophylle a/b ratio de surnageant pour évaluer le rendement et le domaine représenté thylakoïdes (void), respectivement, de la fraction solubilisée. Le ratio de la chlorophylle a/b dans les thylakoïdes intacts des plantes acclimatées croissance-lumière est généralement autour de 3, alors que la chl un / valeur b des thylakoïdes fractions enrichies en grana ou stroma thylakoïdes inférieure (~ 2,5) ou est supérieure à la valeur du total (~ 4,5) les thylakoïdes, respectivement.
Pour fournir une charge négative pour les complexes de protéine, colorant (CBB) bleu brillant de Coomassie est ajoutée à l’échantillon solubilisé. En raison de l’évolution de la charge, des complexes de protéines migrent vers l’anode et sont séparés sur un gradient d’acrylamide (AA) selon leur masse moléculaire et de la forme. La séparation efficace et à haute résolution est obtenue en utilisant un gradient de concentration d’acrylamide linéaire. Lors de l’électrophorèse, les complexes de protéines migrent vers l’anode jusqu'à ce qu’ils atteignent leur limite de taille de pore dépendant de la taille. Dépend de la taille des pores du gel de polyacrylamide (i) l’acrylamide total / concentration debis- acrylamide (T) et (ii) sur la réticulant bis- acrylamide monomère concentration (C) par rapport à des monomères total4. Après la séparation avec BN-PAGE, les complexes de protéine peuvent être subdivisés en leurs sous-unités de protéine individuelle par seconde dimension (2D) - SDS - PAGE. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’analyse des complexes de protéine de membrane de thylakoid de BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Acide 6-aminocaproïque (ACA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>BisTris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide (AA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td>Attention : Neurotoxique !</td></tr><tr><td>n-dodecyl-&beta ;-D-maltoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR</td><td>442444H</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>VWR</td><td>28877.292</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>J.T. Baker</td><td>7044</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de sodium (NaF)</td><td>J.T. Baker</td><td>3688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sel disodique</td><td>J.T. Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td>Attention :Toxique !</td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11585916001</td><td></td></tr><tr><td>Serva Coomassie Blue G</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoéthanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>APS (persulfate d’ammonium)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED (tétraméthyléthylènediamine)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>(N,N'-méthylène)-bis-acrylamide</td><td>Omnipur</td><td>2610</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher</td><td>G0800</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur protéique précoloré, large gamme (7-175 kDa)</td><td>New England Biolabs</td><td>P7708</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, tubes à centrifuger coniques 15 ml</td><td>Corning</td><td>352093</td><td></td></tr><tr><td>Roulette de gel double avec plaques de 10 x 8 cm</td><td>Hoefer</td><td>SE215</td><td></td></tr><tr><td>Gradient maker SG5</td><td>Hoefer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,75 mm Entretoises en T</td><td>Hoefer</td><td>SE2119T-2-.75</td><td></td></tr><tr><td>Peigne gel d’échantillons, 0,75 mm</td><td>Hoefer</td><td>SE211A-10-.75</td><td></td></tr><tr><td>Mighty Small SE250 Système d’électrophorèse verticale</td><td>Hoefer</td><td>SE250</td><td></td></tr><tr><td>Pompe IPC</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentation, PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5097</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Rocker-Shaker</td><td>Biosan</td><td>BS-010130-AAI</td><td></td></tr><tr><td> PROTEAN II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651813</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des complexes de protéine de membrane de thylakoid par électrophorèse sur gel natif bleu

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Chaîne de transfert d’électrons photosynthétiques (etc.) convertit l’énergie solaire en énergie chimique sous forme d’ATP et de NADPH. Quatre complexes de grandes protéines incorporées dans le thylakoïdes membrane récolte l’énergie solaire pour conduire des électrons de l’eau à NADP+ via deux photosystèmes, utilisez le gradient de protons créé pour la production d’ATP. Photosystème PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) et ATPase sont tous des complexes multiprotéiques avec orientation distincte et dynamique dans la membrane des thylakoïdes. On trouvera des informations précieuses sur la composition et les interactions entre les complexes de protéine dans la membrane des thylakoïdes par solubilisation des complexes de l’intégrité de la membrane par des détergents doux, suivies de la séparation par électrophorèse de gel natif du complexes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode d’analyse utilisée pour la séparation des complexes protéiques sous leur forme native et fonctionnelle. La méthode peut être utilisée pour la purification des protéines complexes pour l’analyse structurale plus détaillée, mais il fournit également un outil pour disséquer les interactions dynamiques entre les complexes de protéine. La méthode a été développée pour l’analyse des complexes de protéine respiratoire mitochondriale, mais depuis a été optimisée et améliorée pour la dissection des complexes protéine thylakoïdes. Ici, nous fournissons un protocole à jour détaillé pour l’analyse des complexes de protéine photosynthétique labile et leurs interactions chez Arabidopsis thaliana.

Un système représentatif de 2D-BN/SDS-PAGE à la Figure 1 illustre la séparation de la digitonine et complexes de protéine β-DM-solubilisée thylakoïdes et leur composition de sous-unité protéique détaillée. Le profil complexe protéique de thylakoïdes (gel horizontal en haut sur le dessus de la Figure 1 a) de la digitonine solubilisée contient la mégastructure PSII-LHCII-PSI, deux grandes supercomplexes de PSII-LHCII (sc), supercom...

Un protocole pour l’élucidation de l’usine de thylakoïdes organisation complexe de protéines et la composition avec bleu natif polyacrylamide gel électrophorèse (BN-PAGE) et 2D-SDS-PAGE est décrite. Le protocole est optimisé pour l' Arabidopsis thaliana, , mais peut être utilisé pour d’autres espèces de plantes avec des modifications mineures.

Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur la composition et l’organisation dynamique des complexes de protéines photosynthétiques dans la membrane thylakoid végétale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’analyse des interactions fonctionnelles entre les complexes protéiques indigènes et élucide la plasticité de l’organisation complexe protéique dans des conditions environnementales variables. Installez la roulette de gel de huit centimètres par plaques de 10 centimètres selon les instructions du fabricant à l’aide d’espaceurs de 0,75 millimètre.Placez un mélangeur dégradé sur une plaque à remuer et connectez-le à la pompe périssaltique par tube. Fixez une aiguille de seringue à l’autre extrémité du tube et placez l’aiguille entre le verre et la plaque d’aluminium. Placez un agitateur magnétique dans la chambre lourde.Préparez des solutions d’acrylamide à 3,5 % et 12,5 % dans des tubes de centrifugeuse conique de 15 millilitres, comme le détaile le protocole textuel à utiliser pour le gradient gel de séparation. Pour éviter une polymérisation prématurée, gardez les tubes de centrifugeuse sur la glace tout en préparant les solutions. Ajoutez 5% APS et TEMED juste avant de pippetting les solutions au mélangeur de gradient.Pipette les solutions de 12,5% à la chambre lourde. Retirez les bulles d’air du canal reliant la chambre légère et lourde en ouvrant la vanne reliant les deux chambres permettant à la solution d’entrer dans la chambre lumineuse. Fermez la vanne et pipette les traces de solution de retour à la chambre lourde.Enfin, pipette la solution de 3,5% à la chambre légère. Allumez l’agitateur magnétique. Ouvrez les vannes et allumez la pompe périssaltique.Laissez les solutions de gel circuler entre la plaque de verre et d’aluminium à un débit d’environ 0,5 millilitres par minute. L’aiguille doit être au-dessus du liquide en tout temps. Lorsque les chambres lourdes et légères se sont vidées, remplissez-les d’eau ultrapure.Et laisser l’eau superposer doucement la surface du gel. La polymérisation du gel prend environ une à deux heures à température ambiante. Préparer la solution d’acrylamide à 3 % pour le gel empilant à température ambiante.Pipette le gel d’empilage sur le gel de séparation polymérisé et placer un peigne gel échantillon entre le verre et la plaque d’aluminium en évitant les bulles d’air. Après avoir laissé le gel polymériser de 30 à 60 minutes à température ambiante, retirer délicatement le peigne sous de l’eau ultrapure. À ce stade, le gel peut être stocké à quatre degrés Celsius positifs dans des conditions humides pendant quelques jours.Diluer les thylakoids isolés avec un tampon glacé de 25BTH20G à une concentration finale de chlorophylle d’un milligramme par millilitre. Préparez deux tubes pour chaque échantillon de thylakoid pour effectuer la solubilization de bêta-DM et de digitonin. Maintenant, ajoutez un volume égal de tampon détergent.Mélanger délicatement le détergent et l’échantillon de thylakoid avec une pipette et éviter de faire des bulles d’air. Solubiliser les thylakoids pendant deux minutes sur la glace pour la solubilisation bêta-DM. Ou 10 minutes à température ambiante avec mélange doux continu sur un rocker ou shaker pour la solubilisation digitonine.Après l’incubation, enlever le matériau insolubilisé par centrifugation à 18 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius positifs. Transférez le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et ajoutez 1/10 volume de tampon bleu brillant Coomassie à l’échantillon. Installez le gel dans un système d’électrophoresis vertical.Remplissez la chambre tampon supérieure d’un tampon cathodique bleu et versez un tampon d’anode dans la chambre tampon inférieure. Chargez les échantillons de thylakoid dans les puits. Démarrez l’électrophorèse et augmentez progressivement la tension indiquée dans le protocole texte.Faire fonctionner le gel à quatre degrés Celsius positif, soit à l’aide d’une pièce froide, soit en ajustant la température du gel à l’aide d’un système de refroidissement. Modifiez le tampon cathodique bleu en tampon cathodique clair lorsque le front de l’échantillon a migré environ 1/3 du gel. Après la course électrophoretic, numérisez le gel à l’aide d’un scanner photo pour l’archivage d’images.Pour effectuer 2-SDS PAGE assembler le système d’électrophoresis vertical à l’aide d’espaceurs d’un millimètre. Préparez un gel SDS standard avec un peigne 2D tel que décrit dans le protocole texte. Couper la voie à partir du gel BN et la placer dans un tube de cinq millilitres.Ajouter ensuite deux millilitres de tampon Laemmli et incuber la bande pendant 45 minutes avec des secousses douces à température ambiante. Placez la voie à l’aide d’un espaceur sur le gel en évitant les bulles d’air. Pipette cinq microlitres de marqueur de poids moléculaire sur un morceau étroit de papier filtre et placer le papier dans le puits standard.Pour sceller la bande de gel BN et le papier marqueur verser un agarose de 0,5% en cours d’exécution tampon sur le dessus de la bande de gel et lui permettre de se solidifier. Effectuer l’électrophorèse selon les protocoles standard. Après la course électrophoretic visualiser les protéines avec supro ruby tache ou coloration d’argent.Les résultats représentatifs des modèles complexes de protéines thylakoid des échantillons bêta-DM et numérisés-solubilisés sont montrés ici. Les petits complexes migrent plus rapidement pendant la course électrophoretic et sont donc dans la partie inférieure du gel. Alors que les grands complexes sont dans la partie supérieure du gel.La digitonine préserve généralement les complexes protéiques dans les assemblages plus grands, tandis que le bêta DM interfère avec les interactions protéine-protéine labile entre les complexes. La composition sous-unique des complexes protéiques de bêta-DM et de thylakoids numérisés-solubilized sont présentés ici. Les sous-units de chaque complexe se trouvent à partir de la ligne verticale au-dessous du complexe aligné.En principe, chaque tache dans le gel 2D représente une protéine individuelle. Mais dans la pratique, plusieurs protéines de même masse moléculaire peuvent être présentes en un seul endroit. L’identification des taches est basée sur l’analyse de spectrométrie de masse.Après l’application de cette procédure, on peut continuer avec d’autres méthodes comme la microscopie électronique et l’analyse à particule unique des complexes protéiques épuutés du gel natif bleu afin d’obtenir des aperçus structurels dans les complexes protéiques. Pour identifier les sous-unités de protéines inconnues, les taches protéiques individuelles de la PAGE SDS bidimensionnelle peuvent être analysées à l’aide de spécifications de masse. N’oubliez pas que le travail avec l’acrylamide et la digitonine peut être extrêmement nocif et des précautions telles que le port de gants de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

analysis-thylakoid-membrane-protein-complexes-blue-native-gel

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Dans cette vidéo, nous décrivons la caractérisation de complexes multiprotéiques (PPM) en bleu électrophorèse en gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE). Dans une première dimension, dialysées lysats cellulaires sont séparés par BN-PAGE pour identifier les PPM individuelle. Dans une deuxième dimension SDS-PAGE, PPM d'intérêt sont subdivisées afin d'analyser leurs électeurs par immunoblot.

Bleu d&#39;électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) pour l&#39;analyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires

Dans cette vidéo, nous démontrons une technique électrophorétique, appelée PAGE native bleue, pour l’analyse des complexes protéiques respiratoires mitochondriaux dans leur état nativement replié et fonctionnellement actif. Le colorant anionique bleu de Coomassie provoque la charge négative des complexes protéiques, ce qui permet une séparation en fonction de la taille et de la structure.

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif bleu : une technique de séparation non dénaturante pour l’analyse de complexes de chaînes respiratoires mitochondriales intactes

L'approche décrite comparative, protéomique quantitative vise à obtenir un aperçu de la composition de complexes multiprotéiques dans des conditions différentes et est démontrée en comparant différentes souches génétiquement. Pour l'analyse quantitative des volumes égaux de fractions différentes d'un gradient de densité de saccharose sont mélangés et analysés par spectrométrie de masse.

Une nouvelle approche pour l&#39;analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N Marquage métabolique et spectrométrie de masse quantitative

Ce protocole décrit comment préparer et réaliser l’électrophorèse de piégeage de fraction liquide éluée de gel natif clair (CN-GELFrEE), une technique de séparation native pour les assemblages biomoléculaires non covalents et les protéines d’échantillons hétérogènes qui est compatible avec diverses techniques d’analyse de protéines en aval.

CN-GELFrEE - Clear natif Gel-élué Fraction liquide Entrapment Electrophoresis

La méthode de purification par affinité en tandem (TAP) a été largement utilisée pour isoler des complexes natifs à partir d’extraits cellulaires, principalement eucaryotes, pour la protéomique. Ici, nous présentons un protocole de méthode TAP optimisé pour la purification de complexes natifs pour des études structurales.

Purification de Native Complexes pour l&#39;étude structurale utilisant une méthode de Tag Tandem Affinity

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

Ce protocole décrit la séparation des complexes fonctionnels de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux (Cx) IV et des supercomplexes de ceux-ci en utilisant une électrophorèse native pour révéler des informations sur leur assemblage et leur structure. Le gel natif peut être soumis à un immunoblot, des essais en gel et une purification par électroélution pour caractériser davantage les complexes individuels.

Analyse des supercomplexes de la chaîne de transport d&#39;électrons mitochondriaux avec électrophorèse native, essais en gel et électroélution

Nous présentons des protocoles ci-après pour l’isolement de haut rendement de thylakoïdes physiologiquement actives et essais de transport de protéine pour la translocation de chloroplastes twin arginine (cpTat), sécrétoire (cpSec1) et particules (cpSRP) voies de reconnaissance des signaux.

Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie

Nous présentons ici un protocole visant à séparer les thylakoïdes solubilisée complexes par électrophorèse sur Gel natif de vert. Gel vert bandes sont caractérisés par la suite par temps en corrélation unique Photon Counting (TCSPC) et les étapes de base pour l’analyse de données sont fournis.

Séparation des épinards thylakoïdes Complexes des protéines par électrophorèse de Gel vert natif et caractérisation de bande en utilisant le comptage de Photon unique Time-Correlated

Ce protocole montre l’analyse des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale par électrophorèse sur gel de polyacrylamide native bleu. La méthode appliquée aux cellules humaines cultivées est décrit ici.

Analyse des Complexes de chaîne respiratoire mitochondriale dans les cellules humaines cultivées à l’aide de bleu sur Native de Gel de Polyacrylamide et Immunoblotting

Nous présentons ici un protocole pour extraire, résoudre et identifier les supercomplexes mitochondriaux qui minimisent l’exposition aux détergents et au bleu de Coomassie. Ce protocole offre un équilibre optimal entre la résolution et la préservation des activités enzymatiques, tout en minimisant le risque de perte des interactions protéine-protéine labiles.

Électrophorèse hybride Clear/Blue native pour la séparation et l’analyse des supercomplexes de la chaîne respiratoire mitochondriale

Découvrez l'analyse des complexes protéiques des thylakoïdes par électrophorèse sur gel natif bleu (BN-PAGE) et SDS-PAGE 2D chez Arabidopsis thaliana. Cette méthode révèle l'organisation et les interactions fonctionnelles des complexes photosynthétiques.

Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu

Explorer plus de vidéos