Name: Mesure d’oxygéne mitochondries du foie et la cinétique de fuite Proton pour estimer la Respiration mitochondriale chez les vaches laitières Holstein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Apprenez à mesurer la consommation d'oxygène mitochondriale et la cinétique de fuite de protons dans le foie de vaches laitières Holstein. Cette méthode directe évalue l'efficacité énergétique mitochondriale.

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Cette recherche a été financée par Alltech et USDA Hatch des fonds du centre santé animale de nourriture à UC Davis School of Veterinary Medicine.

Toutes les méthodes, protocole et études décrites ici ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Californie à Davis.
1. obtenir une biopsie du foie d’une vache laitière Holstein
Remarque : Une biopsie hépatique doit être effectuée par un vétérinaire agréé. Biopsies du foie peuvent être effectuées sur le site laitier où se trouvent les vaches. Vaches laitières en lactation peuvent continuer à être traite normalement et le lait ne doit pas être retiré de l’alimentation avant ou après la procédure. Il est recommandé qu’au moins 4 personnes sont nécessaires pour effectuer la biopsie du foie sur une vache laitière : un vétérinaire pour effectuer la biopsie, un dresseur pour s’établir à la hanche de la vache pour protéger la zone de biopsie et le vétérinaire, un technicien de laboratoire à l’extérieur de la plume de transf euh outils, de matériaux et de biopsie vers et depuis le vétérinaire de l’échantillon et maintiennent la zone propre, qui peut être à l’arrière d’un véhicule (Figure 1) et un technicien pour récupérer l’échantillon du foie et commencer l’isolation mitochondriale.
<ol><li>Un mois avant les biopsies du foie, donner des vaches une vaccination clostridia. Créer des packs chirurgicaux par serviettes chirurgicales autoclavage, instrument de biopsie, détenteurs de bistouri et matériel chirurgical.</li>
	<li>Un jour avant la biopsie hépatique, injecter la vache avec le Ceftiofur chlorhydrate 0,044 mL/kg de poids corporel par voie sous-cutanée dans le cou. Surveiller la température de vache, l’ingestion et fécales partitions à utiliser comme point de référence pour la fonction normale.</li>
	<li>Créer des mitochondries isolement multimédia (MIM) containining 220 mM de mannitol, saccharose de 70 mM, 20 mM HEPES, EDTA 1 mM et 0,1 % (p/v) d’acide gras libre BSA, pH 7,4 à 4 ° C. Il faudra environ 30 mL par exemple.</li>
	<li>Restreindre physiquement utilisant une prise de tête avec un licol selon les besoins de la vache (Figure 2). À l’aide de la corde, attacher sa tête sur le côté gauche de la colonnette. Si nécessaire, une contention chimique (Xylazine chlorhydrate 100 mg/mL IV à 0,010-0,015 mg/kg de poids corporel) peut être utilisé.</li>
	<li>La zone de la biopsie se trouve à la droite 10 - 11ème espace intercostal (Figure 3). Dessiner une ligne droite de la droite tuber coxae et aboutissant à la pointe de l’épaule droite. Le site de la biopsie est l’intersection de cette ligne avec l’espace intercostal 10-11. Stériliser le domaine de la vache pour être biopsiées en se rasant une zone carrée de 10 cm (Figure 4). Laver la zone avec 10 % providone scrub (Figure 5) en utilisant un mouvement circulaire. Zone de pulvérisation avec une solution d’éthanol à 70 % (Figure 6). Répétition des lavages providone et éthanol. Remarque : Le foie est dans une position légèrement différente chez les vaches laitières de Holstein par rapport aux bovins de boucherie.</li>
	<li>Injecter localement lidocaïne 2 % HCl (10 à 15 mL) à la zone d’anesthésie de la peau et sous-jacent de muscles et du tissu conjonctif (Figure 7). Répétez les providone et les lavages de l’éthanol 70 %. NOTE : Les terminaisons nerveuses sont dans la peau et le muscle, mais pas viscères, ainsi qu’un local anesthestic est nécessaire. Tout au plus, la vache doit seulement se sentir peu de pression et pas de douleur au cours de la procédure de biopsie.</li>
	<li>Faire une coup de poignard-incision de 1 à 2 cm à travers la peau de l’espace intercostal 10-11 (Figure 8). Passer un instrument de biopsie hépatique bovine Schackelford-Courtney à travers la peau et directe de l’instrument de biopsie dans un sens crânien léger tout en continuant à travers le diaphragme et le foie (Figure 9, Figure 10). Obtenir un échantillon de 1 g du foie et retirer l’instrument (Figure 11). Fermer la peau avec le placement de suture (Figure 12).</li>
	<li>Mettre l’échantillon du foie dans un tube à fond conique avec assez MIM pour couvrir l’échantillon, sur la glace pour l’isolement immédiat de mitochondries</li>
	<li>Cocher en cas de toute rougeur, gonflement, chaleur, ou la douleur dans les 24 heures de la biopsie et injecter la vache avec le Ceftiofur chlorhydrate 0,044 mL/kg de poids corporel par voie sous-cutanée dans le cou une fois par jour pour les 3 prochains jours (Figure 13). Surveiller la température de la vache, l’ingestion et scores fécales par jour pendant 1 semaine après une biopsie du foie. Si une fièvre apparaît, continuer les antibiotiques à la discrétion du vétérinaire. Remarque : Si une vache est présentant des signes de douleur, tels que les coups de pied dans le site d’incision, recumbancy, rougeur, chaleur ou réaction à toucher moins de 1 h après la biopsie du foie, une injection de IV 1 mg/kg de poids corporel de flunixine méglumine peut servir à soulager la douleur et l’inflammation. Une deuxième injection peut être administrée si nécessaire.</li>
	<li>Enlever les sutures 7 jours après la biopsie.</li>
</ol>2. isoler les mitochondries du foie de la vache laitière
<ol><li>Dès que possible après que l’échantillon du foie est prélevé à la vache, laver l’échantillon du foie en MIM (étape 1.3) pour enlever les globules rouges et émincer finement l’échantillon avec des ciseaux. Le foie doit être haché dans un bêcher réfrigéré contenant assez milieux d’isolement pour garder le tissu humide.</li>
	<li>Placez le foie haché dans un flacon en verre 30 mL avec un pilon de téflon de 0,16 mm dégagement incubés dans la glace et contenant du MIM (1:4 p/v).</li>
	<li>Homogénéiser l’échantillon du foie au pilon de téflon à 500 tr/min pour un min avec 4 coups/min. Remarque : L’homogénat de foie est conservée dans un bécher sous glace en MIM durant tout le processus et toutes les étapes de centrifugation suivantes soient terminées à 4 ° C</li>
	<li>Centrifuger l’homogénat à 500 x g pendant 10 min, jeter pellet, transférer le surnageant dans un tube à centrifuger réfrigérés et puis centrifuger le surnageant obtenu à 10 000 g pendant 10 min obtenir le culot mitochondrial.</li>
	<li>Resuspendre et laver le culot dans 10 mL de MIM avec les acides gras libres BSA et centrifuger à 8100 x g pendant 10 min. jetez surnageant.</li>
	<li>Resuspendre et laver le culot dans 10 mL de MIM sans acide gras libre BSA et centrifuger à 8100 x g pendant 10 min. jetez surnageant.</li>
	<li>Suspendre le culot dans 200 µL de milieux d’isolement et le placer sur la glace jusqu'à ce qu’utilisé pour la consommation d’oxygène et analyses cinétiques de fuite proton.</li>
	<li>Déterminer la concentration de la protéine de la suspension de pellet (dilution 1/100) utilise Bicinchoninic acide (BCA) ensemble selon le protocole du fabricant avec BSA comme la norme. Toutes les protéines est considérée comme une protéine mitochondriale.</li>
</ol>3. mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale (État 4 3 et de l’État)
<ol><li>Créer un support de consommation d’oxygène (OCM) de 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes et 1 mM EGTA, pH 7,4 à 30 ° C avec 0,3 % dégraissés BSA. Il faudra environ 3 mL par exemple. Aussi préparer une solution de 8 μg/mL oligomycine dans l’éthanol.</li>
	<li>Incuber les OCM à 30 ° C. Mis en place une électrode chambre, pompe et l’oxygène de la respiration selon les instructions du fabricant (système oxygraph). Le logiciel d’oxygraph devrait déjà être installé sur l’ordinateur.</li>
	<li>Placer 1 mL de l’OCM dans la chambre de respiration et remuez vigoureusement. Cela aidera à assurer que la solution devient saturée avec de l’air.</li>
	<li>Ajouter 0,35 mg de protéine des protéines mitochondriales à la chambre de respiration et de maintenir la température à 30 ° C.</li>
	<li>Enregistrer la consommation d’oxygène pendant environ 5 min. La concentration en oxygène oxygraph système dossiers alors que la respiration augmente, la concentration en oxygène diminue. Lorsque la consommation d’oxygène devient constante (une ligne droite décroissante), consommation d’oxygène record (pente de la droite = concentration d’oxygène/heure). Il s’agit de la consommation d’oxygène de base.</li>
	<li>Ajouter 1,25 µL de solution de roténone 4 mM pour inhiber complexe je puis ajouter 5 µL de solution de succinate de 1 M pour atteindre une concentration finale dans la chambre respiratoire du succinate de 5 mM. Il s’agit de la respiration État 4.</li>
	<li>Ajouter 1 µL de solution ADP 100 mM pour atteindre une concentration finale dans la chambre de respiration de 100 μM. Concentration d’oxygène va diminuer (une augmentation de la respiration), puis après environ 5 min devient une ligne droite. Enregistrer la consommation d’oxygène (pente de la droite = concentration d’oxygène/heure). Il s’agit d’État 3 la respiration.</li>
	<li>En option : À la fin de l’exécution, ajoutez FCCP (volume total de 0,2 μM) pour induire la respiration maximale. Enregistrer la respiration pendant environ 5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne. Il s’agit de la consommation maximale d’oxygène.</li>
	<li>Calculer le Ratio de contrôle respiratoire (RCR) à l’aide de l’équation de consommation d’oxygène État 3 / 4 la consommation d’oxygène d’État.</li>
	<li>Aspirer toutes les solutions de la chambre de respiration. Rincer la chambre plusieurs fois avec de l’eau désionisée double.</li>
</ol>4. mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial (MMP) et Force motrice de Proton (PMF)
<ol><li>Préparer la solution de 80 nigéricine ng/mL dans de l’éthanol. Remarque : Ces substances chimiques sont dissous dans l’éthanol, et tout doit être fait pour limiter la quantité d’éthanol qui est ajouté au moins 1 μL, étant donné que l’éthanol peut dételer le système de transport d’électrons et risquez d’être mitchondrial.</li>
	<li>Après rincer abondamment la chambre avec de l’eau désionisée double, placer 1 mL de l’OCM dans la chambre de respiration et remuer vigoureusement avec une barre magnétique remuer. Cela aidera à assurer que la solution devient saturée avec de l’air. Ajouter méthyl-triphényl-phosphonium (PGEF +) sensible électrode pour le programme d’installation de la chambre. PGEF + électrode doit être raccordé à un pH-mètre et valeurs sont lues à partir du pH-mètre.</li>
	<li>Ajouter 0,35 mg de protéines mitochondriales à la chambre de respiration.</li>
	<li>Ajouter 1,25 ml de solution de roténone 4 mM pour inhiber la respiration complexe I. dossier pendant 2-5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne.</li>
	<li>Ajouter 0.56 μL de 8 μg/mL de solution de l’oligomycine pour une concentration finale de 2,8 µg oligomycine 0,35 mg de protéine mitochondriale pour inhiber l’utilisation de l’ADP. Enregistrer la respiration pendant 2-5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne.</li>
	<li>Ajouter 0,112 μL 80 ng/mL de solution de nigéricine pour abolir le gradient de pH à travers la membrane mitochondriale interne. Enregistrer la respiration pendant 2-5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne. Remarque : La roténone et l’oligomycine servent à bloquer le transport des électrons chain au complexe I et l ' ATP synthase, respectivement. Nigéricine est ajouté pour convertir un gradient de K + qui peut être mesuré avec une électrode de gradient transmembranaire de H +.</li>
	<li>Préparer une courbe d’étalonnage pour PGEF + en ajoutant 5 µL de solution PGEF + 10 mM à l’incubation mitochondriale. Répétez cette opération quatre fois plus, jusqu'à ce qu’une concentration totale de 2,5 μM PGEF + a été ajoutée.</li>
	<li>Initier la respiration en ajoutant 5 μL de succinate de 1M à la chambre.</li>
	<li>Enregistrer la respiration jusqu'à ce que vous avez réalisé une trace stable, et puis titrer le système en ajoutant le malonate. Ajouts de malonate devraient être 0,5 µL, 1 µL, 1,5 µL, 3,0 µL, µL 6.0, 9.0 µL, puis 12,5 µL de 0,1 mM Malonate solution pour réaliser des ajouts successifs des concentrations de malonate dans la chambre d’incubation de 0,1, 0,2, 0,3, 0,6, 1,2, 1,8 et 2,5 mM.</li>
	<li>Collecter les données des deux électrodes (oxygène et PGEF+). Logiciel d’acquisition de données provenant du système d’oxygraph permet de collecter des mesures simultanées de la consommation d’oxygène mitochondriale et le potentiel de membrane mitochondrial et observer les changements dans la consommation d’oxygène en temps réel. La figure 14 montre comment le système d’oxygraph enregistre la consommation d’oxygène en cours de l’expérience.</li>
	<li>Calculer les MMP dans mV basé sur l’équation de Nernst : MMP = 61,5 log ([PGEF +] ajouté – externe [PGEF +]) correction de liaison x TPMP+ / (x 0,001 mg de protéine/mL x [PGEF +]) Une correction de liaison PGEF + 0,4 µL/mg de protéine mitochondriale-1 est utilisée. Exemple de calcul basé sur les concentrations dans le protocole : MMP = 61,5 x log (5 µM – 2 µM) x 0,4 / (0,001 x 0,35 mg protéine mitochondriale/mL x 2 µM) MMP = 198,9 mV</li>
	<li>Estimation PMF en traçant un graphique des MMP contre la consommation d’oxygène (Figure 15). CMR est signalée comme la consommation d’oxygène à un potentiel de membrane de 165 mV. NOTE : Titrage de la chaîne de transport d’électrons avec le malonate (0,1 à 2,5 mM) montre la réaction cinétique de fuite de protons de MMP. Alors, complot MMP contre la consommation d’oxygène détermine cinétique de fuite de protons. CMR est déterminée en calculant la consommation d’oxygène à un potentiel de membrane commune (165 mV).</li>
	<li>À la fin de la dernière exécution de l’exemple, ajouter FCCP (volume total de 0,2 μM) pour induire la respiration maximale et libérer PGEF + pour la correction de la ligne de base.</li>
	<li>Aspirer toutes les solutions de la chambre de respiration. Rincer la chambre plusieurs fois avec de l’eau désionisée double. À la fin de la journée, la chambre devrait également être rincée plusieurs fois avec de l’éthanol.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le point le plus critique dans le protocole est obtenir un échantillon représentatif de tissu hépatique et commence l’isolation des mitochondries dès que possible après la biopsie. Variations dans les mesures de la respiration sont faible (tableau 1) en raison d’un temps de transport court de vache au laboratoire. Afin de réduire les temps de transport, un petit laboratoire a été mis en place dans le Bureau de la laiterie, et échantillons de foie ont été chassés au laboratoire du bureau comme chacun ont ...

Les mitochondries sont très sensibles au stress et leur environnement cellulaire peut contribuer à une grande variété de maladies métaboliques. Consommation d’oxygène et la fuite de protons dans les mitochondries sont des indicateurs de santé de mitochondries. Les méthodes décrites dans ce document estimation mitochondrial l’efficacité énergétique à l’aide de RCR basent sur la consommation d’oxygène avec et sans fuite de protons. Ces résultats peuvent représentent 30 % de l’énergie perdue dans l’utilisation des éléments nutritifs1. Changements dans la fuite de proton et de la consommation d’oxygène peuvent identifier un dysfonctionnement mitochondrial qui contribue aux maladies métaboliques et se traduit par une diminution de l’efficacité énergétique. Ces méthodes peuvent également être utilisées pour étudier l’effet des différents traitements sur la respiration mitochondriale. L’objectif général de mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale et la cinétique de fuite de proton est d’évaluer la fonction mitochondriale et efficacité énergétique.
Dysfonctionnement mitochondrial hépatique a été associé à plusieurs maladies chez les vaches laitières. La capacité du métabolisme cellulaire pour basculer entre les carburants glucidiques et lipidiques, face à un déficit énergétique en début de lactation est influencée par le nombre et la fonction des mitochondries dans la cellule2. Défauts de la capacité des mitochondries pour s’adapter à une demande accrue d’énergie et de la β-oxydation accrue peuvent entraîner une accumulation de lipides intracellulaires associés à l’insulino-résistance et peuvent conduire à la formation de foie gras chez les vaches laitières de lactation précoce. Mitochondries, comme le site de production de corps cétoniques et utilisation, peuvent jouer un rôle clé dans le ketosis chez les vaches laitières3. Absence de mitochondries ou dysfonctionnement mitochondrial aura une incidence combustibles disponibles vers la périphérie et se reflétée des changements dans la consommation d’oxygène ou RCR.
Changements de consommation d’oxygène mitochondriale en réponse à l’inflammation. Poulets de chair âgés de sept jours ont été assignés au hasard à un groupe infecté par Eimeria maxima et un groupe de contrôle4. Poulets de chair qui ne subissent pas de défi de coccidiose avaient faible consommation d’oxygène due à la fuite de protons et RCR supérieur indiquant que les mitochondries du foie répondent à une stimulation immunitaire par fuite de protons croissante. Tout en fuite de protons et réactive production d’espèces oxygénées était autrefois considéré comme un signe de dysfonctionnement de la membrane mitochondriale et préjudiciable à l’efficacité énergétique, maintenant on sait qu’il est important pour l’importation de protéines et de calcium dans les mitochondries5 et pour la génération de chaleur1.
Fuite d’électrons de la chaine respiratoire rend les mitochondries sensibles à la production d’espèces réactives de l’oxygène et les dommages oxydatifs aux protéines de la membrane mitochondriale, lipides et l’ADN mitochondrial. Comme l’âge des mitochondries, des dommages peuvent s’accumuler en particulier d’ADNmt occasionne un autre dysfonctionnement du métabolisme mitochondrial6 et une plus grande susceptibilité de la vache à la maladie. Dans la pratique, de nombreux animaux d’élevage est nourris des niveaux élevés de suppléments tels que Cu, Zn et Mn pour stimuler la fonction antioxydante. Toutefois, nourrir des niveaux élevés de Cu, Zn et Mn diminue la production de lait et a augmenté la consommation d’oxygène due à proton fuite (respiration État 4)7.
Des recherches antérieures sur le rôle de la fonction mitochondriale dans l’efficacité énergétique chez les bovins a mis l’accent sur les changements dans la consommation d’oxygène mitochondriale et fuite de protons. Très peu d’études ont été publiées chez les vaches laitières et la plupart des papiers comparer l’efficacité de production sous la forme d’ingestion d’aliments résiduelle (DDR) à la fonction mitochondriale chez les bovins de boucherie. Variabilité de la respiration mitochondriale, les taux ont été examinés en mesurant l’État 3, 4 et RCR dans le foie des vaches Holstein en lactation et lactation boeuf vaches (Brangus, Angus et Hereford)8. Les chercheurs n’a pas trouvé aucune corrélation dans la respiration mitochondriale avec croissance ou traite des traits pour les bovins, mais n’a signalé une corrélation entre la respiration mitochondriale et traite des traits pour Holsteins. Dans deux études, RFI a été comparée en bovins de boucherie au taux de respiration mitochondriale (État 3, État 4 et RCR) dans le muscle mitochondries9,10. Les taux de la respiration mitochondriale ont changé en réaction à la DMI et faibles taux étaient associés à bouvillons de boeuf moins efficaces. Dans une autre étude, RFI de boeufs de hautes ou basses bulls RFI ont été comparés avec des taux de la respiration mitochondriale et la cinétique de fuite de protons entre les deux groupes de descendants11. Différences étaient attribuables à gain en confirmant la conclusion que le gain n'est pas impact la respiration mitochondriale en bovins de boucherie.
Dans cet article, une expérience examinant foie RCR en réponse à l’alimentation des bovins laitiers en lactation 3 minéraux antioxydants illustre l’utilisation de méthodes de mesure de consommation d’oxygène pendant 4 d’État et état 3 la respiration et au CMR.

<table><tbody><tr><td>Liver Biopsie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schackelford-Courtney instrument de biopsie du foie bovin</td><td>Sontec Instruments Englewood CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de suture</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Inclus avec</td></tr><tr><td>Scalpels à</td> suture <td>Sigma - Aldrich</td><td>S2896 / S2646</td><td># pour poignée et lames</td></tr><tr><td>Serviettes de chirurgie</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>Seringues de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles d’injection (22, 2 1/2)</td><td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>Licol de vache</td><td>Tractor Supply Co.</td><td></td><td></td>101966599</tr><tr><td>Coton-tige</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>carrés de gaze de coton (4x4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux médicaux</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coccidiosis Vaccin 0,75 bouteille/vache</td><td></td><td></td><td>Fourni par </td></tr><tr><td>Vétérinaire Vaccin</td><td></td><td></td> contre les clostridia <td>Fourni par le vétérinaire</td></tr><tr><td>Biopsie hépatique antibiotiques excenel 2 cc/100 lbs pendant 3 jours</td><td></td><td></td><td>Fourni par le vétérinaire</td></tr><tr><td>Providone Scrub</td><td>Aspen Ressources vétérinaires</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 70 %</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de xylazine 100 mg/mL IV à 0,010-0,015 mg/kg poids</td><td></td><td></td> corporel <td>Fourni par le vétérinaire</td></tr><tr><td>2 % de lidocaïne HCl (10-15 mL)</td><td></td><td></td><td>Fourni par le vétérinaire</td></tr><tr><td>1 mg/kg injection IV de flunixine méglumine</td><td></td><td></td><td>Fourni par le vétérinaire</td></tr><tr><td><fort>Isolement des mitochondries (foie)</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>équipement</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacon Wheaton 30 mL avec pilon en téflon de 0,16 mm d’espace</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur à moteur</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonde d’homogénéisation</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipette automatique (10 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>Bécher (500 mL) avec glace</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge réfrigéré</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microfuges (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) kit de dosage des protéines (microplaques pour lecteur de plaques)</td><td>abcam</td><td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>BSA (sans acides gras)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Eau déminéralisée</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>À utiliser pour créer des milieux d’isolement des mitochondries : 220 mM de mannitol, 70 mM de saccharose, 20 mM d’HEPES, 20 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EDTA et 0,1 % (p/v) de BSA sans acides gras, pH 7,4 à 4 &deg ; C, durera 2 jours dans le réfrigérateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Accumulation d’oxygène mitochondrial</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Équipement</fort></td>Configuration de l’oxygraphe <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>+ électrode d’oxygène de type Clark</td><td>Hansatech (PP Systems)</td>Pompe à eau thermorégulée <td>OXY1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ADInstruments</td><td>MLE2001</td><td></td></tr><tr><td>Électrode d’oxygène de type Clark</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Autopipette (1 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-70</td><td>Inclus avec Oxy1</td></tr><tr><td>Petite barre d’agitation magnétique</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette (10 &mu ; L)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>Utiliser pour la fabrication de milieux de consommation d’oxygène mitochondrial : 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes et 1 mM EGTA, pH 7,4 à 30 &deg ; C avec BSA</td><td></td><td></td><td></td>roténone dégraissée à 0,3 %</tr><tr><td>(solution de 4 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>Succinate (solution de 1 M)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP (solution de 100 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycine (solution de 8 &mu ; g/mL dans de l’éthanol)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Potentiel de membrane mitochondriale et force motrice des protons</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPMP electrode</td><td>World Precision Instruments.</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td>Les solutions chimiques n’ont pas besoin d’être fraîches, mais elles doivent être conservées dans un congélateur entre les cycles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malonate (solution 0,1 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycine (8 &mu ; g/mL dans de l’éthanol), conserver au congélateur</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin (80 ng/mL dans de l’éthanol), conserver au congélateur</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C3920</td><td></td></tr><tr><td>TPMP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T200</td><td></td></tr><tr><td>Solution TPMP : 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes et 1 mM EGTA, &nbsp ; pH 7,4 à 30 &deg ; C avec 0,3 % de BSA</td><td></td><td></td><td></td> dégraissé</tr></tbody></table>

mesure d’oxygéne mitochondries du foie et la cinétique de fuite proton pour estimer la respiration mitochondriale chez les vaches laitières holstein

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

La consommation d’oxygène, motif de proton force (CMR) et fuite de protons sont les mensurations de la respiration mitochondriale, ou comment bien les mitochondries sont en mesure de convertir NADH et FADH en ATP. Étant donné que les mitochondries sont également le principal site pour l’utilisation de l’oxygène et de nutriments oxydation de dioxyde de carbone et l’eau, l’efficacité avec laquelle ils utilisent de l’oxygène et produisent de l’ATP directement a trait à l’efficacité du métabolisme des nutriments, les besoins nutritionnels de l’animal, et santé de l’animal. Le but de cette méthode consiste à examiner la respiration mitochondriale, qui peut être utilisée pour examiner les effets des différents médicaments, régimes alimentaires et effets sur le métabolisme mitochondrial. Les résultats comprennent la consommation d’oxygène mesurée en respiration dépendante de proton (État 3) et la respiration de dépendant de fuite de proton (État 4). Le ratio de la respiration État 4 3 / Etat est défini comme rapport de contrôle respiratoire (RCR) et peut représenter efficacité énergétique mitochondriale. Fuite de protons mitochondriale est un procédé qui permet la dissipation du potentiel de membrane mitochondrial (MMP) par découplage de la phosphorylation oxydative d’ADP, diminution de l’efficacité de la synthèse d’ATP. Oxygène et TRMP + électrodes sensibles avec mitochondriales substrats et inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons sont utilisés pour mesurer l’État 3 et 4 de l’état respiratoire, membrane mitochondriale PMF (ou susceptibles de produire de l’ATP) et fuite de protons. Limitations de cette méthode sont que le tissu hépatique doit être aussi fraîche que possible et toutes les biopsies et les essais doivent être effectuées en moins de 10 h. Cela limite le nombre d’échantillons qui peuvent être collectées et traitées par une seule personne par jour à environ 5. Cependant, seulement 1 g de tissu hépatique est nécessaire, donc dans les grands animaux, tels que les vaches laitières, la quantité d’échantillon nécessaire est faible par rapport à la taille du foie et il y a peu temps de récupération nécessaire.

Résultats positifs cinétique de fuite RCR et proton sont indiquées dans le tableau 1 et Figure 15, respectivement. Dans cette fuite de protéines, RCR et7étude cinétique ont été mesurés chez les vaches laitières Holstein à 70 jours dans le lait après les vaches avaient été nourries avec 1 de 5 différents niveaux de Cu, Zn et Mn pendant 28 jours. État 4, respiration de proton maximale de fuite-dépendante, avait tendance ...

Ici, nous partageons des méthodes pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale, un concept définissant d’Energétique nutritionnelle et fuite de protons, la principale cause d’inefficacité dans la production mitochondriale de l’ATP. Ces résultats peuvent représentent 30 % de l’énergie perdue dans l’utilisation des nutriments pour aider à évaluer la fonction mitochondriale.

Mesure d’oxygéne mitochondries du foie et la cinétique de fuite Proton pour estimer la Respiration mitochondriale chez les vaches laitières Holstein

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’énergie, telles que la santé mitochondriale, l’efficacité énergétique et la consommation d’énergie. Le principal avantage de cette technique est que la consommation d’oxygène des mitochondries isolées est mesurée directement. Les résultats n’ont pas besoin d’être corrigés pour d’autres processus métaboliques intracellulaires.Nous avons d’abord décidé de poursuivre cette méthode chez les bovins laitiers lorsque nous voulions examiner comment l’efficacité mitochondriale influe sur l’efficacité des aliments pour animaux. La démonstration vidéo de cette méthode est critique car les étapes de l’isolement mitochondrial sont difficiles à apprendre parce qu’elles doivent être cohérentes et précises. Dès que possible après que l’échantillon de foie est retiré de la vache laver l’échantillon dans les mitochondries corps d’isolement pour enlever les globules rouges.À l’aide de ciseaux finement émincer le tissu dans un bécher réfrigéré qui contient suffisamment de supports d’isolement pour garder le tissu humide. Transférer le foie haché dans un flacon de verre de 30 millilitres contenant des mitochondries. Ajouter un pilon de téflon qui a un dégagement de 0,16 millimètre et qui a été incubé dans la glace et homogénéiser l’échantillon de foie à 500 RPM pendant une minute avec quatre coups par minute.Après cela, transférez l’homogénéate dans un tube contenant des mitochondries et placez-le dans un bécher rempli de glace. Centrifugeuse homogénéiser à 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jeter la pastille et transférer le supernatant dans un tube de centrifugeuse réfrigéré.Centrifugeuse le supernatant résultant à 10 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour obtenir la pastille mitochondriale. Resuspendez et lavez la pastille en 10 millilitres de mitochondries avec bsa sans acides gras. Puis centrifugeuse à 8, 100 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Jetez le supernatant et réutilisez la pastille dans 200 microlitres de supports d’isolement. Placez-le sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi pour la consommation d’oxygène et les analyses cinétiques de fuite de protons. Déterminer la concentration en protéines de la suspension à granulés à l’aide d’un kit d’acide bicinchoninique selon les instructions du fabricant en utilisant BSA comme norme.Tout d’abord, créer des supports de consommation d’oxygène tels que décrits dans le protocole de texte. Incuber le média de consommation d’oxygène à 30 degrés Celsius. Ensuite, installez la chambre de respiration, la pompe et l’électrode d’oxygène pour le système oxygraphique selon les instructions du fabricant.Placez ensuite un millilitre de liquide de consommation d’oxygène dans la chambre respiratoire. Ajouter ensuite 0,35 milligramme de protéine mitochondriale à la chambre. Remuer vigoureusement pour s’assurer que la solution devient saturée d’air et maintenir une température de 30 degrés Celsius.Enregistrez la consommation d’oxygène pendant environ cinq minutes. Lorsque la consommation d’oxygène devient constante représentée par une ligne droite décroissante, enregistrez ceci comme consommation d’oxygène de base. Ajouter 1,25 microlitres d’une solution de rotenone de quatre millimolaires pour inhiber le complexe, puis ajouter cinq microlitres d’une solution de succinate molaire pour atteindre une concentration finale de cinq millimolaires succinate dans la chambre respiratoire.C’est la consommation d’oxygène de l’état IV. Après cela, ajouter un microlitre d’une solution ADP de 100 millimlaires pour atteindre une concentration finale de 100 micromolaires dans la chambre de respiration. La consommation d’oxygène diminuera pendant environ cinq minutes, puis deviendra une ligne droite.Enregistrez cette consommation d’oxygène comme l’état III respiration. Calculez le rapport de contrôle respiratoire tel qu’il est décrit dans le protocole textuel. Ensuite, aspirez toutes les solutions hors de la chambre de respiration.Rincer la chambre plusieurs fois à l’eau doublement déionisée. Tout d’abord, préparer une solution de 80 nanogrammes par millilitre de nigénicine dans l’éthanol limitant la quantité d’éthanol ajoutée à moins d’un microlitre. En outre, préparer une solution de huit microgrammes par oligomycine millilitre dans l’éthanol.Après avoir soigneusement rinçant la chambre avec de l’eau doublement déionisée, placez un millilitre du support de consommation d’oxygène dans la chambre de respiration et remuez vigoureusement avec une barre magnétique. Ajouter 0,35 milligramme de protéine mitochondriale à la chambre respiratoire. Ajouter une électrode sensible au triphenylphosphonium méthyle à la configuration de la chambre en s’assurant que l’autre extrémité est correctement reliée à un compteur de pH.Ajouter 1,25 microlitres d’une solution de rotenone de quatre millimolaires pour inhiber le complexe I.Enregistrer la respiration pendant deux à cinq minutes. Enregistrez la valeur de consommation d’oxygène lorsqu’elle devient constante. Ensuite, ajoutez 0,56 microlitres d’une solution oligomycine pour inhiber l’utilisation d’ADP.Enregistrez la respiration pendant environ deux à cinq minutes. Enregistrez la valeur de consommation d’oxygène lorsqu’elle devient constante. Ajoutez ensuite 0,112 microlitres d’une solution nigérienne de 80 nanogrammes par millilitre pour abolir le gradient de pH à travers la membrane interne mitochondriale.Enregistrez la respiration pendant deux à cinq minutes et notez la valeur de consommation d’oxygène lorsqu’elle devient constante. Ajouter cinq microlitres de solution de triphenylphosphonium méthyle millimolaire à l’incubation mitochondriale pour commencer à préparer une courbe standard. Répétez cet ajout quatre fois de plus jusqu’à une concentration totale de 2,5.micromolaire a été ajouté. Après cela, ajouter cinq microlitres d’une solution de succinate molaire à la chambre pour initier la respiration. Enregistrez la respiration jusqu’à ce qu’une trace stable soit atteinte.Ajoutez ensuite du malonate pour titrer le système tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Dans cette étude, la cinétique de fuite de RCR et de proton sont mesurées dans le lait des vaches laitières holstein 70 jours après que les vaches laitières aient été alimentées avec différents niveaux de cuivre, de zinc, et de manganèse pendant 28 jours. La respiration de l’état IV est considérée comme la plus élevée chez les vaches étant donné les faibles niveaux de manganèse, mais elle est la plus faible chez les vaches de contrôle, ce qui indique que le manganèse joue un rôle important dans la réduction de la respiration dépendante des fuites de protons.L’analyse de la respiration hépatique dépendante des fuites de protons révèle que cette respiration est la plus grande chez les vaches traitées avec un faible manganèse, et la plus faible chez les vaches sous contrôle. Ces résultats confirment que le groupe de manganèse bas a la respiration iv d’état le plus grand tandis que le groupe témoin a le plus bas. Bien que l’efficacité des aliments pour animaux soit plus élevée chez les bouvillons Angus nés de taureaux RFI bas que chez les taureaux RFI élevés, cela ne s’est pas reflété dans le RCR mitochondrial ou la cinétique des fuites de protons.Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de garder tous les flacons et les bechers sur la glace tout en traitant les mitochondries. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la nutrition laitière pour explorer le rôle de l’efficacité des mitochondries dans l’efficacité des aliments pour animaux et la fonction mitochondriale dans le foie. N’oubliez pas que le travail avec la rotenone peut être dangereux, et des précautions telles que le port de gants, la protection oculaire et l’EPI approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Source:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros InstrumentsCette vidéo explique comment le flux d’oxygène est utilisé pour évaluer la respiration mitochondriale dans les cellules de mammifères vivantes et perméabilisées. Il démontre l’utilisation séquentielle de la digitonine, des substrats métaboliques, de l’ADP, d’un découpleur et d’un inhibiteur pour caractériser différents états respiratoires. Le profil de flux d’oxygène qui en résulte révèle la fonction...

Mesures du flux d’oxygène pour évaluer la respiration mitochondriale dans les cellules vivantes et perméabilisées

Les méthodes présentées fournissent des instructions étape par étape pour la réalisation d’une collection de tests respiratoires basés sur des microplaques utilisant des mitochondries isolées à partir de quantités minimales de muscle squelettique de souris. Ces tests sont capables de mesurer les changements/adaptations mécanistes de la consommation d’oxygène mitochondrial dans un modèle animal couramment utilisé.

Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Haute résolution de respirométrie est utilisé pour déterminer la consommation d'oxygène des mitochondries. Cette technique est simple de déterminer les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale »(I-IV) de la fréquence respiratoire, la capacité maximale du système de transport d'électrons mitochondriale, et l'intégrité de la membrane externe mitochondriale.

Haute résolution Respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale dans perméabilisées et des cellules intactes

Dans cet article, on décrit une méthode pour mesurer la consommation d’oxygène à l’aide de respirométrie haute résolution en thoraxes perméabilisées de drosophile. Cette technique nécessite une quantité minimale de tissu par rapport à la technique d’isolement mitochondrial classique et les résultats obtenus sont plus physiologiquement pertinents.

Mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale dans les fibres perméabilisées de la drosophile à l’aide de petites quantités de tissu

Nous avons conçu et construit un laboratoire mobile pour mesurer les taux de respiration dans les mitochondries isolées d’animaux sauvages capturés sur le terrain. Nous décrivons ici la conception et l’aménagement d’un laboratoire mitochondrial mobile et les protocoles de laboratoire associés.

Développement d’un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale pour la mesure de l’énergétique mitochondriale sur le terrain

La respirométrie à haute résolution couplée à des capteurs de fluorescence détermine la consommation mitochondriale d’oxygène et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le présent protocole décrit une technique pour évaluer la fréquence respiratoire mitochondriale et la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé.

Évaluation de la fonction mitochondriale dans le nerf sciatique par respirométrie à haute résolution

Nous décrivons des protocoles par étapes mesurant la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines et des cellules HL60 à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

Mesure en temps réel du profil bioénergétique mitochondrial des neutrophiles

Les chevaux ont une capacité d’exercice aérobique exceptionnelle, faisant du muscle squelettique équin un tissu important pour l’étude de la physiologie de l’exercice équin ainsi que de la physiologie mitochondriale des mammifères. Cet article décrit des techniques pour l’évaluation complète de la fonction mitochondriale dans le muscle squelettique équin.

Fluoro-respirométrie à haute résolution du muscle squelettique équin

Ici, nous présentons une compilation de tests pour mesurer directement la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères indépendamment de leur capacité à consommer de l’oxygène moléculaire.

Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

Ici, nous décrivons une méthode complète pour mesurer la phosphorylation oxydative mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques perméabilisées fraîches à partir de muscles humains ou de souris. Cette méthode permet de quantifier en temps réel la respiration mitochondriale et d’évaluer la préférence pour le carburant et la flexibilité métabolique tout en préservant les réseaux mitochondriaux existants et l’intégrité de la membrane.

Mesure de la respiration mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques humaines et murines par respirométrie à haute résolution

Apprenez à mesurer la consommation d'oxygène mitochondriale et la cinétique de fuite de protons dans le foie de vaches laitières Holstein. Cette méthode directe évalue l'efficacité énergétique mitochondriale.

Mesure d’oxygéne mitochondries du foie et la cinétique de fuite Proton pour estimer la Respiration mitochondriale chez les vaches laitières Holstein (Vidéo) | JoVE Journal

Mesure d’oxygéne mitochondries du foie et la cinétique de fuite Proton pour estimer la Respiration mitochondriale chez les vaches laitières Holstein

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