Name: Un modèle de souris Hyperandrogenic d’étudier le Syndrome des ovaires polykystiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Découvrez un modèle de souris hyperandrogénique pour étudier le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) en utilisant des implants de dihydrotestostérone. Cette méthode permet d'analyser les effets sur la santé reproductive des descendants.

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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (subventions R00-HD068130 à S.W.) et le centre de recherches de diabète Baltimore : pilotes et subvention de faisabilité (à S.W.).

Nous présentons ici des protocoles détaillés pour une insertion et préparation de boulette DHT et pour tester les reproducteurs et métaboliques. Les souris utilisées dans cette étude ont un fond mixte (C57/B6, CD1, 129Sv) et ont été maintenues avec de la nourriture et eau ad libitum dans un cycle lumière/obscurité de 14/10 h à 24 ° C dans l’animalerie de Broadway Research Building à la Johns Hopkins University School of Médecine. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de Johns Hopkins University animalier.
1. Créez le modèle murin de SOPK-like
<ol><li>
Préparation de boulette DHT
	<ol>
<li>Silastiques autoclave pour stériliser. Couper des tubes de silastic sur une longueur de 15 mm avec une lame de rasoir ;</li>
		<li>Sceller un côté par l’injection de silicone adhésif médical dans le tube avec une aiguille atténuée de 20 G, attachée à une seringue de 3 mL. Plongeur doit être retirée de la seringue, puis adhésif inséré dans le réservoir. Le piston est réinséré et adhésif poussé vers le bas jusqu'à ce qu’il commence à émerger de l’aiguille. L’aiguille mitigée faite par le côté pointu de l’aiguille de 20 G en coupant avec des ciseaux forts. La longueur du silicium dans le tube doit être supérieure à 2 mm permettant de postproduction rasage ;</li>
		<li>Sécher pendant la nuit ; Recherchez les bulles d’air sur le côté scellé. Ceux qui ont aucune bulle d’air sont utilisés pour pastilles de DHT. D’autres peuvent être utilisés pour les no-DHT contrôle pastilles.</li>
		<li>Porter des gants, masque, lunettes et blouse de laboratoire avant d’effectuer la DHT-pellet sous une hotte pour éviter l’exposition DHT à la peau.</li>
		<li>Poudre DHT de verser dans un plastique pèsent bateau et appuyez sur le côté ouvert de l’adhésif plafonné tubes (produits en A1.1) dans la poudre DHT.</li>
		<li>Poudre DHT peut être enfoncé avec un grand trombone qui se redresse.  Continuez jusqu'à ce que la DHT atteint une hauteur de 4 mm (ou la longueur désirée). Vérifiez la longueur de la DHT avec une règle et joint le côté ouvert avec le silicium, sécher toute la nuit.</li>
		<li>Couper chaque côté scellé pour rendre la longueur du silicium 2 mm de long. La longueur totale du pellet sera de 8 mm.</li>
		<li>Sceller les deux côtés du vide silastiques comme la pastille de contrôle (no-DHT).</li>
		<li>Garder les granulés dans un tube conique de 50 mL enveloppé d’aluminium (afin d’éviter l’exposition à la lumière) à température ambiante jusqu'à utilisation. Les granules DHT maintiennent pleine efficacité pendant au moins 3 mois de stockage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Remplacement et insertion de DHT
	<ol>
<li>Jusqu'à 20 DHT pellets ou granulés de contrôle sont submergées séparément dans un tube conique de 50 mL avec la solution saline 0,9 % stérile 30 mL pendant 24 h à 37 °C pour l’équilibration juste avant l’insertion.</li>
		<li>Avant l’opération, les surfaces et les gants sont désinfectés avec clidox et les surfaces de travail sont recouverts de plastique propre papier absorbant sauvegardé (bloc chirurgical).  Tous les instruments qui entrent en contact avec des animaux sont décontaminés avant d’entrer dans l’animalerie par autoclavage.  Instruments pourront sec et frais avant utilisation.</li>
		<li>les souris femelles de 2 mois sont utilisés (4 – 5 souris/cage). Souris sont injectés par voie intrapéritonéale Xylazine (3,5 mg/kg p.c.) et la kétamine (78,8 mg/kg p.c.) à l’aide d’une seringue à insuline. Calculs pour l’anesthésie de dosage et de mélange est dans le tableau 1.</li>
		<li>Après que anesthésie adéquat est atteint, telle que mesurée par la perte des réflexes de l’orteil et ralentit la respiration, la souris va être préparée pour la chirurgie.</li>
		<li>Désinfecter la peau de la zone avec la bétadine à l’aide d’une gaze stérile et nettoyer avec de l’éthanol à 70 %.  La zone sera encore une fois peint avec betadine.</li>
		<li>Découpez un trou d’environ 5 mm de longueur avec ciseaux sous la peau près du cou. À l’aide d’un trocart de 10 G, faites un petit tunnel (15 mm) à la direction rostrale. Le culot est inséré sur le dos avec le trocart.</li>
		<li>L’ouverture est ensuite scellée avec de la colle chirurgicale. La plaie manuellement approximative des arêtes avec forceps et douces traits brossage à appliquer une mince couche d’adhésif liquide sur les bords de la plaie par approximation. 3 l’accumulation des couches minces d’adhésif pour s’assurer que la colle est répartie uniformément sur la plaie. L’adhésif doit dépasser de 1 cm de chaque côté des bords de la plaie apposées. Suture ou agrafes chirurgicales peuvent également servir pour fermer le trou. Remettez souris en cage, logé individuel, avec une bouillote pour la récupération. Remplacer les granulés toutes les 4 semaines afin de maintenir un niveau constant de l’exposition aux androgènes. Le granule d’origine sera supprimé et nouveau pellet sera insérée comme décrit dans A1.15 dans la même position.</li>
		<li>Éstrale d’essai après 3 jours d’insertion de la DHT. Stade du cycle oestral est évaluée par la cytologie vaginale.  Cellules vaginales sont prélevés par l’aide d’une pipette de p10 à injecter une solution saline stérile (environ 10 µL) dans la cavité vaginale et ensuite retirer la solution saline avec la même pipette stérile 16 jours consécutifs.  Les cellules vaginales entraînées de la paroi vaginale mélangent avec du sérum physiologique et sont collectés.</li>
		<li>Étaler une solution saline avec cellules sur une lame marquée. Chaque diapositive peut contenir six échantillons. Diapositives sont étiquetés de manière à noter quel échantillon est placé dans chacune des six emplacements.</li>
		<li>Après la solution saline a complètement asséchée dans la diapositive, mettre des diapositives dans un récipient avec de l’éthanol 100 % pour fixer les cellules. Diapositives doivent être fixés pendant au moins 5 min, mais peuvent rester dans le fixateur indéfiniment jusqu'à ce que d’une utilisation ultérieure.</li>
		<li>Mettre les diapositives dans des solutions de coloration de 1 min chacun, pour le tampon B et diapositives C. Wash avec l’eau du robinet et sécher à température ambiante.</li>
		<li>Examiner la morphologie cellulaire sous un microscope optique objective de 10 X.  La morphologie des cellules à distinguer le pro-oestrus (P), oestrus (E), métoestrus (M) et dioestrus (D) est décrite dans références27,28,29.</li>
		<li>Compter les jours dans chaque étape et divisé par le nombre total de jours pour calculer le pourcentage de temps à chaque étape.</li>
		<li>Tester la tolérance au glucose à 21 jours après l’insertion de DHT par le jeûne des souris pendant la nuit (16 h) et injection intrapéritonéale de 2 g/kg de poids corporel de 20 % de dextrose. Par exemple, si une souris corps pèse 25 g, cette souris sera injectée avec 250 µL de dextrose de 20 % avec une seringue à insuline 50 cc (0,5 mL). Taux de glucose est évalués par bandes glucomètre et test de prélèvement d’échantillons de sang de la veine caudale à 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Ceci est décrit en détail ailleurs30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collecte de sang
	<ol>
<li>Prélever le sang à différents jours après l’insertion de DHT (nous limiter le volume de la collection de 100 µL de stéroïde et 30ul pour dosage de LH/FSH) entre le 9 et 10:00 par veine sous-maxillaire saignement avec lancette. Ceci est décrit dans le11.</li>
		<li>Centrifuger de sang à 6 000 x g à 4 ˚C pendant 10 min et recueillir la couche de sérum dans un autre tube de 1,5 mL qui peut être stocké à-80 °C jusqu'à l’analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. évaluer la reproduction profils de progéniture femelle de façon chronique de DHT inséré des barrages
<ol><li>
Accouplement
	<ol>
<li>La souris femelle à tester est déplacée dans la cage avec un mâle fertile éprouvée (qui a déjà eu des petits avec une souris femelle) 15 jours après insertion de pellet.</li>
		<li>Document du poids corporel du barrage chaque semaine afin de déterminer si la souris est enceinte. Barrage poids augmente de plus de 3 g en une semaine indique la grossesse.</li>
		<li>Recueillir le sang des barrages de la deuxième semaine après qu’on observe une augmentation de poids des barrages supérieure à 3 g à partir de la semaine précédente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Puberté évaluée par l’ouverture du vagin et premier oestrus
	<ol>
<li>Vérifier l’ouverture vaginale par une inspection visuelle tous les jours après que les petits sont sevrés à 21 jours après l’accouchement (PND), mesurer la distance ano-génitales et enregistrer l’âge d’ouverture du vagin.</li>
		<li>Une fois que le vagin s’ouvre, collecter tous les jours, cellules vaginales comme décrit dans 1.2.8–1.2.11 pour vérifier les Éstrale.</li>
		<li>Observer la morphologie cellulaire comme décrit 1.2.12, et le premier oestrus est défini comme la date que toutes les cellules sont des cellules épithéliales cornéocytaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Corps poids et oreille punch
	<ol>
<li>Trempez la pointe de la lancette dans la pâte de tatouage et marquer chaque chiot avec tatouage sur l’orteil comme décrit dans référence12 à 7 PND et pèsent souris tous les 7 jours jusqu'à 70 jours d’âge.</li>
		<li>Souris de coup de poing oreille dénombrer System.* en Figure 1 entre 12 à 16 PND. Pour distinguer le sexe, examiner la face ventrale du corps, les femmes auront mamelons visibles.</li>
		<li>Recueillir le sang à 21, 26, 70 PND après la naissance, comme décrit ci-dessus à l’alinéa 1.3.1</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dosage hormonal
	<ol>
<li>Les niveaux de DHT dans le sérum sanguin sont mesurés par les deux dosage immuno-enzymatique (ELISA) et par le tandem de chromatographie en phase liquide de la masse spectrométrie (LC-MS)23,24,31,32. T est mesuré par LC-MS, ou une rat/souris ELISA qui a été validée par l’Université de Virginie Ligand dosage Core dans le centre de recherche en Reproduction23,24.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+sex+steroids+in+murine+blood+and+reproductive+tissues+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).</li>
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</ol>

Rien à divulguer.

Hyperandrogénie est une caractéristique essentielle du SOPK. Les niveaux DHT de sérum (deux fois supérieur chez les souris de la DHT que chez les souris no-DHT) utilisés dans le présent protocole sont inférieurs à ceux rapportés par d’autres chercheurs dans des études antérieures et sont étalonnés pour imiter proportionnellement les femmes atteintes de SOPK5,19, 20,21. Contrairement aux autres...

Hyperandrogénie est la marque distinctive du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) selon des critères de NIH et de la société SOPK (AE-SOPK) et de l’excès d’androgènes. Les femmes atteintes de SOPK ont du mal à tomber enceinte et ont augmenté le risque de complications de grossesse1. Même si elles tombent enceintes, leur progéniture femelle aurait une santé résultats2,3. Des modèles animaux ont été développés en utilisant diverses stratégies4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 et présentant de nombreuses caractéristiques de PCOS (anovulation, et/ou intolérance au glucose et d’insuline) avec augmentent du poids corporel et de l’obésité lié avec la taille de l’adipocyte élargie et une augmentation du poids adipocytaire. Il y a deux grandes stratégies pour produire des modèles animaux qui servent à étudier le SOPK. L’un est un traitement avec des niveaux élevés d’androgènes directement (androgènes exogènes injection/insertion) ou indirectement (par exemple de bloquer la conversion des androgènes en œstrogènes avec inhibiteur de l’aromatase) après naissance13. Une autre est de hyperexposure fœtale des androgènes au cours de la gestation14,15 pour étudier la descendance. Par exemple, la progéniture femelle de singe rhésus16,17, mouton18et les rongeurs exposés à des niveaux masculins d’androgène au cours de la période intra-utérine développer des traits de SOPK-comme plus tard dans la vie. Ces modèles a considérablement accru notre compréhension des effets élevés d’androgènes et programmation fœtale et effets sur l’environnement utérins. Cependant, ces modèles ont leurs propres limitations : 1) les animaux développent l’obésité et il est donc difficile de séparer les effets de l’hyperandrogénie de l’obésité induite par la reproduction et dysfonctionnement métabolique ; 2) avant la grossesse, les femmes atteintes de SOPK présentent déjà des niveaux élevés d’androgène, donc des ovocytes ont été exposés aux androgènes excès avant la fécondation ; 3) aux doses pharmacologiques de testostérone (T) ou de la dihydrotestostérone (DHT) utilisé après la naissance ou pendant la gestation peuvent ne pas refléter l’environnement androgènes du SOPK. Testostérone et DHT ont été mesurées dans le liquide folliculaire ovarien et/ou de sérum et de testostérone et les niveaux DHT sont 1,5 à 3,9 fois plus élevée chez les femmes atteintes de SOPK5,19,20,21 ,22,23 , comparée aux femmes affectées. Nous avons créé une souris adulte modèle23,24,25 qui développe des dysfonctions métaboliques et reproduction dans les deux semaines de l’ouverture d’une exposition chronique de DHT d’insertion d’une pastille de 4 mm de longueur de poudre DHT de cristal (longueur totale du pellet est 8mm). Ce modèle produit sériques DHT qui sont environ 2 fois plus élevé (appelés 2xDHT) que celle des souris témoins sans traitement de DHT. Les souris 2xDHT ne présentent pas d’altérations de l’estradiol sérique basale, testostérone, LH et do ne pas développer l’obésité et indique similaire poids ovarienne, les taux sériques de cholestérol, acides gras libres, leptine, TNFα et IL-623,24, 25 relatif à contrôle même jusqu'à 3,5 mois après insertion de DHT23,24,25. En outre, en s’accouplant les femelles qui ont déjà développé des caractéristiques du SOPK, nous pouvons étudier l’impact d’un environnement maternel de hyperandrogenic sur la santé génésique et métabolique de la progéniture15.
Ce nouveau paradigme (pertinent pour les critères de NIH et de la société AE-SOPK) modèles de la maladie en produisant des niveaux relativement similaires d’androgènes à ceux des femmes avec SOPK 2 - à 3 fois plus élevé de testostérone ou DHT comparée aux femmes affectées. Cependant, ce modèle est maintenu par la DHT exogène continuelle et non d’hyperandrogénie endogène programmé une fois que la DHT est retirée. L’objectif général du présent article est de mettre l’accent sur la 1) Comment faire pour que le diabolo DHT ; 2) Comment générer un maigre-SOPK comme modèle de souris ; 3) stratégies pour évaluer la progéniture femelle de ces barrages. Autres mesures et évaluation des phénotypes ne sont pas abordées dans ce manuscrit, mais peuvent être trouvées en5,15,23,24,25,26.

<table><tbody><tr><td>Poudre cristalline 5&alpha ;-DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8380-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tube Silastic Dow Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15D</td><td>Diamètre intérieur 0,04 po/1 mm x 0,085 po/2,15 mm diamètre extérieur</td></tr><tr><td>Adhésif médical silicone</td><td>Facteur II, InC.</td><td>A-100</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection, blouses de laboratoire, gants et masques.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 et micro ; Pointes de pipette L sans filtre</td><td>USA Scientific</td><td>11113700</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope pour frottis</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Diff Quik pour coloration des cellules</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9979740</td><td></td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9416572</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Seringue</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD),</td><td>30985</td><td></td></tr><tr><td>aiguille attachée : 20 G</td><td>BD</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Règle : toute longueur supérieure à 10 cm avec échelle millimétrique.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise</td><td>NDC13985-704-10</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine</td><td>Hospira, Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Agrafe chirurgicale</td><td>AutoClip&reg ; Système, outil scientifique fin</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline</td><td>BD</td><td>329461</td><td>1/2 CC, faible dose Seringue à insuline U-100</td></tr><tr><td>Trocar</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss Primo Star</td><td>415500-0010-001</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Poinçon d’oreille</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-201</td><td></td></tr><tr><td>Testostérone rat/souris ELISA kit</td><td>IBL</td><td>B79174</td><td></td></tr><tr><td>DHT Kit ELISA</td><td>Alpha Diagnostic International</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-glucomètre à une touche</td><td>Life Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandes de test ultra à une touche</td><td>Life Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-18</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Clidox</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0089321</td><td></td></tr><tr><td>coussin chirurgical</td><td>Fisher Scientific</td><td>50587953</td><td>Fabricant : Andwin Scientific 56616018</td></tr><tr><td>Betadine Solution antiseptique</td><td>Walgreens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond (cyanoacrylate de n-butyle)</td><td>3M Science. Appliqué à la vie</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de souris hyperandrogenic d’étudier le syndrome des ovaires polykystiques

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogénie joue un rôle essentiel dans la fonction de reproduction et le métabolisme chez les femmes et est le signe distinctif du syndrome des ovaires polykystiques. Élaboration d’un modèle de souris de SOPK type maigre qui imite les femmes atteintes de SOPK est cliniquement significative. Dans ce protocole, nous décrivons un tel modèle. En insérant une longueur de 4 mm de pastille de poudre cristal DHT (dihydrotestostérone) (longueur totale de pellet est 8 mm), et remplacer tous les mois, nous sommes en mesure de produire un modèle de souris de SOPK type avec pli de niveaux 2 de DHT sérique plus élevé que les souris ne pas implantés avec DHT (no-DHT). Nous avons observé des dysfonctions métaboliques et reproduction sans changer le poids corporel et la composition corporelle. Bien que présentant un degré élevé de l’infertilité, un petit sous-ensemble de ces souris femelles de type SOPK peut tomber enceinte et leur progéniture montre la puberté retardée et une augmentation de testostérone en tant qu’adultes. Ce modèle de souris maigre SOPK-like est un outil utile pour étudier la physiopathologie du SOPK et la progéniture de ces barrages de SOPK-like.

Sérique de la DHT et test de tolérance au Glucose
Les niveaux de DHT sont mesurées de sérum prélevé par les deux ELISA et par LC-MS selon protocole 1,24 – 1,25 et 2.9, 3.0. Les valeurs absolues DHT sont différents entre la spectrométrie de masse et ELISA, cependant, le pli relative (environ 2 fois) de DHT vs insertion no-DHT est similaire de deux essais et à travers des expériences15,<sup class="x...

Les auteurs décrivent le développement d’un modèle de souris SOPK type maigre avec une boulette de dihydrotestostérone afin d’étudier la physiopathologie du SOPK et la progéniture de ces barrages de SOPK-like.

Un modèle de souris Hyperandrogenic d’étudier le Syndrome des ovaires polykystiques

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la reproduction. Et l’endocrinologie. Et sont applicables à l’étude du syndrome des ovaires polykystiques ou pcos et hyperandrogénie.L’avantage de cette technique est qu’elle facilite une libération cohérente, uniforme et à long terme des hormones d’une manière efficace coûteuse. JHUs traitant la procédure sera Ping Xue, un technicien de mon laboratoire. Pour la préparation de granulés de dihydrotestostérone ou de DHT, utilisez une lame de rasoir pour couper un morceau de tube de silicone de 15 millimètres.Et utilisez une seringue de trois millilitres équipée d’une aiguille émoussée de calibre 20 pour injecter du silicone adhésif médical de deux à cinq millimètres dans une extrémité du tube. Laisser sécher le tube toute la nuit. Et vérifiez s’il y a des bulles d’air à l’extrémité scellée.Le port de l’équipement de protection individuelle approprié verser la poudre DHT dans un bateau de chemin en plastique dans le flowhood. Impressionnez l’extrémité ouverte du tube plafonné adhésif dans la poudre. À l’aide d’un grand trombone redressé, remamez la poudre dans le tube, jusqu’à ce que la DHT atteigne la profondeur expérimentale appropriée.Ensuite, sceller le côté ouvert du tube avec du silicone pendant la nuit. Le lendemain matin, couper chaque côté scellé pour obtenir une longueur de deux millimètres de silicone des deux côtés de la DHT et pas de granulés de contrôle DHT. Conservez ensuite les granulés dans le tube conique de 50 millilitres enveloppé de papier d’aluminium à température ambiante jusqu’à trois mois.Pour la génération de modèles de souris PCOS, équilibrer jusqu’à 20 DHT ou contrôler les granulés dans des tubes coniques distincts de 50 millilitres contenant 30 millilitres de salin de 0,9 % pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, confirmer l’absence de réponse au pincement des orteils chez une souris femelle anesthésiée de deux mois et utiliser de la gaze stérile pour administrer l’iode séquentiel povidone et 70 pour cent de gommages d’éthynol à la zone chirurgicale. Ensuite, faire une incision de cinq millimètres à travers la peau près du cou.Et utilisez un trocar de dix jauges pour faire un tunnel de 15 millimètres dans la direction rostrale. Utilisez le trocart pour insérer une pastille dorsalement dans le tunnel et sceller l’incision avec l’adhésif chirurgical. Rapprochez manuellement les bords de la plaie avec des forceps et utilisez des coups de brossage doux pour appliquer trois couches minces de film d’adhésif liquide à un centimètre de chaque côté des bords de la plaie opposés.Placez ensuite la souris seule dans une cage sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce que la charge complète. Remplacement de la pastille toutes les quatre semaines pour maintenir un niveau constant d’exposition aux androgènes. Trois jours après l’insertion de granulés, utilisez une pipette p10 pour gicler dix microlitres de solution saline stérile dans la cavité vaginale et utiliser la pointe pipette pour récupérer immédiatement la solution saline.Étendre l’échantillon salin des cellules vaginales sur une lame étiquetée. Et laisser sécher la solution saline à température ambiante. Fixer les glissières séchées dans un contenant de 100 pour cent d’éthynol pendant au moins cinq minutes.Ensuite, tacher les diapositives pendant une minute chacune dans le tampon B et tampon C à partir d’un kit de coloration dif-rapide. À la fin de l’incubation tampon C, laver les glissières avec de l’eau du robinet pendant trois secondes et les sécher à température ambiante. Pour déterminer la cyclicité estrous voir les diapositives sous l’objectif dix fois d’un microscope léger.Comptez les jours dans chaque étape et divisez par le nombre total de jours pour calculer le temps de pourcentage à chaque étape. Pour tester la tolérance au glucose, 20 jours d’insertion DHT, jeûner les souris pendant la nuit. Pesez les souris le lendemain matin, et utilisez un glucomètre et des bandes d’essai pour mesurer le taux de glucose basilic du sang de veine de queue.Injecter aux souris deux grammes par kilogramme de poids corporel de 20 pour cent de dextrose. Mesurez ensuite le taux de glucose des échantillons de sang de veine de queue à 15, 30, 60, 90, 120 minutes après administration de dextrose. Pour acquérir la progéniture femelle des dames insérées de DHT, déplacez la souris femelle à l’essai dans la cage avec un mâle fertile prouvé au jour 15, suivant l’insertion de granulés.Documentez le poids corporel des dames chaque semaine pour déterminer si la souris est enceinte. Le septième jour postnatal, tremper une pointe de lancette dans la pâte de tatouage et marquer chaque chiot avec un tatouage sur l’orteil. Peser les souris marquées tous les sept jours jusqu’à l’âge de 70 jours.Entre la date postnatale 12 à 16, l’oreille poinçonner les souris pour les numéroter selon le système comme illustré dans la figure. Pour distinguer le sexe, examinez le côté ventral de chaque souris marquée. Les femelles auront des mamelons visibles.Pour recueillir des échantillons de sang pour diverses analyses en aval utiliser une lancette pour recueillir le volume expérimental approximatif de sang entre neuf et dix heures par saignement de veine submandibulaire. Et centrifuger les échantillons pour permettre la collecte du sérum. Rangez ensuite les échantillons de sérums dans des tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre à moins 80 degrés Celsius jusqu’à leur analyse.Pour évaluer la puberté chez la progéniture femelle DHT, tous les jours après le sevrage au jour post-natal 21, vérifiez l’ouverture vaginale par inspection visuelle. Et utiliser des calibres pour mesurer la distance ano-génitale. Bien que les valeurs absolues du sérum DHT soient différentes entre la spectrométrie de masse et l’analyse Elisa, le changement folklorique relatif de la DHT par rapport à l’insertion sans DHT est similaire à la fois des analyses et des expériences.Les niveaux de DHT sont sensiblement augmentés de la pré-conception par la grossesse dans les souris de DHT et aucune souris de DHT. Cependant, les niveaux de DHT sont deux fois plus élevés chez les souris DHT par rapport à aucune souris DHT à la fois aux points de temps pré-conceptionnel et gestationnel. Les filles adultes de DHT montrent des différences dans la fonction reproductrice.Par exemple, la cyclicité eestrous perturbée comparée à l’adulte aucune fille de DHT éprouvant des temps sensiblement plus longs dans metestrus diestrus et moins de temps dans pro-esterous et esterous. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’incuber les granulés pendant 24 heures avant qu’ils ne soient utilisés pour la libération uniforme de l’hormone. Après cette procédure, les conséquences reproductives et métaboliques de l’exposition au DHT peuvent également être examinées.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de l’endrochronologie et des interactions fœtales maternelles pour étudier le SOPK et l’impact de l’hyperandrogénie de bas niveau chez les souris femelles. N’oubliez pas que le travail avec DHT peut être extrêmement dangereux et les précautions telles que le port de gants et d’un masque et lunettes, et le travail dans une hotte de bio-sécurité, doit toujours être prise lors de l’exécution de cette procédure.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cet article décrit une façon de préparer et d’insérer des pastilles de dihydrotestostérone (DHT) pour modéliser le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez la souris. L’exemple de protocole illustre la procédure chez la souris utilisée pour les études de reproduction et métaboliques.

Traitement sous-cutané à la dihydrotestostérone (DHT) : modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK)

De nombreux modèles de rongeurs de l’endométriose sont limités par la complexité technique, la reproductibilité et/ou le besoin d’animaux immunodéprimés ou de souris rapporteures spéciales. Nous présentons un système simplifié d’induction des lésions en utilisant n’importe quelle souris expérimentale avec un système de notation objectif vérifiable indépendamment et sans exigence d’ovariectomie ou de chirurgie de survie.

Un modèle murin syngénique de l’endométriose utilisant des souris à cycle naturel

Cette étude décrit la mesure directe de la production hépatique de glucose dans un modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques en utilisant un traceur de glucose isotopique stable via la veine caudale à jeun et riche en glucose en tandem.

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L’hormone folliculo-stimulante (FSH) dans divers tissus et organes extragonadiques est associée à la pathogenèse de multiples maladies. Le modèle de souris ovariectomisé et traité à la FSH (OVF) peut être utilisé pour explorer les actions extragonadiques de la FSH.

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La meilleure approche de la validation expérimentale de l’activité de l’amplificateur est l’analyse de perte de fonction. Voici un protocole efficace qui utilise la délétion médiée par CRISPR/Cas9 pour étudier la régulation de la transcription des gènes spécifique de l’allèle dans les cellules ES F1 qui contiennent un génome hybride (Mus musculus129 x Mus castaneus).

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Analyse quantitative de l&#39;expression des protéines pour l&#39;étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d&#39;embryons

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