Raman exaltée de surface résonance diffusion Nanoprobe Ratiometry pour détecter le Cancer de l’ovaire microscopique par l’intermédiaire de récepteurs de l’acide folique ciblage

Cette méthode emploie l’application topique des nanoparticules aux tumeurs microscopiques d’image, particulièrement dans les malignités qui n’ont pas encore accès à la vascularature, telle que la métastase du cancer ovarien. Cette technique est ratiométrique, l’imagerie ciblée et non ciblée nanoparticules dans un seul scan pour diminuer les faux signaux et révéler l’étendue réelle de la tumeur. Ces nanoparticules peuvent être administrées par injection intrapénitale ou intraveineuse pour l’imagerie de haute précision du cancer de l’ovaire et de nombreux autres types de tumeurs.

Pour la synthèse du noyau nanostar d’or placer une fiole conique contenant 800 millilitres de solution d’acide ascorbique fraîchement préparé sur une plaque magnétique à remuer à quatre degrés Celsius et induire un vortex régulier. Ajouter rapidement huit millilitres de solution d’acide tetrachloroaurique fraîchement préparée au vortex. En quelques secondes, des nanostars se formeront et la solution prendra une couleur bleu foncé.

Verser la suspension nanostar dans des tubes coniques de 50 millilitres pour centrifugation et aspirer tous les microlitres de supernatant sauf les 200 derniers à partir de chaque tube à la fin de la vrille. Utilisez une micropipette pour réutiliser les nanoparticules dans chaque tube avant de mettre en commun toutes les nanoparticules dans une seule cassette de dialyse. Puis dialyser les nanoparticules pendant au moins trois jours contre deux litres d’eau déionisée changeant l’eau quotidiennement.

Pour la formation de la coquille de silice, ajoutez d’abord 10 millilitres d’isopropanol, 500 microlitres de TEOS, 200 microlitres d’eau déionisée, et 60 microlitres de colorant à un tube conique de 50 millilitres. Et ajouter trois millilitres d’éthanol, et 200 microlitres d’hydroxyde d’ammonium à un tube de 15 millilitres. Ensuite, soniquez les nanostars dialysées pour disperser les grappes et ajouter 1,2 millilitres de nanoétoiles au tube.

Placez le tube de 50 millilitres sur un mélangeur vortex et induisez un vortex régulier. Ajoutez rapidement la solution nanostar au tube de 50 millilitres avec environ cinq secondes de mélange de plus avant de transférer rapidement le tube dans un shaker pendant 15 minutes à 300 rPM à température ambiante. Les deux tubes doivent être combinés rapidement et sous nixing constant pour s’assurer que la réaction de silication se produit sur les nanostars et pour minimiser la production libre de silice.

À la fin de l’incubation, remplir le tube d’éthanol pour étancher la réaction et recueillir les nanoétoiles par centrifugation. Aspirez tout sauf les 500 derniers microlitres de supernatant en prenant soin de ne pas déranger la pastille et de resuspendre les nanoparticules dans un millilitre d’éthanol frais. Ensuite, transférez la solution dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre pour quatre lavages d’éthanol d’un millilitre par centrifugation, en réutilisant la pastille par ultrasons pendant environ une seconde entre chaque lavage.

Pour introduire les thiols sur les surfaces des particules, après le dernier lavage, resuspendez la pastille en un millilitre d’un éthanol à 85 %, 10 % 3 mercaptopropyl-trimethoxysilane et 5 % de solution d’eau déionisée pour une incubation d’une à deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les nanoparticules fonctionnalisées au thiol par centrifugation comme indiqué, en réutilisant la pastille par ultrasons entre les lavages. Pour l’anticorps fonctionnalisé anti-folate récepteur nanoprobes réagissent 200 microgrammes d’anticorps anti-folate proétatine liaison avec dix fois plus molaire excès de PEG cross-linker dans 500 microlitres de tampon HEPES.

Après 30 minutes, concentrez l’anticorps par centrifugation dans un filtre centrifuge, récupérant l’anticorps en inversant le filtre dans un nouveau tube pour une centrifugation supplémentaire. Mélanger ensuite les nanoparticules fonctionnalisées au thiol avec l’anticorps concentré et incuber le mélange pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Pour former des nanoprobes non ciblés ajouter cinq milligrammes de méthoxy-terminé PEG 5000 maleimide dissous dans DMSO aux nanoparticules thiol-fonctionnalisées dans 500 microlitres de tampon HEPES pour une incubation d’au moins 30 minutes à température ambiante.

Pour l’injection de nanoprobe spin vers le bas à la fois les saveurs nanoprobe et de résuspendre les granulés dans le tampon mes frais à une concentration de 600 picomolaires. Mélanger les nanoparticules et charger un millilitre de la solution résultante en une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26 par souris et injecter intraperitoneally tout le volume dans l’abdomen de chaque souris. Puis masser doucement l’abdomen pour distribuer les nanoparticules dans toute la cavité péritonéale.

Après au moins 25 minutes fixer les membres d’un animal euthanasié injecté sur une plate-forme chirurgicale et utiliser des forceps dentelés et des ciseaux de dissection pour enlever la peau pour exposer le péritoine. Incise le péritoine. Fixez les volets péritonéaux à la plate-forme et lavez l’intérieur de la cavité péritonéale avec au moins 60 millilitres de PBS.

Ensuite, transférez la plate-forme à un spectrophotomètre Raman avec une configuration optique verticale et un stade motorisé et l’image de l’abdomen sous les paramètres d’imagerie appropriés. Ceci est crucial que le plan focal pour le balayage raman est à la surface de la plupart des viscères. Si les organes sont hors plan, le signal acquis ne sera pas utile.

À des fins de contrôle de la qualité, les nanoparticules peuvent être caractérisées à l’aide d’une variété de méthodes au cours du processus de synthèse, y compris la microscopie électronique de transmission, la diffusion dynamique de la lumière, l’analyse du suivi des nanoparticules et la spectroscopie absorbante visible ultraviolette. Les mesures de Raman révèlent la présence des spectres uniques de chaque saveur de nanoparticule tout au long de la synthèse. Les rendements et les concentrations de réaction typiques dépendent fortement de la technique de pipetage pendant les étapes de lavage.

Les spectres Raman peuvent être traités pour éliminer la fluorescence et normalisés en zone unitaire pour compenser la force du signal avant d’appliquer les moins carrés classiques. Bien que les scores classiques les moins carrés sur chaque spectre de référence nanoprobe ne fournissent pas individuellement les emplacements spécifiques des tumeurs, les rapports point-sage révèlent la présence de la propagation microscopique disséminée. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de valider les nanoparticules à chaque étape de la synthèse que la qualité des nanoparticules affecte fortement les résultats finaux.

Cette technique démontre le potentiel pour les chercheurs d’utiliser des nanoprobes SERRS pour la détection de marqueurs tumoraux dans des modèles animaux et des tissus patients excisés avec un degré élevé de précision microscopique.